2. 华南农业大学兽医学院, 广州 510642
, HE Xianming1, ZHAO Xiya1, ZHUANG Tingting1, HUANG Meizhen1, LIANG Shijin1, YU Chuanzhao1, LIANG Xuejing1, CHEN Ruiai1,2
2. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)属于γ-冠状病毒，是一种鸡的高度传染性病毒，主要损害呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，可造成雏鸡死亡以及饲料报酬率降低，蛋鸡产蛋量、品质下降等，严重危害着鸡养殖业[1]。IB可分为呼吸型、肾型、生殖型、肠型和腺胃型[2]。1931年SChalk等首次报道一种新型的鸡呼吸道疾病，该病主要侵害雏鸡的呼吸道，表现为张口呼吸、咳嗽和气管啰音等[3]；随后发现IB的组织嗜性越来越广泛，引起感染鸡其他症状的病例先后被报道。IB可侵害鸡生殖系统，引起卵巢充血、出血，和输卵管永久性损伤，最终导致蛋鸡产蛋量和蛋品质下降[4]；1962年，Cumming等发现可引起“花斑肾”肾炎的Holt和Gray毒株；1986年又分离出肠型毒株，可造成肠道损伤[5]。我国在1972年首次报道鸡群中存在IB，于1982年发现肾病变型，1990年代末，我国分离到以鸡腺胃肿大为特征的腺胃型IBV毒株[6-7]。目前，IB已在美洲、亚洲、欧洲等的50多个国家及地区发生和流行。
IBV属于冠状病毒科冠状病毒亚科的Gamma冠状病毒，病毒为有囊膜不分节段单股正链RNA病毒。IBV复制依赖RNA聚合酶，然而RNA聚合酶缺乏校正能力[1]。因此，病毒的这种复制机制使得病毒很容易发生变异或重组。IBV不同毒株间自然重组可以产生新的毒株，进而导致新的基因型或血清型的出现。目前已发现该病毒的血清型有30种以上，不同的血清型之间交叉保护低或无交叉保护[8]。其中，S1基因的遗传多样性非常高，如GVIII-2与其他基因型核苷酸相似性低至52.7%，S1基因是IBV基因分型的靶基因，其演化和变异可能引起IBV抗原漂移、基因型和血清型变化[9]。
高明燕等[10]统计近年来我国IBV的传播和流行现状，结果表明与疫苗广泛使用相关的IBV基因型主要是Mass型(GI-1)和4/91型(GI-13)。上述两种弱毒活疫苗均出现疫苗再分离的情况[11]，频繁参与其他流行毒株的重组，已成为IBV的重要基因供体[12]。但Mass型和4/91型疫苗株又与我国流行的各个基因型毒株演化距离都较远，难以给鸡群提供足够的免疫保护, 比如，王露等[13]报道4/91型疫苗不能抵抗QX型和LDT3型野毒株的感染。QX型或LX4型(GI-19)是我国20多年以来最主要的IBV本土优势基因型[10]。QX型IBV毒株没有明显的时间和地理分布倾向，不仅在国内广泛流行，还在日本、韩国、俄罗斯以及欧洲各国传播[9]。牛登云等[14]研究发现，该型在2018—2019年全国12个省份的分离毒株中占比79.85%，而且与参考毒株SZ相比，氨基酸变异已经超过13%。该型毒株毒力较强，主要侵害鸡的肾脏，造成肾组织损伤，尿酸盐沉积，死亡率高[10]。
我国贸易与人员来往频繁，地域环境差异大，养殖方式不同，畜牧业发展水平不一，鸡群免疫压力不一样等因素导致IBV多基因型并存，疫病防控困难，对养禽业危害重大[15]。因此分离鉴定临床流行毒株，对于IBV疫苗毒株的选择与研制具有重要的指导意义。本研究对实验室从养殖场疑似IB病鸡气管和肾中分离到3株IBV代表毒株进行病毒全基因组测序分析和致病性研究，以其为IBV流行病学调查和新疫苗的研制提供借鉴参考。
1 材料与方法 1.1 主要病原与试剂IBV分离株由实验室分离保存(病毒分离背景见表 1)，挑选的3株IBV分离株已用加粗标出。SPF鸡胚和SPF鸡购自广东温氏大华农生物药品有限公司。RNA反转录试剂盒(KP118-02)购自天根生物科技有限公司；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit和PrimeSTARⓇ GXL DNA Polymerase购自TAKARA公司；DNA Marker和RNase-free水购自北京全式经生物技术有限公司。
