2015, Vol. 6
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| 微生物高密度培养的研究概况 |  [PDF全文] |
大部分的发酵产物都积累于菌体细胞内部，要获得高浓度产物，首先就要获得高细胞密度.20世纪90年代高密度培养技术已成为发酵工程领域研究的热点问题之一，随着市场经济不断发展，人们需求日益提高，高质量和短周期生产发酵剂行业迅速增加，以最低的成本消耗获得最高的细胞浓度及其产物收益成为目前整个生产发酵行业的关注焦点，因此关于高密度培养技术和工艺方面的研究越来越热.
高密度培养技术最早用于酵母细胞培养提高生物量，利用烷烃或有机废水生产单细胞蛋白及乙醇[1].随着许多重要工业微生物的遗传背景和生理特性被逐渐认识，加上分子生物学技术和基因工程技术的不断发展和成熟，使微生物高密度培养技术在其它更多领域得到了更广泛的应用.
1 高密度培养的概述高密度培养技术只是一个相对概念，能让菌体发酵密度较普通培养有显著提高的技术都可以称为高密度培养技术[2].但是由于培养过程中选择的菌种菌株不同，培养目标也存在较大的差异，因此高密度培养的最终菌体生物量也无法用一个确切的值或范围来界定，根据广义的概念来讲，凡是细胞密度比较高或以至接近其理论值的均可称为高细胞密度.
在微生物培养过程中，营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致微生物生长停止的主要因素，而高密度培养技术不仅能提高微生物的可培养性、增加菌体活性，而且可以提高单位体积培养液中菌体数量和代谢产物浓度、更高效利用营养物质、缩短生产周期、减少设备投资，从而降低成本，节约资源，减少污染，提高综合生产效率.
2 微生物高密度培养的限制性因素及优化策略影响微生物高密度培养的因素有很多，主要包括：接种量、培养基组成、有害代谢产物的积累、培养条件等.
2.1 接种量不同的接种量对菌体活性影响不同，从而影响菌体的适应能力和生长速率.在营养物质充足的条件下适当加大接种量能加快菌体生长，缩短达到最高菌体浓度所需的时间.胡爽等人研究发现，在200 L的发酵罐中，分别接种5 %和10 %的大肠杆菌，接种量为10 %的最终菌浓度较5 %的有显著提高[3].
2.2 培养基普通微生物的培养基类型主要有3种：合成培养基、半合成培养基和复合型培养基.复合型培养基通常采用天然原料，其化学组成不明确且不可调控，因此不适合用于微生物的高密度培养.合成培养基的化学成分明确且质量稳定，适合于研究微生物基本代谢途径和探索代谢过程中物质变化规律，但是合成培养基营养较为单一，也不利于微生物的高密度培养.为了避免以上2种培养基的缺点，保持其优点，就出现了半合成培养基，半合成培养基是在合成培养基中添加少量天然营养物（如酵母粉、蛋白胨、氨基酸、无机盐等），这些天然物质能有效促进菌体细胞生长和代谢产物合成.半合成培养基更常用于微生物高密度培养.
在微生物高密度培养过程中，充足的营养供给是微生物快速生长和代谢产物大量合成的基础，它为微生物的正常生长提供碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等基础物质，这些是微生物菌体生长繁殖以及合成代谢产物所必需的物质.但是当普通培养的体系中营养成分浓度过高时，菌体生长会受到明显抑制[4]，不利于微生物菌体积累.另外培养基各成分比例也要恰当，特别是碳氮比例.在分析营养源对大肠杆菌生长的影响时，文献[5-6]研究表明，碳氮比较低，在培养初期菌体自身生长繁殖旺盛，产生大量代谢废物，抑制菌体后期生长，甚至容易造成菌体提前衰老自溶；而碳氮比过高，菌体利用的营养物质主要用于合成积累代谢产物，菌体生长代谢缓慢.
因此，需要根据培养微生物的生理特性来选择合适的营养组成物质和控制适当的物质浓度，这是解决限制高密度培养因素的重要策略之一.
2.3 代谢产物分批培养微生物过程中，经过一定时间，细胞超过一定浓度时，菌体生长会变缓甚至停止.分析其生长曲线可知，微生物生长停止的一个主要原因就是代谢产物的积累.另外，有害副产物的出现也会严重影响菌体生长和产物形成.在大肠杆菌、乳酸菌等细菌的培养过程中，菌体利用葡萄糖产生代谢副产物如乙酸、乙醇和二氧化碳等，对菌体生长繁殖具有抑制作用[7].文献[8]研究表明，当乙酸浓度大于5 g/L时，大肠杆菌菌体生长缓慢，最大菌浓度下降；当其浓度超过14 g/L时，菌体停止生长.
