脂肪性肝病是一种遗传-环境-代谢应激相关因素所致的以肝细胞脂肪变性为主的临床病症,其发病率随着年龄的增长而增加。在我国老年人群中脂 肪肝发病率高达19.8%,女性的发病率明显高于男性,(女性占22.8%,男性占16.0%)^[1,2]。临床上按病因不同将脂肪性肝病分为酒精性脂肪性肝病 (alcoholic fatty liver,ALD) 和非酒精性脂肪性肝病 (nonalcoholic fatty liver,NAFLD),二者病理学改变相似。 ALD的产生是由于长期过量饮酒导致脂类转运或代谢异常。NAFLD则是与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤疾病,患者无过量饮酒史,与肥胖症、2型糖尿病、动脉粥样硬化性心脑血管疾病以及肿瘤等疾病的高发密切相关。组织病理学检查是诊 断脂肪性肝病的金标准,但因其损伤性大、取样局限、费用高昂,不宜用于临床常规检查^[3]。在动物实验中,组织病理学检查给动物带来致命性损伤,只能用于终点实验,严重制约了脂肪性肝病的研究和治疗药物药效的评价。超声波检查作为诊断脂肪性肝 病的一线影像学技术具有无损、安全简便、重复性 好、耐受性强、花费低、应用广泛的优势^[4]。然而,临床上多用定性方法检测肝脏脂肪变性,很难准确地判断病变程度。

本研究应用高分辨率小动物超声成像系统测定并计算小鼠肝脏回声衰减系数,选取正常C57BL/6J小鼠、饮食诱导的轻度脂肪肝HFD小鼠、中重度脂肪肝KKAy小鼠等不同病变程度的NAFLD小鼠模型,对其肝脏回声衰减系数与肝脂含量进行相关性分析,以建立损伤性小、可以动态监测小鼠肝脏脂质堆积程度的半定量评价方法,为脂肪性肝病的研究和治疗药物药效的评价提供可行的实验技术。

选取雄性C57BL/6J小鼠8只,体重13～14 g,生产许可证编号: SCXK (京) 2009-0004,以高脂饲料 (饲料编号: D12492) 诱导29周,作为轻度脂肪肝模型组 (HFD); 以正常饲料喂养的同批小鼠8只作为正常对照组 (CON)。选取雄性KKAy小鼠8只,体重33～37 g,生产许可证编号: SCXK (京) 2009-0007,以高热能饲料 (饲料编号: 1K65) 诱导29周,作为中重度脂肪肝模型组 (KKAy)。实验动物和饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。实验动物自由进食饮水,饲养于中国医学科学院药物研究所实验动物中心,饲养温度21～22 ℃,湿度40%～60%,每天光照/黑暗时间为12 h/12 h。实验动物经过动物伦理委员会批准,动物使用许可证编号: SYXK (京) 2009-0004。

Visual Sonics Vevo 770高分辨率小动物超声成像系统由加拿大Visual Sonics公司生产。甘油三酯测定试剂盒购自北京中生北控生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯化学试剂。

动物禁食2 h后,腹腔注射0.8% 戊巴比妥钠 (0.1 mL/10 g体重) 进行麻醉。小鼠剑突下至后腿上部脱毛,充分暴露腹部,仰卧位固定于37 ℃恒温板上,将小动物超声成像系统的RMV- 707B探头中心置于小 鼠腋下方体中线左偏1 cm处,探头频率为30 MHz。在对比度为60%,亮度为50%,增益为10 dB的条件下,移动探头至检测到肝左叶门静脉呈3～4分支; 截取横切面图像,在此图像区域内沿超声波传播方向选择2处圆形采集区域 (避开血管、胆管),记录各区域的灰度平均值及2区域中心的距离,计算肝脏回声衰减系数a值。

小鼠处死后,取新鲜肝脏组织固定于4% 多聚甲醛中,用HE染色技术进行组织病理学检查。每张病理切片在光学显微镜下按照Z字型方向随机选取6个视野,各视野无重合。每个视野均由同一人参照文献^[5]以半定量评分方法对肝细胞脂肪变性、气球样变性以及肝小叶炎症程度进行综合评价,计算得到NAFLD活动度积分 (NAFLD activity score,NAS)。每张病理切片的NAFLD活动度积分分数来自6个视野评分的平均值; 各组内所有小鼠平均分为该组的分数。NAFLD活动度积分标准如下: ① 肝细胞脂肪变性: <5%,0分; 5%～33%,1分; 34%～66%,2分; >66%,3分; ② 小叶内炎症 (200倍镜下计数坏死灶): 无,0分; <2个,1分; 2～4个,2分; >4个,3分; ③ 细胞气球样变: 无,0分; 少见,1分; 多见,2分。

