有色金属科学与工程  2013, Vol. 4 Issue (2): 61-65
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余水静, 彭艳平, 邓扬悟, 郭燕华, 刘荷英. 隐藏嗜酸菌Acidiphilium cryptum JF-5双组分信号转导系统[J]. 有色金属科学与工程, 2013, 4(2): 61-65. DOI:10.13264/j.cnki.ysjskx.2013.02.001.
YU Shui-jing, PENG Yan-ping, DENG Yang-wu, GUO Yan-hua, LIU He-ying. Two-component signal transduction system of Acidiphilium cryptum JF-5[J]. Nonferrous Metals Science and Engineering, 2013, 4(2): 61-65.DOI: 10.13264/j.cnki.ysjskx.2013.02.001.
隐藏嗜酸菌Acidiphilium cryptum JF-5双组分信号转导系统[PDF全文]
余水静, 彭艳平, 邓扬悟, 郭燕华, 刘荷英    
江西理工大学资源与环境工程学院，江西 赣州 341000
基金项目：江西省科技支撑计划项目资助（20121BBG70004）
作者简介： 余水静（1976-），男，博士，副教授，主要从事微生物冶金及基因组学方面的研究，E-mail：yushuijing2008@yahoo.com.cn
收稿日期：2012-12-02
摘要：为了探索隐藏嗜酸菌（Acidiphilium cryptum）对多变极端矿山环境条件的感知和反应分子机制，预测和分析了隐藏嗜酸菌JF-5菌株的双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system, TCS)的分布、结构及功能.鉴定了9对成对TCSs、2个杂合结构TCSs、3个孤儿组氨酸蛋白激酶（HK）和5个孤儿反应调节蛋白(RR)；发现5个TCSs参与隐藏嗜酸菌对重金属响应转录调控；大多数HKs的N-末端具有接受信号的跨膜区、HAMP或PAS等结构域，RRs主要是OmpR亚家族，占总RRs的40%以上；从进化关系上来看，一些处在进化树同一分支上的共同聚簇TCS基因可能具有相同的进化途径.本研究结果可为研究隐藏嗜酸菌在极端环境中适应性分子机制提供新的方向.
关键词： 隐藏嗜酸菌    双组分信号转导系统    组氨酸蛋白激酶    反应调节蛋白    功能域    生物信息学分析    
Two-component signal transduction system of Acidiphilium cryptum JF-5
YU Shui-jing, PENG Yan-ping, DENG Yang-wu, GUO Yan-hua, LIU He-ying    
School of Resource and Environment, Jiangxi University of Science and Technology, Ganzhou 341000, China
Abstract: In order to explore the molecular mechanism of Acidiphilium cryptum response to extreme conditions in the mine environment, the distributions, structures and putative biological functions of two -component signal transduction systems (TCSs) in A. cryptum JF-5 are predicated and analyzed. And 9 TCSs, 2 hybrid histidine kinases (HK), 3 orphan HKs and 5 orphan response regulator proteins (RR) were identified. Five TCSs were involved in the transcription regulation of A. cryptum response to heavy metal. The most Nterminal regions of HKs were characterized by the presence of transmembrane helices, HAMPs, or PAS domains. More than 40 percent of putative RRs were classified into OmpR subfamily. From the evolutionary relationship, the common clustering TCS genes in the same branch of the evolutionary tree may have the same evolutionary pathway. Our results should open a novel research direction in A. cryptum for molecular mechanism of the adaptation in the extreme environment.
Key words: Acidiphilium cryptum    two -component signal transduction system    histidine protein kinase    response regulator protein    functional domain    bioinformatics analysis    

隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)是一种能利用有机物、H2、单质硫或者还原Fe3+而获得能量，进行化能异养生长的嗜酸兼性异养细菌，为革兰氏阴性菌[1]，该菌一般生长在酸性矿山废水、高温废水或一些重金属污染酸性矿山环境中.隐藏嗜酸菌为金属还原性细菌，能进行铁呼吸作用，使Fe3+还原成Fe2+，可使Cr6+还原成Cr3+以降低Cr的毒性[2-3].在生物浸出过程中，隐藏嗜酸菌可还原Fe3+并利用其它浸矿细菌合成的有机物，通过这种方式，消除这些有机物的抑制和毒害作用，可为浸矿细菌如嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)提供Fe2+作为能源[4].有研究报道，通过对隐藏嗜酸菌和嗜酸氧化亚铁硫杆菌进行紫外诱变，诱变后混合菌浸矿，浸出效率大幅提高[5].此外，该菌还能合成聚-β-羟丁酸(Poly-β-hydroxybutyrate, PHB)[6-8].