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表 1 IBV分离株背景信息 Table 1 Background information of isolated IBV strains |
本实验室从2014—2022年间于山东、广东和江苏等地分离的IBV毒株56株IBV，采用靶向IBV S1全长基因核苷酸序列的特异引物IBV-S1F(AAGACTGAACAAAAGACCGACT)和IBV-S1R(CAAAACCTGCCATAACTAACATA)进行PCR扩增S1基因，产物送测序。获得测序结果后，基于S1基因序列对60株IBV毒株进行演化分析。
1.3 3株IBV代表毒株的全基因组测序分析1.3.1 3株禽传染性支气管炎病毒分离毒株的增殖与鉴定 文献报道，IB与禽流感或/和新城疫混合感染病例也时有发生。因此采用文献报道的引物对本实验室分离保存的3株IBV毒株进行外源病毒检测(表 2)。将鉴定后的3株IBV毒株尿囊液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，按1 ∶100的比例加入青霉素。将过滤和抗生素处理的上清以0.2 mL ·枚-1剂量接种7日龄SPF鸡胚尿囊腔，置37 ℃培养箱孵育3 d，每12 h照胚观察一次，弃去24 h内死亡胚，第3天收尿囊液连续传2代。提取第3代次病毒的RNA，并反转录为cDNA，用“1.2”中的IBV特异引物进行PCR鉴定，并将尿囊液于-80 ℃保存。
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表 2 外源病毒检测引物序列 Table 2 Detection primers for exogenous virus |
1.3.2 3株禽传染性支气管炎病毒分离毒株病毒全基因组测序与分析 用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取种毒尿囊液总RNA，立即使用RNA反转录试剂盒(KP118-02)反转录成cDNA，干冰冷链送测序上海探普生物科技有限公司进行二代测序。测序结果拼接成病毒全长基因组。并对IBV分离毒株的S、E、M和N四个结构蛋白基因序列进行Blast分析，并采用MegAlign、MEGA7.0、RDP4和BepiPred 1.0Server生物信息学软件进行相似性分析、演化分析、重组分析以及B细胞线性化抗原表位预测。
1.3.3 3株禽传染性支气管炎病毒分离毒株病毒对鸡胚的致病性 将病毒液用灭菌PBS进行10倍梯度稀释，从10-1~10-8，将稀释后的病毒以0.2 mL ·枚-1剂量接种7日龄SPF鸡胚，每个稀释度重复5枚，观察记录鸡胚的死亡数以及病变情况，按Reed-Muench法计算出病毒的EID50。
1.3.4 JS96代表毒株对1日龄和15日龄SPF鸡致病性 以104 EID50的JS96经点眼滴鼻方式接种1日龄SPF鸡4只，1只不攻毒作为对照，观察SPF鸡的发病情况，剖检病鸡并取内脏组织做病理组织切片。将60只15日龄SPF鸡随机分为2组，分别用104 EID50的JS96和PBS滴鼻和肌注结合攻毒。各试验组在攻毒后48、96、120和164 h各随机取1只鸡进行放血处死，剖检观察肾脏病理变化。剩余鸡继续饲养7 d后统计体重差异。
2 结果 2.1 56株禽传染性支气管炎病毒分离株演化分析测序获得本实验室2014—2022年分离的56株病毒S1全长基因核苷酸序列。基于病毒S1全长基因核苷酸序列，应用MEGA7软件进行同源演化分析，演化树显示目前我国主要流行毒株包括GI-1、GI-7、GI-13、GI-18、GI-19、GI-22、GI-23、GV1-1和变异毒株。而且，近年来分离的毒株近一半属于QX-like基因型(GI-19病毒谱系)(图 1)，流行最为广泛，占比达51.67%，GVI-1次之，因此根据演化树位置挑选3株GI-19基因型分离株进一步研究。
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图 1 分离毒株的S1基因序列演化分析图 Fig. 1 Phylogenetic tree based on the S1 nucleotide sequence |
