引言

页岩气是一种重要的非常规天然气资源^[1-3]，但其水力压裂工艺造成了对水资源巨大的需求，而含有大量的地层水、化学添加剂及废压裂液的返排液被排放出来，如果不经过处理直接外排，会对城市生活用水和工农业用水造成潜在的风险^[4-7]。目前，页岩气压裂返排液的主要处理方式是经过简单的预处理后回注，这一处理方式不但不能彻底去除其中的毒性物质，还有可能会对地下水资源带来危害^[8-10]。因此，对返排液的有效处理是解决这一问题的关键。

压裂返排液的处理方法包括Fenton处理^[11]、膜蒸馏^[12]、膜分离、催化氧化^[13]、化学絮凝^[14]、电絮凝等处理手段^[15-20]，其中，絮凝处理是钻采废水中常见的处理方法。本研究采用联合絮凝沉降考察对页岩气压裂返排液的处理效果。从实验室活性污泥系统中筛选出一株絮凝菌，对其进行分子生物学鉴定及生理生化特性检测，考察了该菌株与PAC对实际压裂返排液的单独絮凝效果，并进一步采用响应面优化法考察絮凝菌与PAC联合处理效果。

1 材料与方法 1.1 菌种来源及培养基 1.1.1 菌种来源

实验室分离筛选出一株具有絮凝功能的纯菌株。挑取菌体进行革兰氏染色，并进行生理生化实验。

菌株的分子生物学鉴定由上海美吉生物医药科技有限公司完成，通过对该菌株的16SrDNA基因进行扩增后对扩增产物进行测序，得到的序列与GeneBank数据库中的类似序列进行Blast对比，从而确定其分类地位。

1.1.2 培养基

筛选培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH值至7.2~7.4，121 ℃灭菌20 min。

液体培养基：葡萄糖20.0 g；酵母膏0.5 g；K$_{{\rm 2}}$HPO$_{{\rm 4}}$ 5.0 g；KH$_{{\rm 2}}$PO$_{{\rm 4}}$ 2.0 g；MgSO$_{{\rm 4}}\cdot$7H$_{{\rm 2}}$O 0.2 g；NaCl 0.1 g；尿素0.5 g；pH值7.2~7.4；H$_{{\rm 2}}$O 1 000 mL；112 ℃灭菌30 min。

发酵培养基：葡萄糖20.0 g；蛋白胨1.2 g；K$_{{\rm 2}}$HPO$_{{\rm 4}}$ 5.0 g；KH$_{{\rm 2}}$PO$_{{\rm 4}}$ 2.0 g；MgSO$_{{\rm 4}}\cdot$7H$_{{\rm 2}}$O 0.2 g；NaCl 0.1 g；pH值7.2~7.4；H$_{{\rm 2}}$O 1 000 mL；112℃灭菌30 min。

1.2 絮凝菌发酵培养

将纯化培养后的菌株接种于发酵培养基中，在35 ℃，160 r/min的摇床中发酵培养6，12，18，24，30，36，42，48 h，分别检测发酵液的吸光度值(600 nm)及絮凝性，并计算其絮凝率。

1.3 絮凝性能测定

(1) 絮凝活性测定

采用4 g/L高岭土悬浊液作为测试溶液。200 mL的烧杯中依次加入高岭土悬浊液(4 g/L)100 mL，1%CaCl$_{{\rm 2}}$溶液5.00 mL，发酵液1.25 mL，在电动搅拌器上搅拌均匀后，静置5 min后，取上清液在550 nm波长下测其吸光度($A$)。同时，以2 mL新鲜培养基代替发酵液作为空白对照，测其吸光度($B$)。根据测量结果计算絮凝率($R$)，絮凝率($R$)的计算公式为

$ R =(B-A)/B{\times}100\% $

(1)

(2) 絮凝活性分布

将在35 ℃，160 r/min的摇床中培养36 h的絮凝菌的发酵液，在5 000 r/min离心10 min，得到发酵上清液，然后，将菌体用无菌蒸馏水洗涤，并加入一定量的无菌蒸馏水进行悬浮，制成菌悬液。将发酵原液、上清液和菌悬液的絮凝率进行测定。

1.4 页岩气压裂返排液絮凝实验

实验返排液水样取自四川威远长宁地区的压裂现场，其水质表征为浑浊、发黑、有石油味，有一定黏度。水质指标如表 1所示。

絮凝菌H5和PAC单独絮凝实验：分别准确称取一定量的絮凝菌H5，投加至500 mL页岩气压裂返排液中，常温下先快速(250 r/min)搅拌1 min，再慢速(50 r/min)搅拌30 min，静置30 min后取上清液，检测废水COD和浊度，确定投加量范围。由于页岩气压裂返排液中有Ca$^{{\rm 2+}}$，因此，在进行实际废水絮凝实验时，不添加CaCl$_{{\rm 2}}$。

