毕赤酵母 (Pichia pastoris) 是单细胞真核生物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快和便于基因工程操作等特性,同时又具有真核生物对基因产物正确折叠及翻译后加工及修饰能力,所以毕赤酵母常用于表达外源蛋白^[1]。毕赤酵母表达系统已开发出强有力的基因启动子,可对外源基因进行高水平表达; 外源基因通过同源重组整合到宿主基因组上,工程菌株遗传稳定性好; 重组蛋白可分泌表达,而内源蛋白极少分泌,重组蛋白分离纯化非常方便; 毕赤酵母已有成熟的高密度发酵技术,便于外源蛋白的工业化生产; 工程菌发酵可采用基础盐培养基,价格低廉; 同时大量研究实例证明,毕赤酵母分泌表达的重组蛋白可以较好地保持原有的生物学特性,如神经介肽U亚型II受体^[2]、白介素-Ⅱ^[3]、单链Fv抗体^[4]、人干扰素-α2b^[5]等。此外该系统表达的一些外源蛋白已被成功应用于临床,如毕赤酵母表达的蛋白药物Kalbitor (ecallantide),已通过美国FDA批准,用于治疗遗传性血管性水肿^[6]。因此,利用毕赤酵母表达系统表达外源蛋白越来越普遍。

影响毕赤酵母高效表达重组蛋白的因素很多,本文主要从分子水平上对影响因素进行总结分析,其中包括基因拷贝数、密码子偏爱性、启动子、分子伴侣、信号肽和糖基化修饰等因素,并对发酵工艺进行概述。

基因拷贝数是毕赤酵母表达重组蛋白的一个影响因素。在一定范围内增加毕赤酵母中外源基因的拷贝数有利于重组蛋白的表达^[7]。Vassileva等^[8]用毕赤酵母表达乙肝表面抗原 (HBsAg) 时发现,转入高拷贝HBsAg基因比转入单拷贝时重组HBsAg的产量 提高4倍以上。但有时过高的外源基因拷贝数也会造成代谢负荷增加,进而对宿主细胞产生负面影响,使细胞活力下降^[9]。Zhu等^[10]通过研究猪胰岛素基因拷贝数对毕赤酵母宿主细胞的影响发现,当拷贝数为 6时,酵母细胞的生长状态良好,但拷贝数增加到18时,细胞生长状态异常,可能是因为该基因mRNA量增多从而加大了细胞中内质网折叠蛋白的压力,使细胞不能正常生长。此外,表达的目的基因不同,对于基因拷贝数的最佳选择也不相同。因此,在进行实验设计时要对转入不同拷贝数基因的菌株进行比较,才能确定最佳外源基因拷贝数。

含高拷贝外源基因工程菌株的构建有不同的方法。Lee等^[11]应用Bgl II Brick方法将目的基因表达盒用同尾酶 (Bgl II和BamH I) 连接在一起,构建成含多拷贝表达盒的重组表达质粒,将其转入并使其整合到宿主菌株基因组中,从而得到含高拷贝外源基因的转化子。Marx等^[12]通过将含人血清白蛋白基因和人类超氧化物歧化酶基因的载体整合到rDNA,通过增加博来霉素浓度反复筛选,最终得到含高拷贝外源基因的工程菌株。

密码子偏爱性是影响基因表达的重要因素。对于同义密码子而言,不同物种的使用频率有很大差别,因此出现了所谓的密码子偏爱性。外源基因尤其是来自较远物种的基因在宿主中的表达会受到一定的影响,通过对外源基因的密码子进行优化可以提高其表达水平^[13]。那些在同一物种中被频繁利用的密码子称为该物种的偏爱密码子; 不被经常利用的密码子称为稀有密码子。进行基因合成时一般使用偏爱 密码子并避免使用稀有密码子,基因的这种重新设计被称为密码子优化。Woo等^[14]研究发现抗人T细胞免疫毒素原始基因序列不能在毕赤酵母中表达,但对其进行基因优化后,抗人T细胞免疫毒素可以得到有效表达,分析其原因可能是AT富含区使其转录提前终止,通过密码子优化将该基因AT富含区去除后,其在摇瓶发酵水平的表达量能达到10 mg·L^-1。Hu等^[15]研究抗-ErbB2单链抗体在毕赤酵母中表达 时,发现其产量很低 (1～2 mg·L^-1),但对其进行密码子优化且使其GC含量保持相对较低水平之后,其表达量提高了3～5倍,产量达到6～10 mg·L^-1。Huang等^[16]通过将1,3-1,4-β-D-葡聚糖酶基因去除AT富含区和GC含量调整至48%～49% 进行密码子优化,使重组酶产量提高两倍,达到3 g·L^-1。上述研究表明,通过选用毕赤酵母偏爱密码子和对基因GC含量进行调整,毕赤酵母中的重组蛋白表达量均可能得到有效提高。