用改进后的Folch 脂提取法^[6]测定肝脏甘油三酯含量,具体操作如下: 处死小鼠后,取新鲜肝脏100 mg,用预冷PBS制成10% 匀浆液。离心 (4 ℃、10 000 r·min^-1 ×15 min),取上清液,按1∶6比例加入氯仿 722;甲醇溶液 (2∶1),室温剧烈振荡过夜,以萃取肝匀浆中的脂质。定量吸取氯仿层置于通风厨挥干后,加入异丙醇溶解脂类,用甘油三酯试剂盒测定样品中甘油三酯含量。

实验数据以± s表示。使用SPSS 19.0软件进行统计学分析,组间比较采用t检验; 相关性分析采用Spearman等级相关分析。

病理学分析中HE染色技术被广泛使用,这种技术是通过染液中的碱性成分苏木精将染色质、核糖体染成蓝色,通过酸性成分伊红将细胞基质中的成分染成红色,脂质在病理切片的制作和染色过程中被溶解而显示脂滴状白色区域。显微镜下,CON、HFD、KKAy组小鼠肝脏病理变化如图 1A所示: CON组小鼠肝细胞结构清晰可见,细胞核位于细胞中部,未见明显病变; HFD组小鼠肝细胞细胞核位于细胞中部,核周聚集了大量脂滴,以小型泡沫样变性为主; KKAy组小鼠肝细胞核被挤压到细胞的一侧,细胞内聚集了大量脂滴,以大泡样变性为主。NAS评分显示 (图 1B),HFD组、KKAy组小鼠NAS得分分别较CON组增加了5.2倍、6.4倍; KKAy小鼠的病变程度明显加重,其NAS得分较HFD小鼠增加了21%。以上结果表明,HFD组、KKAy组小鼠肝脏有明显的脂肪变性。

图 1(Figure 1)

Figure 1 Pathological changes of the livers in mice (HE staining). A: Pathological changes of the livers (×200); B: NAFLD activity score. n = 8,± s. ***P < 0.001 vs CON; △△P < 0.01 vs HFD

用改进后的Folch脂提取法测得各组动物肝脏甘油三酯含量,结果如图 2所示,与CON组相比,HFD组、KKAy组小鼠平均肝脏甘油三酯含量分别增加了6.1倍、7.8倍; KKAy小鼠的病变程度明显加重,其平均肝脏甘油三酯含量较HFD组增加了30%。

图 2(Figure 2)

Figure 2 Content of hepatic triglyceride in mice. n = 8,± s. ***P < 0.001 vs CON; △P < 0.05 vs HFD

在肝脏横切面超声影像图中,沿超声波传播方向选取约0.3 mm²的2处圆形灰度采集区域,两处中心距离在1.7 mm左右。因超声波的回声强度以指数形式衰减,回声衰减系数的计算公式:

a= (lnA_n - lnA_f) / (L×F)

其中,A_n、A_f为沿超声波传播方向的近波源、远波源端所采集的不同深度的图像灰度平均值,L为两处圆形灰度采集区域中心的距离 (图 3); F为探头频率^[7]。

图 3(Figure 3)

Figure 3 Ultrasound image in the left lobe of the liver

各组动物肝脏超声回声衰减系数测定结果如图 4所示,CON、HFD、KKAy组的平均a值依次递增。

图 4(Figure 4)

Figure 4 Echo-intensity attenuation coefficient in mice. n = 8,± s. **P < 0.05,***P < 0.001 vs CON

与CON组相比,HFD组、KKAy组小鼠平均a值分别增大了3.1倍和3.5倍。

以小鼠肝脏甘油三酯含量为x值,以回声衰减系数a为y值,采用Spearman等级相关分析法分析二者的相关性,结果可见 (图 5),CON组各点主要集中在图的左下方,KKAy组各点主要集中在图的右上方,HFD组各点较分散,多介于CON组和KKAy组之间。相关性分析表明,小鼠肝脏甘油三酯含量和回声衰减系数a值具有良好的正相关性,相关系数r = 0.744,P < 0.01。

图 5(Figure 5)

