2014, Vol. 49
慢性肝病是威胁全球人类健康的一个重要问题, 每年死于慢性肝病的人数接近80万[1]。急慢性肝损伤都会导致肝纤维化 (liver fibrosis) 的产生, 肝纤维化是肝脏内弥漫性细胞外基质 (extracellular matrix, ECM), 特别是I型胶原α1过度沉积的病理过程。它是机体对肝损伤的一种修复反应, 是各种慢性肝病的共有病理改变。肝纤维化的进一步发展会导致肝硬化、肝功能衰竭及门脉高压, 并最终需要肝移植来延续生命[1, 2]。
肝损伤产生的多种刺激因素导致肝纤维化的形成, 包括氧化应激反应、组织缺氧、炎症及免疫反应等[3]。肝纤维化形成过程中, 多种细胞参与其中, 包括肝星状细胞 (hepatic stellate cells,HSCs)、肝实质细胞、枯否细胞 (kuffer cells,KCs)[4]、肝窦内皮细胞等。肝损伤刺激这些细胞释放各种促纤维化细胞因 子, 包括转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)、血小板衍生因子 (platelet-derived growth factor,PDGF)、结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor, CTGF) 和血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF) 等细胞因子。这些细胞因子又进一步促进HSCs的激活和增殖, 活化的HSCs分泌大量的TGF-β1, 使TGF-β1水平不断升高, 同时分泌大量的纤维化胶原蛋白 (主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白), 导致ECM的过度沉积, 使肝纤维化程度不断加重。
肝纤维化与肝硬化的治疗十分困难, 目前仅有中国批准了两种中药复方——鳖甲软肝片和扶正化瘀片, 其中复方鳖甲软肝片正在进行Ⅳ期临床试验, 而扶正化瘀片已完成Ⅳ期临床试验。除针对病因以 外, 尚无其他药物被批准用于肝纤维化的治疗。新药的研发有赖于不断发现潜在的治疗靶点, 因此寻找抗肝纤维化靶点对于肝纤维化的治疗十分重要, 本文对近期的靶点研究进行综述。 1 TGF-β1与肝纤维化
TGF-β细胞因子具有多功能生物学活性, 能够调节多种细胞的增殖分化、组织损伤修复, 参与上皮间质转化 (epithelial mesenchymal transition,EMT)、胚胎发生以及ECM的合成与沉积。TGF-β1是TGF-β超家族成员之一, 是一组具有多种生物学功能的蛋白多肽, 是目前已知最重要的致纤维化的细胞因子之一, 它主要通过激活HSC、促进ECM的合成以及抑制ECM的降解, 促进纤维化的产生。因此, 能够调节TGF-β1活性和通路的分子, 是重要的抗纤维化靶标。
Liu等[5]发现, 异常的TGF-β1信号在小鼠原发 性胆汁性肝硬化 (primary biliary cirrhosis,PBC) 中起关键作用, TGF-β1在PBC中发挥着双重作用, 虽然它能抑制炎症反应, 但加重了肝纤维化程度。Lee等[6]研究发现, 蜂毒明肽能够通过抑制TGF-β1诱导肝实质细胞的EMT过程, 起到抑制肝纤维化的作用。近期, Fan等[7]利用TGF-β1疫苗明显改善了动 物肝纤维化程度。TGF-β1疫苗抑制了大鼠HSCs中Smad2/3的磷酸化、降低了基质金属蛋白酶抑制剂 (tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMP)-1的蛋白表达, 同时能够改善小鼠的肝损伤程度, 促进肝实质细胞增殖并抑制其凋亡。TGF-β1疫苗有可能为肝纤维化提供新的治疗途径。此外, TGF-β1抑制剂吡非尼酮 (pirfenidone) 已经批准上市治疗特发性肺纤维化, 而它在抗肝纤维化方面的治疗潜力也正在被挖掘出来[8]。 2 TIMP-1与肝纤维化
ECM的沉积是纤维化的发病机制中最重要的特点, 其降解受基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs) 调控。TIMPs是MMPs主要内源性抑制因子, 可以与活化的MMPs不可逆结合, 抑制其对ECM的降解活性, 导致肝纤维化的产生和恶化, 其中TIMP-1在肝纤维化形成过程中起着至关重要的作用。