隐藏嗜酸菌在生长繁殖过程中，需对多变的极端环境条件进行感知和反应.在原核生物中，通常这个功能是由双组分信号转导系统(Two-component signal transduction system, TCS)来完成的.双组分信号转导系统由组氨酸蛋白激酶(Histidine protein kinase, HPK)和反应调节蛋白(Response regulator protein, RR)组成[9]，具有参与调控生物生长、毒力等多种重要生物学功能.通常，定位在细胞质膜上的HPK监视着环境的变化，而与之相对应的位于细胞质中的RR对环境信号的变化进行相应的响应.目前，国内外还未见有关隐藏嗜酸菌双组分信号转导系统的研究报道.本研究拟应用生物信息学手段，对隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5菌株双组分信号转导系统进行预测和结构分析，并对其功能进行预测，旨在为研究该菌在极端环境中适应性分子机制提供新的方向.

1 材料与方法 1.1 基因组序列来源

从GenBank (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/)下载隐藏嗜酸菌A. cryptum JF-5基因组信息（后缀名为.fna, .ffn, .ptt, .faa的4个文件），见表 1.

表1 隐藏嗜酸菌A. cryptum JF-5基因组信息
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1.2 HKs和RRs预测

提交隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5的NC_009484.faa文件至Pfam蛋白序列数据库(http://pfam.sanger.ac.uk/)进行批量搜索(Cut-off选择Gathering threshold)[10]，在返回的结果中用Pfam02518 (HATPase_c)和Pfam00072 (Response_reg)（HKs和RRs的保守结构域）搜索可能的HKs和RRs；然后通过NCBI的BLASTp程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行在线确认：①催化结构域HATPase_c必须位于HKs的C-末端；② HATPase_c的上游具有二聚化或磷酸化结构域DHp；③ RRs的N-末端通常具有磷酸受体结构域REC；④ Response_reg结构域位于RRs的C-末端.基因间距小于300 bp且转录同向的HK-RR鉴定为HK-RR基因对(HK-RR gene pairs)，同时拥有HK的磷酸转移酶结构域（phosphotransferase domain）和RR磷酰基接受域（phosphoryl-accepting domain）的HK-RR为杂合蛋白(HK-RR Fusion)，单个的HK或RR基因鉴定为“Orphan”[11].

1.3 HKs和RRs功能域与进化分析

HKs和RRs功能域分别用SMART分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)[12]和BLASTp程序相似性比对分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）；采用MEGA5.1进行多重序列比对并建立系统发育树[13].

2 结果与分析 2.1 隐藏嗜酸菌双组份信号转导系统及功能分析

利用保守结构域HATPase_c (Pfam02518)和Response_reg (Pfam00072)对A. cryptumJF-5菌株的TCSs进行了搜寻.结果表明，在A. cryptumJF-5菌株中，HKs和RRs都为14个，其中成对的TCS (HK-RR)为9对，杂合结构的TCS (Fusion)为2个，孤儿Orphan HKs和Orphan RRs分别为3和5个(见表 2和表 3).隐藏嗜酸菌TCSs的数量明显少于苏云金芽孢杆菌（成对的TCS在35~40对之间，孤儿HKs和RRs分别为15~16和6~8个，杂合结构的TCS为2~3个）[14]，这可能与它们生长的环境复杂度差异密切相关，隐藏嗜酸菌生长在相对单一的环境中.通过分析发现这些双组分系统基因分散在基因组中，并不局限于某一区域，表明隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5菌株存在一个复杂的调控网络.

表2 隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5中双组分信号转导系统的数目/个
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表3 隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5中双组分信号转导系统及功能分析
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利用SMART数据库对TCS进行了功能分析，结果表明，TCS-1、TCS-2、Orphan RR1、Orphan RR4和Orphan RR5可能参与隐藏嗜酸菌对重金属响应转录调控，这可能有助于该菌生存于一些重金属污染酸性矿山环境中；TCS-4参与多重耐药基因家族转录调控；TCS-6和TCS-7可能参与氮素代谢转录调控；Orphan HK3和Orphan RR3与甲基化有关；还有部分功能仍然不清楚.这些分析结果也表明隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5菌株存在一个复杂的调控网络（见表 3）.

2.2 隐藏嗜酸菌HKs结构域组成

HKs是多结构域的同型二聚体蛋白，包括一个多变的N-末端和一个保守C-末端.N-末端为来自不同细胞位置（细胞外、细胞内或跨膜）的信号识别位点，大多数N-末端区域存在有1~20个跨膜螺旋（也有个例出现[15]）；C-末端区域包含有将信号转导到相应RR蛋白的保守组氨酸残基，有典型的功能域如HATPase_c和His_kinase[10, 16].利用SMART数据库对隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5的HKs进行结构域分析，发现大多数HKs的N-末端具有接受信号的信号输入结构域(Input)，如跨膜区、HAMP、PAS等结构域，见图 1.