采用表 2特异性引物进行外源病毒检测，RT-PCR检测结果显示3株GI-19 (QX-like)基因型IBV代表毒株均只能扩增出IBV的特异性检测条带，FAdV-4、H9AIV、H5AIV、ILTV、IBDV、NDV和ALV-A均不能扩增出目的条带(图 2A)，因此，可判断实验室分离保存的3株IBV毒株不存在FAdV-4、H9AIV、H5AIV、ILTV、IBDV、NDV和ALV-A污染，3株分离毒株纯净度好。将鸡胚增殖的尿囊液病毒，在使用之前RT-PCR再次鉴定，图 2B鉴定结果显示3株毒株增殖的尿囊液均呈阳性(1~3分别为KC、MH20和JS96)，说明3株分离毒株增殖成功。
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图 2 外源病毒检测和增殖毒鉴定 Fig. 2 Detection of exotic virus and RT-PCR identification of propagation strain |
3株分离毒株基因组大小约为27.6 kb，具5′端帽子和3′端PolyA尾结构，其中各种辅助基因分布在5′端1/3区域的非结构基因内(表 3)，这些辅助基因虽不参与编码结构蛋白，但对于调控病毒复制以及致病机制具有重要作用[18]。MH20、KC和JS96 3株分离毒株结构蛋白基因S、E、M和N分别位于20 353—23 850、24 198—24 524、24 496—25 168和25 917—27 146、20 353—23 850、24 198—24 524、24 496—25 168和25 917—27 146、20 344—23 841、24 189—24 515、24 487—25 164和25 913—27 142 nt。S、E、M和N结构蛋白基因全长分别为3 498、327、678、1 230 nt。
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表 3 各基因组主要区域位置 Table 3 The position of the main region in each genome |
Furin酶切位点对基因型具有一定指征性，对MH20、KC和JS96 3株分离毒株Furin酶切位点进行分析。发现3株IBV在536位氨基酸处具有相同的Furin酶切位点HRRRR，与QX-like基因型毒株具有相似的Furin酶切位点(HRRRR)(图 3)，初步判断此3株分离毒株很可能是QX-like基因型毒株。缺失第二Furin酶切位点，这可能是该3株毒株缺乏与Beaudette相似的细胞适应性的重要原因之一。
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图 3 IBV S蛋白Furin酶切位点 Fig. 3 Furin cleavage site of S protein of IBVs |
用Snapgene进行病毒全基因组拼接，将3株分离病毒全基因组在NCBI进行blast比较分析核苷酸相似性。结果显示，MH20、KC和JS96毒株分别与NCBI数据库中YX10(JX840411.1)、CK/CH/LLN/131040(KX252787.1)和CK/CH/LJL/140924(KX302873.1)毒株相似性最高，相似性为99.15%、97.09%和97.83%。S蛋白是诱导中和抗体的主要免疫原蛋白，诱导机体产生中和抗体，故对高变区S1基因序列进行分析，3株毒株与QX-like代表毒株(MN548289.1)比较，未发现基因插入和缺失现象，以基因点突变导致的差异为主。而S1相似性进行分析，结果显示，3株毒株之间S1的相似性较高，为95.1%~96.7%，而3株分离毒株与国内外疫苗毒株H120、H52以及ArkDPI的S1的相似性，仅为75.9%~78.1%，与经典毒株M41和Beaudette的相似性也只有77.2%~77.7%(图 4)。这说明当下流行的IBV毒株基因型与现有商品化疫苗的适配性较差。