有多项研究表明, TIMP-1与肝纤维化程度呈正比。大鼠在肝纤维化恢复的第1周, TIMP-1的mRNA水平及Ⅰ型胶原蛋白前体 (procollagen I) 均显著下降[9]。过表达TIMP-1的转基因小鼠, 纤维化程度增加且恢复能力明显减弱[10]。相反, 用MMP-9突变蛋白作为TIMP-1拮抗剂能增加基质降解, 进而抑制肝纤维化[11]。近期研究表明, TIMP-1的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA) 导入大鼠体内后, 降解正常胶原的MMP-13及TGF-β1表达水平明显降低, 活化的HSCs数目也明显减少, 肝纤维化程度得到明显的改善[12]。
TIMP-1在促进肝纤维化产生过程中发挥重要作用, 因此利用一定的手段, 如导入TIMP-1拮抗剂或siRNA-TIMP-1, 使TIMP-1在体内表达水平降低, 肝纤维化便可得到改善。 3 TLR4与肝纤维化
Toll样受体 (Toll-like receptor,TLR) 4属于模 式识别受体, 能够识别不同的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。TLR4不仅在免疫应答的调节过程发挥重要作用, 而且还参与了肝脏等器官的非感染性炎症反应。TLR4的主要配体为脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)。脂 多糖是导致炎症的革兰阴性菌最重要的细胞壁成分, 而纤维化与炎症有着密切的关系。已有研究表明, 肝损伤如慢性肝脏疾病和肝硬化后, 患者血浆中的脂多糖水平明显高于正常人[13]。因此, TLR4和脂多糖系统在肝纤维化发病机制中的重要性逐渐被人们认识, 使其成为未来肝纤维化治疗的可能靶点。
近年来的研究表明, TLR4在肝纤维化的发病机制过程中起到枢纽作用。Chen等[14]在对人类瘢痕研究中, 运用免疫组化、RT-PCR等方法发现瘢痕成纤维细胞TLR4的表达与正常细胞比较明显增加。还有研究表明, TLR4通过促进炎症反应, 进一步刺激纤维化的产生, 通过促进HSCs的活化、HSCs和KCs的相互作用以及增加TGF-β信号通路活性, 增强纤维化程度[15]。Bai等[16]经研究发现, 百里香醌 (thymoquinone) 能够通过抑制HSCs中PI3K和TLR4信号通路的活性, 改善肝纤维化程度。Qian等[17]研究发现, 槐根碱 (sophocarpine) 也能通过抑制TLR4信号通路, 进而抑制肝纤维化。因此可以以TLR4为靶点, 寻找肝纤维化治疗新方法。 4 整合素αV与肝纤维化
TGF-β1是重要的促纤维化细胞因子, 也是很多组织纤维化的核心介质, 它的活化在肝纤维化形成过程中发挥重要作用。TGF-β休眠复合物的晶体结构证明了细胞骨架的机械力以及与整合素的相互作用是激活休眠TGF-β最常见的途径[18]。
整合素是一类异源二聚体跨膜蛋白, 由α亚基和β亚基组成, 它们介导了细胞与ECM之间的相互作用。肌成纤维细胞的体外实验发现包含αV的任意整合素都能激活TGF-β[19], 相关文献研究发现含有αV亚基的一些整合素, 包括αVβ1、αVβ3、αVβ5、αVβ6及αVβ8, 都能够激活休眠TGF-β, 因此整合素αV在组织纤维化中的重要性逐渐被人们认识。
近来有研究证实了整合素αV是很多组织中调节纤维化的核心分子途径, Henderson等[20]用Cre-loxp重组酶系统敲除小鼠体内的整合素αV基因, 发现多个组织的纤维化, 包括肝纤维化、肺纤维化及肾纤维化都得到了明显的改善, 而整体敲除整合素β3、β5和β6以及部分敲除整合素β8的小鼠, 纤维化并无明显改善。此外, 他们还发现整合素αV小分子药理学阻断剂CWHM12能够有效减弱肝纤维化和肺纤维化。该研究表明, 以整合素αV为靶点的小分子药理阻断剂有望成为临床上治疗多种纤维化的新策略。 5 大麻素受体与肝纤维化
内源性大麻素 (endogenous cannabinoids,EC) 及其受体共同构成了内源性大麻素系统。大麻素受体有两种, 大麻素受体1 (cannabinoid receptor type 1,CB1) 和大麻素受体2 (cannabinoid receptor type 2,CB2)。在过去的几年里, 临床及试验研究证明了在慢性肝病发生的过程中, EC参与激活HSCs复杂的信 号通路, 同时促进了ECM的增加[21, 22], 其受体CB1与CB2在该过程中发挥了重要作用。