由于该压裂返排液有油污存在，单独投加絮凝菌或絮凝剂PAC的效果不如两者联合投加的效果好，因此，采用与PAC联用来处理压裂返排液。在絮凝处理页岩气压裂返排液的过程中，处理效果会受到絮凝菌投加量、PAC投加量、快速搅拌速度、慢速搅拌速度、搅拌时间、沉降时间等因素的影响，选择其中的主要影响因素作为响应面优化实验的因素：絮凝菌的投加量、PAC投加量、慢速搅拌速度、沉降时间。

絮凝菌H5与PAC复配的响应面优化：设计4因素、1响应值的中心组合实验，通过3次平行实验的平均值建立二次回归模型。4个变量为絮凝菌H5($x_{1}$)、PAC($x_{2}$)、慢速搅拌速度($x_{3}$)、沉降时间($x_{4}$)，响应值($y$)为COD去除率。前期絮凝实验结果显示，这两种絮凝剂对于浊度的去除效果与COD的去除规律相似，因此，响应面优化实验时采用COD$_{{\rm Cr}}$(采用微波消解法测定的COD$_{{\rm Cr}}$^[21])作为响应值。应用Design-expert软件进行实验设计，如表 2所示。

2 结果与讨论 2.1 菌种分离与鉴定

实验室筛选出一株有絮凝活性的菌株H5，其絮凝率大于60%，将其转接到固体筛选培养基上，进行纯化培养，然后，挑取单菌落接入液体培养基中进行培养。

该菌株在发酵培养基上呈规则圆形，边缘整齐，表面光滑，菌落乳白色，直径1.0~2.0 mm。革兰氏染色结果阴性，生理生化特性见表 3。根据其16SrDNA基因序列分析，得到的结果是该菌与Acinetobacter baumannii strain XDR-BJ83(登录号为CP0184211)相似度高达100%。

2.2 絮凝菌发酵培养时间的确定

图 1为发酵培养时间对絮凝及生长的影响曲线图(图中，$O_{\rm D600}$—菌液在600 nm波长处的吸光值，无因次)。

由图 1可见，随着培养时间的增加，絮凝菌的生长经过6 h的延滞后进入到对数生长期，并且持续到第18 h后进入稳定生长期，在36 h之后吸光度值略有下降，絮凝菌生长随即进入衰退期，菌体数下降。从絮凝效果来看，在培养初期絮凝率很低，在培养6 h时，絮凝率为负值，此时培养基各成分基本没有絮凝活性，此时菌体少，代谢活动不旺盛，絮凝菌分泌到胞外的物质很少，因此并无明显絮凝效果，随着培养时间的延长，活性物质在菌体生长过程中产生并积累，其絮凝率也迅速提高。其稳定期初期在18 h左右，絮凝菌的代谢产物在此阶段大量积累，絮凝菌表现出较好的絮凝活性，在36 h时达到最高，此时絮凝率为65.7%，但之后絮凝率开始缓慢下降，可能由于此时絮凝菌生长进入衰亡期，营养物质也消耗殆尽，为了维持生存，絮凝菌将絮凝活性物质消耗了。这说明引起絮凝的活性物质是微生物在发酵过程中生物合成的，与絮凝菌的生长密切相关。因此，后续实验中选择培养时间36 h做为最佳培养时间。

2.3 絮凝性能测定

图 2絮凝活性物质在发酵液中的分布图。

由图 2可知，发酵原液活性最高，为65.7%，比上清液(45.3%)和菌悬液(22.5%)的絮凝率高，而且上清液及发酵原液的絮凝率都比菌体的絮凝率高，这说明絮凝活性物质主要存在于发酵液中，而菌体的悬浊液絮凝效果较低，这表明絮凝菌产生的胞外物质大部分分泌至发酵液中，这就有可能是鲍曼不动杆菌分泌的胞外多聚物而产生的效果。因此，在后续的实验中，将发酵原液作为絮凝剂，进行絮凝实验。

2.4 絮凝菌与PAC投加量的确定

在本实验中，絮凝菌H5对COD和浊度的去除效果如图 3a所示，当投加量从5 mg/L逐渐增加至50 mg/L时，COD和浊度的去除率较快增加至40.3%和30.5%。但是，随着絮凝剂H5的继续投加(＞30 mg/L)，COD的去除率略有下降，浊度去除率趋于稳定。因此，在后续响应面优化实验中，絮凝菌投加量为10~30 mg/L。

从图 3b可见，随PAC投加量的增加，COD去除率从15.1%增加至30.3%，但是当投加量大于30 mg/L时，絮凝率不增反降，浊度的去除率也出现相应的变化，因此，响应面优化实验中，PAC投加量范围为10~30 mg/L。

2.5 絮凝菌H5联合PAC对压裂返排液的处理效果

根据Box-Beknhen设计原理，选取对压裂返排液处理效果较为明显的4个因素作为变量，按表 2的设计进行实验。该实验设计方案共设计29组实验，实验结果见表 4。