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图 4 三株IBV与疫苗(经典)毒株S1的相似性 Fig. 4 Homology of three isolated IBV strains and vaccine (or classical) strain S1 |
通过在线软件BepiPred 1.0 Server对分离毒株与疫苗毒株H120和经典毒株M41主要免疫原蛋白S的B细胞抗原表位进行预测。结果显示分离毒株(绿色)有31个抗原表位，与对照毒株(蓝色)有30个抗原表位，此外，分离毒株与对照毒株相比，其S蛋白B细胞抗原表位除数量差异外，序列一致性上也存在一定的差异(图 5)。这也一定程度上解释了流行毒株与疫苗毒株交叉免疫反应差的原因。
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图 5 在线BepiPred 1.0预测IBV S蛋白线性B细胞表位 Fig. 5 BepiPred 1.0 server predicts the linear B-cell epitopes of IBV S protein |
通过RDP4生物信息学软件，将3株分离毒株与2株疫苗毒株(H120和H52)、经典毒株M41以及其他7株同源较高的同基因型毒株进行重组事件分析，结果显示CK/CH/SD/MH20 2015、CK/CH/GD/KPLH-CZQ 2018和Isolated SD(GenBank: KY421673)分别在4 678—11 032和5 462—9 180处发生重组(图 6A、B)；CK/CH/JS/TAYH 2018和CK/CH/LJL/140734(GenBank: KX425847)在10 972—11 401处发生重组(图 6C)，它们的亲本分别是SD_QX-like (KY421673)、SD_QX-like (KY421673)和CK/CH/LJL/140734(KX425847.1)。这说明IBV容易发生基因重组事件，基因重组可能是IBV形成新的基因型和血清型重要原因之一。
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A. CK/CH/SD/MH20 2015潜在重组事件；B. CK/CH/GD/KPLH-CZQ 2018潜在重组事件；C. CK/CH/JS/TAHY 2018潜在重组事件 A. Potential recombination events in CK/CH/SD/MH20 2015; B. Potential recombination events in CK/CH/GD/KPLH-CZQ 2018; C. Potential recombination events in CK/CH/JS/TAHY 2018 图 6 IBV分离毒株重组分析 Fig. 6 Recombination analysis of three isolated IBV strains |
MH20、KC和JS96 3株分离毒株均具有鸡胚致病性。其中MH20(图 7a)和KC(图 7b)主要引起鸡胚矮化；JS96则具有更强的鸡胚致病性，不仅可致鸡胚矮化还可引起鸡胚严重出血(图 7c)，三者的EID50分别为106.668、106.468和107.699 ·mL-1。因此，选取JS96为代表毒株进一步研究QX-like流行毒株对SPF鸡的致病性。
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a.MH20鸡胚致病性；b.KC鸡胚致病性；c.JS96鸡胚致病性 a. Pathogenicity of MH20 strain; b. Pathogenicity of KC strain; c. Pathogenicity of JS96 strain 图 7 三株分离毒株对SPF鸡胚的致病性 Fig. 7 Pathogenicity of three isolated virus strains to SPF chicken embryos |