研究表明, CB1受体有促纤维化作用, 而CB2受体激动剂却表现出相反的抗肝纤维化与抗炎症作用。Teixeira-Clerc等[23]采用CCl4诱导、硫代乙酰胺诱导及胆总管结扎 (bile duct ligation,BDL) 等3种肝纤维化动物模型, 发现CB1受体基因敲除或给予CB1受体阻断剂利莫那班后, 肝纤维化明显得到改善。Chen等[24]发现, CB1的siRNA及其受体阻断剂AM251也对肝纤维化有改善作用, 而且siRNA-CB1的改善作用更明显。阻断CB1受体具有抗肝纤维化作用, 与其降低了激活HSCs的增生与增加其凋亡、同时导致TGFβ-1因子的减少有关。
CB2在纤维化过程表现出与CB1相反的作用。Julien等[25]发现, 激活CB2受体能抑制MFs和HSCs的生长, 同时诱导这些细胞的凋亡。此外, 他们还发现敲除CB2基因的小鼠肝纤维化程度明显增强。Munoz-Luque等[26]利用CB2受体激动剂JWH-133, 发现肝硬化大鼠肝脏中胶原含量降低、炎症减弱, 激活的HSCs数目减少, 肝纤维化症状明显得到改善。
虽然CB1受体的激活能够促进肝纤维化, 而CB2受体选择性激动剂可以改善肝纤维化, 但有文献[27]报道在慢性肝病发展的过程中, CB1的促纤维化作用强于CB2的抗纤维化作用。同时利用CB1受体拮抗剂和CB2受体激动剂, 可能会有更明显的抗纤维化效果。 6 Smad7与肝纤维化
TGF-β在肝纤维化过程中发挥重要作用, 它通过细胞膜上的丝/苏氨酸激酶受体及细胞内Smad蛋白来发挥调控基因表达的功能。Smad蛋白包括膜受体激活Smads (receptor specific Smads,R-Smads, 包括Smad1,2,3,5,8)、通用Smad (a common Smad,Co-Smad, 只有Smad4) 及抑制性Smads (inhibitory Smads,I-Smads, 包括Smad6和Smad7) 等3大类。各种致病因子通过TGF-β1/Smad信号通路促进HSCs的激活及ECM的合成与沉积, 促使肝纤维化的产生。其中Smad7属于I-Smads, 它能直接与TGF-β的Ⅰ型受体结合, 进而阻止Smad2和Smad3的磷酸化, 抑制TGF-β1的信号转导。
Smad7在肝病中的作用已有不少文献报道。有研究表明, Smad7的表观遗传沉默 (包括组蛋白修饰、microRNA及甲基化修饰) 促进了Smad2和Smad3的磷酸化, 导致HSCs的激活, 继而引起肝纤维化的产生[28, 29, 30]。Smad7的高表达能使CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝组织中胶原蛋白减少、TGF-β信号转导减 弱, 使肝损 伤及纤维化都得到改善[31], 而肝脏Smad7基因敲除的小鼠会发生自发性肝功能紊乱, 而且使CCl4和酒精诱导的肝损伤及脂肪病变更加严重[32, 33]。Dooley等[34]发现, Smad7的高表达使HSCs维持在静息状态, 并能阻止维生素A脂滴在HSCs中的丢失, 减少了HSCs中α-SMA与胶原的沉积, 同时抑制了旁分泌及自分泌的TGF-β信号转导, 使得BDL诱导的肝纤维化得到明显改善。
因此, Smad7可以作为一个肝纤维化的治疗靶点。但是有文献显示肝细胞中高表达Smad7可能会导致癌症的发生[35], 针对这个问题, 可以利用细胞或组织特异性启动子来构建重组基因, 将外源性Smad7特异性导入靶细胞HSCs, 发挥其抑制HSCs激活, 进而抑制肝纤维化的作用。 7 AT1R与肝纤维化
肾素-血管紧张素系统 (renin-angiotensin system,RAS) 在调节血压和水钠平衡方面发挥着重要作用。肾素将血液中循环的血管紧张素原水解为血管紧 张素Ⅰ (10肽), 血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转化酶 (angiotensin-converting enzyme,ACE) 作用下, 水解为8肽的血管紧张素Ⅱ。血管紧张素Ⅱ是组织中 RAS主要的具有生物活性的产物, 它主要通过与其两个受体血管紧张素Ⅱ1型受体 (angiotensin-II- type-1 receptor,AT1R) 和血管紧张素Ⅱ2型受体 (angiotensin-II-type-2 receptor,AT2R) 的相互作用而发挥其生物功能。