Figure 5 Correlation between the echo-intensity attenuation coefficient and the content of hepatic triglyceride. n = 24

脂肪肝是由多种病因引起的肝脏脂肪性病变,正常肝脏含脂量为2%～4%,当肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5% 或组织学上每单位面积见30% 以上肝细胞脂变时称为脂肪肝^[8]。目前,肝脏的组织病理学检查是评价肝脏脂肪样病变程度的金标准。肝脏甘油三酯含量是反映动物脂肪样病变程度的一个重要指标,肝脏甘油三酯含量越高,病理检查上脂肪变性越严重,NAFLD活动度积分也会越高。对动物而言,尤其是小鼠,因其体型小、对外界损伤恢复差,肝脏的组织病理学检查和肝脏甘油三酯含量的测定只能在终点实验时进行。因此,如何监测活体动物的脂肪肝病变程度以及评价药物改善肝脏脂质堆积的效果,成为脂肪肝相关研究的瓶颈问题。

影像学检查是目前临床诊断脂肪肝的一线方法。临床影像学检查手段主要包括核磁共振波谱 (MRS)、计算机断层扫描 (CT) 和B型超声波检测。其中,MRS法与肝脂含量的相关性较好^[9]。由于检测价格昂贵以及针对小动物的检测仪器并不普遍,MRS和CT均不能广泛用于小动物肝脏脂肪性病变的检测。超声波检测则因其特有的优势在临床及临床前的脂肪肝检测中广为应用。肝细胞内脂质堆积会导致超声波在肝脏中传播的均匀度、阻抗情况发生变化,超声波能量吸收明显增加,并产生散射作用,肝脏近场回声弥漫性增强,远场回声逐渐减弱,在声像图上呈现“明亮肝”。目前国内外采用超声影像来半定量反映肝脏脂肪堆积的常用方法有超声直方图法、超声肝肾指数评估法、超声半定量评分系统法以及回声衰减系数法。超声直方图法对取样部位的最大频数灰度值、灰度离散度进行数字化定量分析,虽能直接定量给出反映脂肪变性程度的数据,但数据本身受仪器、测定部位的影响较大。超声肝肾指数评估法是在超声B模式下对肝脏和肾脏图像灰度程度进行比对,以肝肾比值或差值评价肝脏脂肪堆积的程度,该方法默认了受试者的肾脏健康,这大大降低了该方法的准确性。超声半定量评分系统是根据超声影像明亮度、清晰 度建立的对肝内血管边界清晰程度、肝实质回声强 度等多因素进行综合评估后给以相应分数反映肝脂堆积程度的方法,这种方法不仅要求仪器具有高分辨率,而且对操作者的经验和技术熟练程度要求较高^{[10,11,12,13,14]}。回声衰减系数法根据超声波在组织内的传播规律,检测一段距离中回声强度的变化,这种变化反映在超声图像上表现为灰度的变化,通过单位距离内灰度变化情况计算得到回声衰减系数a值可以反映肝脂堆积情况。

本研究采用回声衰减系数法来反映不同小鼠肝脏病变程度,以肝实质为研究对象,以肝脏自身为参照物,实验结果不受采集部位的深度和超声回声绝对值的影响,可信度强,且操作简便,不易受实验操作者主观因素影响。虽然临床观察显示回声衰减系数a值与MRS法测定的肝脂含量具有较好的相关性^[7],但是,尚未见回声衰减系数a值与肝脏脂质堆积程度相关性的直接实验证据,也未见该方法应用于动物实验的报道。本研究采用高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠形成以肝细胞泡沫样脂肪变性为主的非酒精性脂肪肝HFD小鼠模型,为NAFLD的早期病变。给予经典的自发性2型糖尿病KKAy小鼠高热能饮食刺激,加重其肝脏的脂肪性病变,形成以大泡样脂肪变性为主的KKAy小鼠模型。组织病理学和肝脏甘油三酯含量检测均显示,KKAy小鼠模型肝脏的脂质堆积程度明显高于HFD小鼠模型。研究中采用高分辨率小动物超声成像系统测定的回声衰减系数a值与其肝脏甘油三酯含量的相关系数r = 0.744,表明回声衰减系数法可以客观反映肝脏甘油三酯的堆积情况。该方法将影像数据化,评价更客观,且具有无创性、重复性好、耗时短、安全、耐受性强、花费低、可广泛应用的优点,此方法的建立为无创评价小动物脂肪性肝病奠定了实验基础。