以每只滴鼻点眼和肌注结合攻毒4只1日龄SPF鸡，200 μL ·只-1(约104 EID50)。结果显示：JS96对于1日龄SPF鸡具有致病性，发病率100%。发病鸡出现精神沉郁、羽毛蓬乱、排白色稀粪等症状。剖检典型病变为肾肿大、尿酸盐沉积，可见“花斑肾”，气管出血(图 8)。JS96接种1日龄SPF鸡，病理组织切片结果显示JS96毒株主要对1日龄SPF鸡的气管、肺和肾造成病理损伤，气管表现为纤毛和黏膜上皮脱落，肺则呈现气泡壁淤血、出血，肾的病理变化主要为肾小管变性坏死(图 9)。
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图 8 毒株JS96攻毒1日龄鸡剖检 Fig. 8 Autopsy of chickens infected JS96 |
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图 9 毒株JS96攻毒1日龄鸡后72 h病理组织切片(HE染色) Fig. 9 Pathological tissue sections of 1-day-old chicken at 72 hpi (HE staining) |
以相同剂量滴鼻点眼和肌注结合接种15日龄SPF鸡。结果显示JS96对于15日龄SPF鸡仍然具有一定致病性，但发病率明显低于1日龄SPF鸡，攻毒的35只鸡仅个别鸡症状明显，表现为精神沉郁、羽毛蓬乱、嗜睡和离群等症状如图 10a红色箭头所指鸡。发病症状明显鸡在感染后96和120 h剖检，发现发病鸡肾肿大、尿酸盐沉积，可见“花斑肾”，其中感染120 h鸡肾比96 h肾更苍白，尿酸盐沉积更加严重，质脆易碎。这说明JS96感染120 h左右肾病变最为严重(图 10b、c)。JS96感染15日龄SPF鸡，除了导致呼吸道损伤外，还可以导致鸡群体重下降，将攻毒后，连续饲养15 d的所有剩下鸡称重，计算比较鸡只平均体重，发现JS96攻毒组的鸡群平均体重显著低于对照组鸡群(图 10e)，这说明IBV不仅可导致鸡群发病，还会影响鸡群生长。
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*.P < 0.05 图 10 毒株JS96攻毒15日龄鸡剖检和各试验组体重的差异 Fig. 10 Autopsy of chickens infected with JS96 and differences in weight among experimental groups |
基于2021年最新S1全长的分类系统将IBV分为GI~GVII 7个基因型，其中GI有27个病毒谱系(GI-1~GI-27)[19]。本研究对本实验室2014—2022年间从江苏、山东、广东广西等地分离的56株IBV毒株进行S1测序演化分析，结果显示我国目前主要流行毒株的基因型包括了GI-1、GI-19、GI-22、GI-23、GⅡ-1、GIV-1、GV-1、GV1-1和变异毒株, 其中GI-19 (QX)是优势基因型，占比约53.57%, 此外，GVI呈现流行增多，变异毒不断涌现趋势，需要加强关注和监测。这些数据均说明了当下GI-19 (QX-like基因型)已是危害我国养禽业发展的主要毒株。这也与Ji等[20]对2016—2018年从华中地区各个养鸡场获得的临床样本中分离鉴定了56株IBV毒株，分离株的基因型包括GI-13 (4/91)、GI-7 (TW-I)、GI-24 (Mass)、GI-19 (QX)和GI-18 (LDT3-A))，其中GI-19 (QX)是主要基因型的研究报道是一致的。除我国外，亚欧地区多个国家均有GI-19基因型IBV的流行，包括俄罗斯、哈萨克斯坦和伊朗等[21-23]，这说明GI-19基因型IBV流行株具有较强的传播能力和广泛的地域性。亟需对其基因组特点和生物学特性进行分析研究。本研究选取3株GI-19代表毒株进行全基因组测序分析和致病性进行研究。全基因组测序分析显示3株IBV分离毒株S1全基因序列与GI-19(QX-like)基因型毒株的相似性在95%左右, 具有典型的“花斑肾”致病特点。
Furin酶切位点对IBV基因型具有一定指征性意义。在536位氨基酸处均具有与QX-like基因型毒株相似的Furin酶切位点HRRRR, 这说明GI-19(QX-like)具有典型的Furin酶切位点HRRRR, 而通过比对发现GI-1、GI-7和GI-22的Furin酶切位点为HRFRR，GI-13的Furin酶切位点为HRSRR，GI-18的Furin酶切位点为HRLRR, GI-23的Furin酶切位点为HRTRR，GVI-1的Furin酶切位点为HRRKR。