组织RAS (血管紧张素Ⅱ) 参与在肾、肺及肝 等组织纤维化, 血管紧张素Ⅱ能够直接促使NADPH氧化酶活性增加, 刺激TGF-β1的产生, 同时促进纤维原细胞的增生并分化成分泌胶原的肌成纤维细胞 (myofibroblasts,MFs), 其中AT1R在此过程中发挥主要作用[36, 37, 38]。研究表明, AT1R能够促进HSCs的激活及纤维化的产生。在CCl4及BDL诱导的肝纤维化小鼠模型中, AT1R基因敲除后肝脏炎症及纤维化得到了明显的改善[39]。慢性丙型肝炎 (HCV) 患者长期服用ATIR拮抗剂氯沙坦, 肝纤维化进程得到抑制, 且肝脏中NADPH氧化酶及纤维化基因 (如Ⅰ型胶原蛋白和MMP-2) 的表达水平有所降低[40]。近期, Granzow等[41]发现, AT1R介导的Janus激酶2 (Janus kinase 2,JAK2) 活化导致了肝纤维化的产生, 抑制JAK2活性能使纤维化得到改善。他们在不同的动物模型以及细胞培养实验中发现, AT1R的激活使得JAK2/Rho激酶通路激活, 诱导了HSCs的活 化 , 并发现在人肝纤维化过程中JAK2/Rho激酶表达上调。
综上所述, AT1R以及其下游激酶JAK2都可以作为肝纤维化的潜在靶点, 通过抑制其活性来达到抑制肝纤维化的作用。 8 PPAR-γ与肝纤维化
过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisome proliferator-activited receptor,PPAR) 属于核激素受体超家族, 是一类可以被过氧化物酶体增殖物激活的转录因子, 分为PPARα、δ(β)、γ等3类。PPAR在细胞生长、分化等生物学进程中都发挥了重要作用, 其中PPAR-γ表达于单核细胞、巨噬细胞、HSCs等多种细胞, 具有调控脂肪代谢、诱导肿瘤细胞的分化和凋亡、抑制炎症以及抗肝纤维化等多种生物学功能[42]。
PPAR-γ的抗肝纤维化作用主要与HSCs的增殖活化以及相关细胞因子的分泌有关。PPAR-γ在静息HSCs中表达, 随着HSCs的激活, PPAR-γ的表达量明显减少。PPAR-γ能够抑制静息态HSCs的激活及增生, 诱导细胞周期阻滞和凋亡, 进而抑制肝纤维化。增加外源性PPAR-γ的表达能够抑制HSCs中Ⅰ型胶原蛋白的合成、α-SMA及羟脯氨酸的表达水平[43], 使肝纤维化程度得到明显改善。研究表明, PPAR-γ配体或激动剂能够抑制肝纤维化的产生。Bae等[44]发现, PPAR-γ选择性激动剂KR62776能够抑制HSCs的活化, 同时改善大鼠CCl4诱导的肝纤维化。Yang等[45]发现, 迷迭香酸和黄芩苷也能通过促进HSCs中PPAR-γ的活化而发挥肝纤维化的作用。替米沙坦同时作为AT1R阻断剂及PPAR-γ的激动剂而发挥肝纤维化作用[46]。而临床研究也发现, PPAR-γ激动剂如吡格列酮或罗格列酮, 用于治疗肝纤维化有理想的效果[47]。
PPAR-γ可以抑制HSCs的增殖与活化, 抑制HSCs分泌胶原及各种促纤维化细胞因子, 进而调控肝纤维化进程。PPAR-γ及其配体可以成为肝纤维化治疗的靶点之一。 9 miR-29与肝纤维化
微小RNA (microRNA, miRNA) 是在真核生物中发现的一段含21～23个核苷酸的内源性非编码RNA, 它通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA, 进而降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译, 进而调节细胞的生物功能。miRNA在HSCs的激活与凋亡以及肝纤维化的产生过程中发挥了重要作用。特别是microRNA-29 (miR-29), 它在肝纤维化过程中是一个非常重要而且普遍存在的调节因子。