醇氧化酶基因启动子 (pAOX) 是毕赤酵母表达外源蛋白最常用的启动子。pAOX作为强启动子,可以通过改变碳源严格控制外源基因的表达,因此适合于表达毒性或有害的外源蛋白。在pAOX控制下有些外源蛋白在毕赤酵母中表达量很大,最高水平可达15 g·L^{-1 [17]}。但其也有不足之处,毕赤酵母在不受抑制的条件下细胞先生长至高密度,然后通过甲醇诱导启动外源蛋白表达,这增加了工程菌的培养时间和工作量。同时在大规模生产过程中,甲醇的使用也存在诸多弊端,如易挥发、浓度不易检测、有潜在的火灾隐患、具有毒性、不适于药品和食品蛋白的生产等^[18]。正是由于pAOX存在上述缺点 ,人们开始研究其他启动子。

尽管pAOX和pGAP作为强启动子可使外源基因在毕赤酵母中有很强的表达水平,但有时也不利于外源蛋白的生产,因为过量表达有时会导致蛋白折叠与定位错误,此时较弱启动子更为可取。Ruth 等^[19]在研究pAOX突变体过程中发现,在弱的突变型启动子控制下毕赤酵母表达猪胰蛋白酶比用野生型启动子时的产量提高10倍以上。因此,在选择启动子时,必须依据研究目的和外源蛋白的性质来选择最合适的启动子,有时并不是启动子越强越好,合理选择与设计启动子是提高外源蛋白产量的有效途径。表 1为毕赤酵母常用的启动子。

表 1(Table 1)

Table 1 Promoters of Pichia pastoris genes used for heterologous protein expression Promoter Regulation Expression level Reference pAOX1 Induced by methanol Strong (about 30% of total protein) [20] pAOX2 Induced by methanol 5%-10% of pAOX 1 [21] pDAS Induced by methanol Strong (similar to pAOX1) [22] pFLD1 Induced by methanol or methylamine Strong (similar to pAOX1) [23] pGAP Constitutive Strong (similar to pAOX1) [24] pENO1 Constitutive 20%-70% of pGAP [25] pGPM1 Constitutive 15%-40% of pGAP [25] pHSP82 Constitutive 10%-40% of pGAP [25] pKAR2 Constitutive 10%-70% of pGAP [25] pSSA4 Constitutive 10%-25% of pGAP [25] pTPI1 Constitutive 10%-80% of pGAP [25]

Table 1 Promoters of Pichia pastoris genes used for heterologous protein expression

分子伴侣是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白,其功能是在细胞内帮助其他蛋白完成正确的组装但不参与这些蛋白所行使的功能,在组装完成后即与之分离。毕赤酵母分泌途径的限速步骤包括蛋白从内质网运输到到高尔基体,其中内质网主要负责蛋白二硫键形成和蛋白折叠,分子伴侣参与蛋白折叠过程。在内质网上的新生肽还可以通过与分子伴侣相互作用来维持其可溶形式^[26]。内质网上的分子伴侣主要包括蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)、人免疫球蛋白结合蛋白 (human immunoglobulin binding protein,BIP)、钙网蛋白和钙联接蛋白。其中的PDI是硫氧化还原蛋白超家族之一,它是催化二硫键形成和帮助蛋白正确折叠的多功能蛋白; BIP主要通过结合到疏水性氨基酸延伸端来稳定未成熟的蛋白^[27]。由于分子伴侣在蛋白折叠中起着重要作用,内质网上的分子伴侣通过操纵转录因子的水平,改善毕赤酵母的蛋白分泌。大量研究报道,分子伴侣与靶基因共表达可显著提高靶蛋白的表达量。Sha等^[28]研究发现当5个拷贝的酯酶基因与1个拷贝的伴侣分子PDI基因在毕赤酵母中共表达时,由于PDI基因的引入使酯酶的表达量提高了2.74倍。Damasceno等^[29]通过将单链抗体片段 (A33scFv) 与毕赤酵母的BIP共表达,使重组A33scFv表达量提高了3倍。而A33scFv与毕赤酵母的PDI共表达并没有提高表达水平,这可能是由于A33scFv对分子伴侣有偏好性。Guerfal等^[30]将小鼠白细胞介素10 (mouse interleukin-10,MIL-10) 基因与HAC1p基因在毕赤酵母中共表达,与单独表达MIL-10相比,重组蛋白表达量提高了2.2倍。上述研究表明,通过操纵参与蛋白折叠的分子伴侣可以提高重组蛋白在毕赤酵母中的表达水平。