重组分析显示3株GI-19毒株均存在基因重组事件，这说明基因重组是IBV形成新基因型的重要原因。这与S.W.Thor等研究发现重组位点广泛分布于IBV整个基因组，认为基因重组是IBV不断演化的重要分子机制之一[24]，以及吴翠兰等[25]报道的“当S1蛋白发生基因突变、缺失、插入和重组时会导致新的血清型和基因型出现和流行”的观点是一致的。S1基因的遗传多样性非常高，其演化和变异是引起IBV抗原漂移以及基因型和血清型变化的主要原因，因此成为IBV基因分型的靶基因[9]。对高变区S1基因序列进行了分析，显示3株毒株与国内外疫苗毒株(H120、H52、ArkDPI)和经典毒株(M41、Beaudette)作对比，相似性只有77%左右。E、M和N基因与常用国内外疫苗株、经典株演化遗传距离稍远，不属于同一演化分支。并且通过软件预测S蛋白的B细胞抗原表位，结果显示3株分离株与疫苗毒株H120、经典毒株M41相比，抗原表位的数量和序列均不一致，存在一定的差异性。这说明了现有的经典疫苗株可能已不适用于当下GI-19基因型流行毒株。这也是当下IBV疫苗免疫失败或免疫交叉保护差的重要原因。需选择合适疫苗及研发新型疫苗，才能对IBV疫病进行控制。
GI-19(QX-like)基因型传染性支气管炎病毒对不同日龄SPF鸡均具有一定的致病性，本研究通过对1日龄和15日龄SPF致病性比较研究发现，JS96对低日龄致病性更强，这与文献报道基本一致[26]。仍然以呼吸道症状为主，表现为精神沉郁、打喷嚏、流鼻涕、气管啰音和呼吸困难[27]，此外还会损伤肾脏[28]，导致尿酸盐沉积，严重者出现排白色稀粪。本研究发现IBV通过上呼吸道感染进入机体，可导致气管黏液分泌亢进、纤毛和黏膜上皮脱落和大量炎性细胞增生浸润，可能导致病毒血症而侵染其他组织器官；肺气泡壁淤血出血和细支气管见炎性物质的脱落；肾脏肾小管变性坏死。文献显示QX-like基因型IBV还可以导致肾脏肾小管上皮脱落、盐类晶体沉着以及固有层单核细胞和淋巴细胞浸润[16]；输卵管出现特征性扩张和血清样液体积聚，在扩张的输卵管中，可以看到发育中的褶皱变平和管壁变薄，上皮层或浆膜层下局灶性单核细胞浸润[29]，其他组织器官无明显的病理变化迹象。此外，作者还发现该基因型IBV还可导致鸡群体重下降、生长迟缓。这说明GI-19 (QX-like基因型)IBV引起鸡群发病且生长迟缓，严重危害我国养禽业发展。
鉴于当下流行的QX-like毒株毒力强，传播地域广泛，主要免疫原蛋白S与现有疫苗株相似度低，B细胞表位存在差异和出现基因重组事件的现状。开发QX-like适配性更好的新疫苗迫在眉睫。本研究仅选取3株GI-19毒株进行致病性研究，选取的毒株为2015和2018年分离毒株可能与近3年同基因型流行毒株致病性具有一定差异，后续研究将选取近3年毒株与2015和2018年毒株进行致病性研究，此外，增加其他生物学特性比较分析，为IBV的精准防控提供更可靠的参考。
4 结论本研究对实验室2014—2022年分离的IBV毒株进行了遗传演化研究和致病性研究。遗传演化分析表明，我国主要流行毒株呈现多基因型同时存在，其中GI-19(QX-like基因型)是我国主要优势流行毒株，占比达51.67%。GVI-1次之，其流行呈现增多趋势，需重视关注。挑选的3株GI-19(QX-like)优势基因型IBV毒株与现有的商品疫苗株的主要免疫原蛋白S相似度低，B细胞表位差异明显，流行毒株与疫苗株交叉免疫保护差；3株分离毒株均存在基因重组事件，这说明IBV基因重组易发生基因重组，基因重组是导致IBV变异的重要原因之一。致病性研究显示当下流行的GI-19(QX-like)毒株毒力较较强，对1和15日龄的鸡均有致病性，主要以花斑肾和轻度呼吸道症状为特征，可导致料肉比下降，严重影响养鸡生产性能。本研究掌握IBV基本流行情况，从分子层面阐述了流行优势毒株与现有疫苗适配性差异，亟需开发QX-like适配性更好的新疫苗。
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(编辑 白永平)