图 1 隐藏嗜酸菌Acidiphilium cryptum JF-5双组分信号转导系统中HKs结构域

2.3 隐藏嗜酸菌RRs结构域组成

RR蛋白大多数通常为转录因子调节相关基因转录[16]，在N-末端具有一个保守的磷酸受体结构域(REC)，在C-末端输出结构域(Output domain).大多数RRs中含有一个保守的天冬氨酸残基(Asp，D), 为接受磷酸化的位点[17].根据NCBI的BLASTp在线同源性比对分析，发现隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5的RRs可分为OmpR (6)、CopR (1)、NtrC (1)、AtoC (1)、PhoB (1)、unclassified (4)等亚家族(注：括号内为数量)，隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5的RRs主要是OmpR亚家族，占总RRs的40 %以上.OmpR亚家族是目前已知的存在数目最多的一类应答调节蛋白，含有一个翼状螺旋-转角-螺旋的DNA结合基序[18].

2.4 隐藏嗜酸菌双组分信号转导系统结构功能域分析

基于SMART数据库，发现隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5的双组分调控系统基因中所存在的已知功能域（表 4），其中14个组氨酸蛋白激酶均存在结合ATP的激酶活性功能域(HATPase_c)，而14个反应调节蛋白均存在接受磷酸基团的功能域(REC).此外，发现Orphan HK3（Acry2708）蛋白中存在有HPT功能域，该功能域包含一个与形成转磷酸基作用有关的组氨酸残基活性中心，而这种功能域一般只存在于真核生物中.

表4 隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5双组分调控系统基因中的已知功能域
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2.5 隐藏嗜酸菌双组分信号转导系统基因进化分析

利用MEGA软件采用NJ法对隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5双组分调控系统的HKs和RRs构建进化树，见图 2.从进化关系上来看，在HKs蛋白进化中，TCS-1和TCS-2共同聚簇，Orphan HK3和TCS-9共同聚簇，TCS-4和Orphan HK2共同聚簇，TCS-3、TCS-5和Orphan HK1共同聚簇，杂合蛋白Fusion 1和Fusion 2共同聚簇（见图 2-HK）；在RRs蛋白进化中，TCS-1和TCS-2共同聚簇，TCS-6、TCS-7和TCS-9共同聚簇，TCS-4、TCS-8和Orphan RR1共同聚簇，TCS-5和Orphan RR2共同聚簇（见图 2-RR），基因共同聚簇显示了高度同源性，说明这些处在同一分支上的共同聚簇基因可能具有相同的进化途径.

图 2 利用MEGA 5.1（NJ法）构建的隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5的HKs和RRs进化树

3 结论

本研究对隐藏嗜酸菌A. cryptumJF-5的TCSs进行了预测及相关功能分析，结果如下：

（1）在A. cryptumJF-5菌株TCS中，HKs和RRs都为14个，其中成对的TCS (HK-RR)为9对，杂合结构的TCS (Fusion)为2个，孤儿Orphan HKs和Orphan RRs分别为3个和5个.

（2）研究发现TCS-1、TCS-2、Orphan RR1、Orphan RR4和Orphan RR5可能参与隐藏嗜酸菌对重金属响应转录调控，这将有助于该菌生存在一些重金属污染酸性矿山环境中.

（3）A. cryptumJF-5菌株中大多数HKs的N-末端具有接受信号的信号输入结构域(Input)，如跨膜区、HAMP、PAS等结构域.

（4）A. cryptumJF-5菌株的RRs可分为OmpR、CopR、NtrC、AtoC、PhoB、unclassified等亚家族，其中主要是OmpR亚家族，均占总RRs的40 %以上.

（5）A. cryptumJF-5菌株中的已知功能结构域主要包括HAMP、HATPase_c、HisKA、HPT、PAC、PAS、HTH、CheW、AAA、REC、Trans_regC等结构域.

（6）从进化关系上来看，发现A. cryptumJF-5菌株的部分TCS基因处在同一分支上的共同聚簇基因可能具有相同的进化途径.

在隐藏嗜酸菌中，TCS作为一种重要的调控机制，通过调控其多种生理生化过程，来适应外界环境的变化.深入研究隐藏嗜酸菌TCSs，将对阐明其适应多种极端环境因素的分子机制具有重大意义，但当前对其研究还十分有限.大多数TCSs在细胞中作用及它们激活基因，特别是RR调控的目标蛋白等尚不清楚，因此隐藏嗜酸菌TCS有待于研究者进一步深入研究和功能验证.

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