在毕赤酵母中重组蛋白分泌到胞外必须经过信号肽的引导。由于信号肽与目的蛋白融合表达,从而使目的蛋白在加工折叠后被引导分泌到胞外^[31]。常用的酵母信号肽有α交配因子信号肽 (MF-α)、酸性磷酸脂酶信号肽 (PHO1)、蔗糖酶信号肽 (SUCZ)、Killer毒素信号肽和菊粉酶信号肽 (INU) 等^[32]。MF-α是毕赤酵母表达重组蛋白时应用最广泛的一种信号肽,最常用的分泌型表达载体pPIC9K和 pPICZα-A的信号肽就是MF-α。MF-α对引导小分子多肽和蛋 白的分泌非常有效,但对于引导大分子蛋白的分泌效果并不明显。近些年,许多研究表明分泌信号肽是影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的重要因素。Murasugi等^[33]通过使用酿酒酵母的MF-α信号肽、自身信号 肽和PHO1信号肽在毕赤酵母中表达人的中期因子蛋白,发现MF-α信号肽引导的蛋白表达量最高,产量可达28 mg·L^-1。G hosalkar等^[34]研究了3种不同信号肽对重组干扰素-α2b蛋白分泌的影响,发现自身信号肽没有引导分泌出目的蛋白,而MF-α和进行改造过的MF-α均引导分泌了目的蛋白,其表达量也基本一致。Xiong等^[35]通过在MF-α序列的N端引入10种信号肽,经过比较发现在N端增加A、I、P 3个氨基酸的信号肽序列引导植酸酶在毕赤酵母中分泌表达的效果最好,其表达量是野生型的6倍,可达 90 mg·L^-1。上述研究表明,采取有效的优化策略对信号肽进行调节和改造,可以促进重组蛋白在毕赤酵母中的大量分泌。

糖基化修饰是最重要的一种蛋白翻译后修饰。糖基化在参与免疫防御、受精、病毒复制、寄生虫感染、细胞生长和炎症等过程中起着重要作用。在真核生 物中,糖基化过程中加入的糖种类有显著差异。哺乳动物O-连接的寡糖主要是唾液酸、半乳糖和N-乙酰半乳糖胺,毕赤酵母O-连接寡糖只是甘露糖残基^[36]。由于毕赤酵母特异性高度甘露糖基化的存在,通常会使重组药物因为缺乏唾液酸糖基而被从血液中快速清除。Vervecken等^[37]对毕赤酵母糖基化进行N糖基化改造,对毕赤酵母中甘露糖基化第一个基因OCH1灭活,同时过表达驻留在内质网上的α-1,2-甘露糖苷酶和驻留在高尔基体上的N-乙酰葡糖胺基转移酶I和β-1,4-半乳糖转移酶,通过改造可使毕赤酵母产生复合型N端糖蛋白。Li等^[38] 通过糖基化工程改造毕赤酵母,使其可以生产具有抗体介导效应功能人源化的IgGs,并建立了利用糖基化工程使毕赤酵母生产重组人源糖基化抗体的平台,从而使毕赤酵母作为一种应用于临床的治疗性蛋白的表达载体日益受到关注。也有研究证明,通过对外源蛋白的糖基化位点进行改造,可以提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达。Liu等^[39]在毕赤酵母中表达米根霉脂肪酶时,对其存在的3个糖基化位点进行了突变,产生的去糖基化蛋白的活性比其野生蛋白活性高两倍。Han等^[40]通过定点突变在重组弹性蛋白酶的I38T、A69T和N266T位处引入新的糖基化位点,发现I38T突变体在水性介质中能更有效地水解酪蛋白,显示出较高的比活力和较低的K_m值,从而改善了重组弹性蛋白酶在工业中的应用潜力。上述研究表明,通过对糖基化位点进行改造或引入新的糖基化位点可提高分泌蛋白在毕赤酵母中的表达量及重组蛋白活性。