miRNA分析显示, 不管是大鼠还是人, 肝纤维化的产生使miR-29水平明显降低, 且随着肝纤维化程度的加深, miR-29的水平越来越低[48], 这表明在肝纤维化产生的过程中, miR-29的缺失扮演了重要角色。研究表明, miR-29b能够抑制HSCs的激活, 并通过直接与Ⅰ型胶原的3'UTR端结合, 抑制Ⅰ型胶原的合成[49]。此外, miR-29还能抑制Ⅳ型胶原蛋白的合成。TGF-β通过降低miR-29水平, 使得胶原合成增多; 肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor,HGF) 通过促进miR-29的表达, 使得胶原合成减少[50]。除了抑制ECM的合成, miR-29还能通过PDGF-C与 胰岛素样生长因子-Ⅰ (insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ) 干扰促纤维化细胞之间的相互作用, 继而抑制肝纤维化[51]。Zhang等[52]在CCl4诱导的肝纤维化模型研究中发现, 雄性小鼠肝内miR-29水平明显降低, 而雌性小鼠肝内miR-29水平未降低。而且下调雄性小鼠肝内miR-29水平, 肝脏内胶原蛋白、α-SMA及TGF-β1表达水平明显升高, 小鼠纤维化程度增加。此外, 他们还发现雌二醇具有抑制肝纤维化的作用, 主要是它能增加miR-29a/b的表达水平, 使得肝纤维化过程中胶原蛋白及与α-SMA的表达减少。给予小鼠雌二醇和提高小鼠肝内miR-29水平, 都能明显的抑制肝纤维化的产生。因此, 通过安全而高效的方式增加体内miR-29的表达水平, 也可能成为治疗肝纤维化的新方法。 10 其他靶点
20世纪末, 干扰素γ(interferon gamma,IFN-γ) 即被发现可以抑制纤维母细胞中ECM的合成, 并从多方面抑制HSCs的激活。临床研究发现, 使用IFN-γ使得HBV患者的肝纤维化得到明显抑制[53]。实验证明, 在肝损伤过程中, 抑制肿瘤坏死因子-α (tumor necros is factor-α,TNF-α) 能够减轻肝纤维化[54]。临床研究也表明, 酒精性肝炎患者使用TNF-α单克隆抗体治疗, 其肝炎及纤维化症状都得到改善[55]。核受体FXR是一种胆汁酸受体, 它在肝损伤实验模型中表现出肝保护作用, 并抑制了肝纤维化的产生[56]。p38是丝裂原激活蛋白 (mitogen-activated protein kinases,MAPKs) 选择性抑制剂FP-167653对CCl4诱导的肝硬化大鼠模型有显著的治疗效果[57]。 11 结语与展望
本文介绍的潜在靶点大部分仍处于临床前研究, 其中整合素αV是近期才发现的一个很重要的肝纤维化潜在作用靶点[20]。此外, 还有部分靶点已进入临床试验, 如CB1拮抗剂CP-945598已完成Ⅰ期临床试验, IFN γ-1b在肝纤维化及肝硬化的治疗效果与安全评价已完成Ⅱ期临床试验。目前, FXR激动剂在肝纤维化方面的临床研究较多, 其中INT-747治疗PBC及非酒精性脂肪肝 (nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD) 均已完成Ⅱ期临床试验, 奥贝胆酸 (obeticholic acid,OCA) 治疗PBC正在进行Ⅲ期临床试验 (表 1)。
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Table 1 Main potential antifibrogenic compounds |
肝纤维化是肝脏损伤修复的过程, 伴随着非常复杂的病理生理变化, 多种刺激因素、大量的细胞因子、复杂的细胞信号网络及多种类型细胞参与其中。随着对肝纤维化产生机制及病理过程研究的深入, 发现了越来越多抗肝纤维化的潜在作用靶点。除以上细胞因子外, 多条信号通路也可作为抗肝纤维化的靶点, 如TGF-β/Smad、PI3K/AKT、Wnt/β-catenin及NF-κB等, 都是肝纤维化产生过程中很重要的细胞信号通路。以这些细胞信号通路为靶点, 也是抗肝纤维化的重要途径。本实验室发现多种药物如全反式维甲酸 (all-trans retinoic acid,atRA)[58, 59]、EGCG (待发表) 能够抑制PI3K/AKT进而抑制TGF-β/Smad信号通路的活性, 从而抑制了肝纤维化的产生, 其中atRA及熊去氧胆酸联合用于治疗原发性硬化性胆管炎 (primary sclerosing cholangitis,PSC) 正在进行Ⅰ期临床试验, 这些很可能为肝纤维化的治疗提供新的途径。
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