在微生物高密度培养过程中，可通过优化培养基组成、调整碳源种类和比例、维持较高的溶解氧等方式，来缓解代谢物积累带来的抑制作用.另外，目前也已经有研究通过代谢工程技术构造工程菌改变其代谢途径，从而阻止抑制物产生.比如有文献[9]提到，乙酸的分解代谢过程需要许多酶共同参与完成，而通常情况下，葡萄糖能够抑制这些酶的活性，所以在含有葡萄糖的培养基中高密度培养大肠杆菌等细菌时，这些乙酸分解酶都处于失活状态，使得乙酸积累，抑制微生物生长繁殖.因此，解除葡萄糖对乙酸分解酶的抑制就可以不断消耗乙酸，从而解除乙酸对菌体生长繁殖的抑制作用.文献[10]研究发现，某种突变菌株就能解除葡萄糖抑制作用，在消耗利用葡萄糖的同时不断地分解消耗代谢产生的乙酸.
另外，采用降温、流加营养物或者透析等方法，可以有效降低抑制物质的产生.
2.4 培养条件培养条件是影响菌体细胞生长繁殖的重要因素，它能影响菌体的生理生化特性，从而影响其高密度培养.在不同环境条件下，各种不同微生物在不同的培养阶段所需条件都是不同的，因此应该根据微生物生理特性、结合培养目标、充分分析并确定最佳的培养条件，以达到高细胞密度.
2.4.1 温度温度对于微生物的影响很大，它不仅可以改变菌体内各种反应速率和蛋白质性质，而且能影响培养液的物理特性，从而影响菌体生长繁殖和代谢活动，同时，它能影响培养体系中各种物理参数特性，间接对菌体产生一定影响.在一定范围内温度升高时，细胞内的酶催化和化学反应速率都会加快，菌体生长也会加快，同时营养物和代谢物的溶解度提高，细胞膜流动性增大，有利于营养物质的吸收和代谢产物的排除.一般温度每升高10 ℃，生化反应速率会增加1倍.但是超过一定温度后继续升温，会使蛋白质和核酸等受到不可逆的损害，从而抑制菌体生长代谢甚至导致死亡.因此，通常采用121 ℃、20 min来灭菌，因为在121 ℃条件下几乎所有的微生物都已经死亡.
最适宜温度并不是一个特定值，通常是一个范围区间，也不是一个菌种的特征性常数，它会随着培养基组成、培养条件、培养目标和菌体生长阶段的不同而改变.如，主要的浸矿菌氧化亚铁硫杆菌属于嗜热中温菌，其最适浸矿温度为30~35 ℃，而同样属于浸矿菌的高温嗜热菌金属硫化叶菌的最适宜浸矿温度为65 ℃[11].
2.4.2 pH值稳定的pH值是菌体维持在最佳生长状态的必要条件.高密度培养过程中营养物质被分解利用和代谢产物形成积累，都会导致培养环境pH发生变化，改变营养物质分子的电离状态，影响微生物利用效率[12].另一方面，培养环境的pH变化会引起细胞内pH值改变，从而影响细胞内结构的状态和性质，最终对菌体生长代谢活动产生负面影响.
因此，必须对培养基的pH条件进行控制，使其保持在一定的范围内.向培养体系中添加缓冲液提高缓冲能力能有效控制pH值的变化幅度，这样使得微生物处于最佳的生长繁殖状态，有利于积累大量菌体数量或产生目标代谢产物.另外，在微生物高密度培养过程中，也有人提出通过流加新鲜培养基来调节pH值，成功控制pH值范围.
2.4.3 溶氧浓度溶氧浓度的高低能明显影响菌体生长、产物合成以及产物性质.在高密度培养过程中，菌体密度不断增大，耗氧量也随之加大，使得培养基中溶氧水平逐渐下降，造成供氧不足，不利于各种代谢活动，从而抑制菌体生长和产物生成.
40 %左右的溶氧水平最适合嗜酸氧化亚铁硫杆菌的高密度培养[13].但是氧是一种难溶气体，常温常压下纯水中的氧容量仅7 mg/L，因此在试验中常常会用摇床、发酵罐和通气设备等来增加溶氧[14].但是也有资料[15]曾报道在高密度培养重组大肠杆菌过程中，溶氧水平并不是越高越好，溶解氧高于10 mg/L时，菌体浓度和色氨酸合成酶活力存在降低趋势，从而对产物的形成造成不利影响.因此，需要根据不同微生物特性和培养目标来确定最佳溶氧浓度.
3 高密度培养方式及其应用培养方式对菌体积累也有很大的影响.一般微生物高密度培养方式主要有：透析培养、细胞循环培养、补料分批培养等，其中补料分批培养研究最为成熟且应用最为广泛.
3.1 透析培养现在的透析培养其实是一种“Nutrient-split”补料策略[16]，即将培养基分成2部分，一种是含有必须营养物的浓缩型培养液，另一种是基本只含用来平衡渗透压的无机盐溶液.同时培养器也分为培养室和透析室2部分.浓缩型培养液以分批或连续的方式加入培养室为微生物提供充足的营养物质，同时，半透膜能除去有害代谢产物，解除其积累带来的抑制作用；无机盐溶液则加入透析室以维持渗透压平衡.