运用Design Expert对表 4的实验数据进行多元回归拟合分析，得到回归方程

$ y = -210.330 + 2.828{x_1} + 2.635{x_2} + 6.376{x_3} + \\[4pt] {\kern 20pt} 0.802{x_4}- 0.062{x_1}{x_2}-0.020{x_1}{x_3}-0.012{x_1}{x_4} + \\[4pt] {\kern 20pt} 7.75 \times {10^{ - 3}}{x_2}{x_3} + 0.02{x_2}{x_4}-4.625 \times {10^{ - 3}}{x_3}{x_4}- \\[4pt] {\kern 20pt} 0.031{x_1}^2\!-\!0.053{x_2}^2\!-\!0.042{x_2}^2\!-\!0.011{x_4}^2 $

(2)

由回归方程可知，这4个因素对COD去除率的影响并不是简单的线性关系，而是交互影响的，为验证二次多项式模型对实验结果进行模拟的充分性和显著性，对模型进行方差分析。回归模型方差分析结果见表 5。

由表 5的方差分析可以看出：模型的$F$值为19.03，$P$值＜0.0001，说明该二次多元回归模型的效果是显著的，方法是可靠的，该模型具有统计学意义。该模型的絮凝菌H5投加量、PAC和搅拌速度显著，失拟项的$P$值为0.164 3(＞0.05)，表示所使用的模型与具体实验结果吻合程度高，失拟项不显著。信噪比Adeq Precision的值很高(15.203)，表明方程的拟合度和可信度较高，实验误差较小，该模型可以用于预测。校正决定系数为0.900 1(＞0.8)，表明模型显著，相关系数0.950 1，表明独立变量之间的相关性很好，响应值的二次回归模型拟合很好。对模型系数进行显著性检验，H5投加量、PAC投加量、搅拌速度和沉降时间的$F$值分别为55.76、4.70、131.6、0.04，这些因素对COD去除率的显著性顺序为搅拌速度＞H5投加量＞PAC用量＞沉降时间，从实验处理实际效果来看，联合处理效果显示形成的絮体较大，而且沉降速度快，上清液清澈。

2.6 响应面因素效应分析

为直观反映H5投加量、PAC投加量、搅拌速度和沉降时间对COD去除率的影响，绘制了各因素之间相互作用的响应面及等高线图(图 4)。

图 4a~图 4c表明，COD去除率随着絮凝菌H5投加量的升高，呈现先升后降的现象，可能由于过量的絮凝菌未能与胶体颗粒结合并沉淀，由于絮凝菌H5为有机物，会导致COD去除率略有下降。在图 4a，图 4d，图 4e中，COD去除率先随着PAC投加量的增加而增加，然后，随着PAC投加量的继续增加而减少，PAC的最佳浓度为20~30 mg/L，可能是由于PAC投加量过低，絮凝剂分子不足以与污染物充分接触，无法使胶体颗粒形成有效的絮体；而投加量过高，由于过量的絮凝剂将胶体颗粒覆盖，破坏胶体的稳定性，导致絮凝效果下降。图 4b，图 4d，图 4f中，COD去除率先随着搅拌速度的增加而增加，然后，随着速度的继续增加而减少，可能是由于絮凝过程中搅拌速度过小，絮凝剂与污染物不能形成絮体，COD去除率不高，而搅拌速度过大，废水中絮体可能被击碎，交互作用显示，最佳搅拌速度为70~80 r/min。图 4c，图 4e，图 4f中，当沉降时间在10~40 min时，COD去除率变化较小，即沉降时间对COD去除率的影响是不显著。

2.7 最佳絮凝条件的确定及验证实验

通过Design expert软件设定COD去除率的最大值100%，确定根据模型所预测的页岩气压裂返排液的最佳絮凝条件为絮凝菌H5浓度10 mg/L，PAC浓度30 mg/L，搅拌速度73 r/min，沉降时间40 min，最终的预测响应值COD的去除率为89.5%。根据该最佳絮凝条件，进行的3组平行实验结果分别为84.7%、86.5%、84.1%，COD去除率的平均值为85.1%，浊度去除率分别为96.8%、95.6%、98.7%，对浊度的去除效果好。其COD去除率与模型预测值的相对偏差为-4.91%，表明该模型能够较好地与预测响应值拟合。

3 结论

(1) 从实验室活性污泥中筛选、分离、纯化并优选出一株高效絮凝菌H5，与Acinetobacter baumannii strain XDR-BJ83(登录号为CP0184211)相似度高达100%。

(2) 压裂返排液处理效果回归模型方差分析表明，$P$值＜0.000 1，模型效果显著而可靠，回归模型的拟合很好。对COD去除率具有显著性影响的因素有搅拌速度，絮凝剂H5的投加量，PAC投加量。

(3) 絮凝剂H5和PAC复配得到最佳絮凝条件为絮凝菌H5投加量10 mg/L，PAC浓度30 mg/L，搅拌速度73 r/min，沉降时间40 min，在此条件下，COD的去除率由20%~40%提升到约85%，浊度去除率＞95%。