高密度发酵是提高毕赤酵母重组蛋白表达量的一种重要策略。毕赤酵母表达外源蛋白时,温度、pH、碳源、溶氧等培养条件对目的蛋白的完整性及产量 都有较大的影响,优化培养条件可有效提高外源蛋白的表达量。对培养基的优化主要包括碳源的优化、氮源的优化、基础盐和PTM1微量盐的优化。Vellanki等^[41]通过优化营养需要的种类、数量及pH等,使 重组链激酶在毕赤酵母中的表达量提高了95%。Niu等^[42]在毕赤酵母中表达外源蛋白β-半乳糖苷酶,在发酵过程中发现,采用山梨醇和甲醇混合补料的方式,可以降低酵母细胞的耗氧量,从而减少热量的产生,提高了毕赤酵母的生物量,重组β-半乳糖苷酶产量提高了40%。Hu等^[43]在毕赤酵母中表达氨基酸腺苷转移酶时,通过对碳源合理组合,发现诱导期间添加甘油能有效提高发酵液中氧的饱和度,加快醇氧化酶的诱导及细胞代谢的适应,从而促进细胞的生长及目的产物的积累。甲醇利用型毕赤酵母发酵分 为两个 阶段,第一阶段是细胞生长,第二阶段是甲醇诱导蛋白表达。大量研究证明,甲醇浓度对目的蛋白的表 达起着重要作用,Wu等^[44]研究毕赤酵母表达重组人复合α干扰素 (human interferon alfacon-1,cIFN) 时,分析了不同甲醇诱导浓度对cIFN分离纯化得率的影响。在5 L罐中采用0.25%、0.50% 和0.75% (W/V) 3个甲醇浓度诱导时发现,在0.75%高甲醇浓度诱导下,cIFN表达水平最高,达到2.06 g·L^-1,是0.25% 低甲醇浓度诱导时表达量的1.24倍,但是 低甲醇浓度诱导下cIFN分离纯化得率却高于高甲醇诱导浓度下3.75倍。毕赤酵母可以在较宽泛的pH 范围内表达外源蛋白,因此可以通过调节pH值提高外源蛋白的产量。Lee等^[45]通过对产冰结合蛋白毕赤酵母工程菌进行补料分批培养工艺优化时,发现表达该蛋白的培养基最适pH 6.0。而Kong等^[46]通过毕赤酵母高密度发酵表达重组人抑瘤素M时,确定培养基的最适pH 5.0。同时诱导期间的温度也对外源  ; 蛋白的表达或活性也有一定的影响。Zhang等^[47]采用5 L的生物反应器分别在29 ℃和25 ℃温度下对产菌丝霉素衍生肽的工程菌进行发酵,发现在诱导96 h后重组蛋白产量分别为860 mg·L^-1和1 309 mg·L^-1。总之,通过调节一种或综合调节多种发酵条件可显著提高重组蛋白的表达水平。

毕赤酵母作为一种表达外源基因的宿主菌,既具有操作简单、生长速度快等特点,又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统,且对营养要求低,可采用廉价的培养基,并适合于高密度发酵,因此被广泛应用于重组蛋白表达,成为最具吸引力的重组蛋白生产平台。但不同蛋白表达水平存在很大差异,为提高外源蛋白的产量及活性,需要对基因拷贝数、密码子偏爱性、启动子、分子伴侣、信号肽、糖基化修饰和发酵工艺等各方面因素综合考虑进行优化。然而,毕赤酵母表达系统也存在一些不足,如高密度发酵偏离细胞的天然生长条件。此外,当蛋白过表达时,许多蛋白产物对宿主细胞的生长存在严重的影响,从而影响蛋白的表达量。因此,通过分子伴侣提高蛋白折叠和分泌已经成为一个趋势。另一趋势是糖基化工程毕赤酵母与人源化重组糖蛋白的糖基化模式相结合,替代哺乳动物细胞表达系统,从而减少生产时间和成本,成为生产临床治疗用蛋白和其他蛋白的常用表达系统。