透析培养能明显延长对数期的菌体增殖、增大稳定期的细胞积累、提高营养物的利用率，且在培养室中可获得密度较高且较为纯化的菌体以及高分子目标产物.文献[17]曾利用透析培养技术培养不同微生物（包括葡萄球菌，大肠杆菌，极端微生物等），细胞密度约为普通发酵方式的30倍.但是，透析培养反应器本身还需要透析组件及一些其他辅助装置，因此设备投资较大，操作技术要求较高.透析培养在生产方面一般用于营养要求严格、培养条件复杂的淋球菌的浓缩培养，以及培养哺乳动物细胞的悬浮液生产病毒、毒素和酶制剂等[18].近年，Baehr等[19]将此方式成功应用于实验研究，用透析式摇瓶小规模流加培养大肠杆菌BL21（DE3），发现培养过程中代谢副产物大幅度减少，产酸途径明显受抑制，较分批培养过程，目标产物产量提高约1 000倍，菌体浓度增加约200倍.
3.2 细胞循环培养微生物培养过程中采用一定方式将细胞与培养液分开，无细胞的培养废液被转移出去，同时注入同样体积的新鲜培养基.细胞则加以循环利用，这种培养方式称为细胞循环培养.一般通过沉降、离心和膜过滤3种方式进行.
该培养方式一般可用于食品工业中为牛奶、酸奶培养乳杆菌等，Sung等[20]用带有陶瓷过滤装置的发酵罐培养乳酸细菌柠檬明串珠菌，获得了OD660为75的菌体密度，高出分批培养约6倍，培养周期延长至105 h.除此之外，也有人将细胞循环培养方式应用于活细胞的培养，如Kang等[21]采用细胞循环培养方式培养苏云金芽孢杆菌孢子，获得了浓度为82.2 g/L的菌体生物量，较分批培养高出4倍，孢子含量在95 %以上.
3.3 补料分批培养以上2种培养方式都是采用补料策略，主要原则都是将代谢废物以不同的方式转移出去，消除其抑制作用，同时不断补加新鲜培养液，为微生物提供充足的养分，使细胞达到较高密度.
补料分批培养[22]就是通常所说的流加培养，它是根据菌体实时生长情况和培养基特点动态调节补加新鲜营养液速度[23]，防止营养过剩给细胞生长带来抑制作用，使菌体生长及其目标产物生产的时间最大限度延长，数量最大限度增多.文献[24]研究发现，首先采用较稀的麦芽汁培养酵母菌，中途补充几次新鲜培养液，可以提高酵母产量，减少乙醇积累，这是最原始的补料技术.如今技术逐渐发展，应用日益深入，补料方式也得到了不断改进和丰富.其补料控制类型主要包括反馈控制和非反馈控制2种.反馈控制法是基于生理模型的，通过控制培养过程中菌体浓度、底物浓度、pH值、溶解氧浓度和CO2释放速率等生理参数来实现实时补料调节，但是根据微生物生长状况的反馈需要一定时间，对营养物流加控制具有一定的滞后性，因此培养过程中有可能会出现糖浓度的不稳定波动或者有害物质的积累.而非反馈控制策略是基于动力学模型的，设定固定参数按动力学模型流加培养液，常用的动力学模型主要有恒速流加、变速流加、间歇流加和指数流加.
补料分批培养不仅能为微生物提供充足的养分，以维持细胞生长和产物形成处于最优化状态，进而使培养液中菌体浓度达到较高水平，而且能有效解除高浓度底物或代谢物的抑制作用，延长生产时间.比如酵母工业研究中，段学辉等[25]比较了普通分批培养和补料分批培养对酒精酵母细胞生长的影响，结果发现补料分批培养不仅有利于酒精酵母的快速生长，得到较高的菌体浓度，而且酵母的有效重复利用次数达4批次，培养44 h后，菌体浓度达到了71.82 g DCW/L，比分批培养提高了155.68 %.
补料分批培养过程中必须要确定最佳的补料策略[26]，即找出最佳的培养条件和最合适的补料方式，使菌体生长和产物产生始终处于最佳状态.补料策略的理论依据主要有格林原理、庞特里金最小值或最大值原理等，加上计算机技术的迅猛发展，也为补料分批培养的监测与控制提供了更精准有效的手段.
目前补料分批培养的应用已经相当广泛，成功应用于高效生产有机酸、抗生素、维生素、氨基酸、酶制剂及生长激素等.如，分批培养高山被孢霉高产花生四烯酸需要很长的发酵时间，因为此菌体生长速率较慢，生长周期大约为7 d，Xiao-Jun Ji等用分批补料培养策略将其周期缩短至5 d，花生四烯酸产量由0.9 g/（L·d）增加至1.3 g/（L·d）[27].
4 结束语我国发酵行业多数产品的技术经济指标都处于较低的水平，存在着产品分离纯化技术落后，高质量产品产量低、资源浪费、环境污染、成本高、代价大等问题.高效的培养技术和发酵技术为解决这些问题提供了可能性.高密度发酵技术既是生产高质量、高密度菌体和代谢产物的首要环节，也是菌体和代谢产物实现工业化生产的有力支撑，现已经逐渐成为了生化工程重要研究领域.而着重于研究优化微生物高密度培养的限制性条件，并且将高密度培养技术从实验室水平推广到工业化领域，从工程菌的培养推广至非工程菌的培养，这将是今后研究的重点.
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