猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是一种环状、单股负链DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属^[1]。2016年，Palinski等^[2]在美国通过宏基因组分析，从患有PNDS的病死母猪和流产胎儿中首次发现PCV3。其后，美国、中国、巴西、意大利、韩国、泰国、西班牙、丹麦、德国、瑞典和波兰等许多国家都出现了大量关于检测出PCV3的报道，表明该病毒已快速在全球范围内传播^[3-5]。2017年3月，广东省报道了我国首例PCV3感染病例，此后，在我国多个省份均有关于PCV3的报道^[6-8]。除了在猪体中检测到PCV3外，在犬科动物和其他哺乳动物中也鉴定到PCV3的存在^[9]。Cui等^[10]提出PCV3起源于蝙蝠，鸟类是蝙蝠圆环病毒传播给猪的重要中间宿主，这种传播方式增加了跨物种传播的风险，影响到公共卫生安全。

PCV3的基因组总长为2 000 bp，包含三个主要开放阅读框(open reading frames，ORF)，分别为ORF1、ORF2和ORF3。对不同国家PCV3分离株的基因序列分析显示，全基因组序列和衣壳蛋白(capsid protein，Cap蛋白)的核苷酸相似性分别为97.6%~99.8%和97.5%~100%，表明PCV3的序列高度保守^[11]。进一步分析Cap蛋白的氨基酸序列可知，全球流行的PCV3毒株主要分为PCV3a、PCV3b和PCV3c三种亚型^{[5, 11-12]}，其中PCV3a的流行率正在不断上升^[13]。PCV3基因组中ORF2基因编码的Cap蛋白N端与其它圆环病毒一样，富含高度碱性的精氨酸残基，是猪圆环病毒的主要结构蛋白，能引发特异性免疫反应。因此，Cap蛋白是研发检测方法的首要候选因子。当前检测PCV3常用的方法主要包括PCR与ELISA，进一步使用IHC、原位杂交以及病理观察等加以佐证。已报道文献中ELISA方法以间接ELISA方法为主，但是该方法特异性较差，容易发生交叉反应。

本研究将PCV3的Cap蛋白基因进行原核表达，成功制备得到1株具有良好阻断效果的2E6单克隆抗体。在此基础上，建立了一种阻断ELISA方法，该方法具有较高重复性和特异性，为PCV3检测提供了一种有效的技术手段。

1 材料与方法 1.1 材料

SUMO-Cap重组质粒、PCV3-Cap真核质粒、PCV2-VLP以及PCV3杆状病毒液由本实验室制备与保存，猪圆环病毒3型(PCV3)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等阳性血清以及猪阴性对照血清由本实验室保存。BALB/c小鼠和ICR小鼠订购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，羊抗鼠IgG-HRP购自Cell Signaling Technology，TMB显色液购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 SUMO-Cap重组蛋白的表达与纯化

将SUMO-Cap重组质粒转化到Rosetta感受态细胞中，挑取单菌落摇菌至OD_{600 nm}值为0.4~0.6后，加入终浓度为1 mmol·L^-1的IPTG进行诱导。16 ℃，150 r·min^-1摇菌24 h后，收集菌体超声破碎并进行SDS-PAGE鉴定，确定蛋白表达在沉淀后用尿素透析法纯化，并将纯化后的蛋白进行Western blot鉴定。鉴定成功后，测定蛋白浓度，保存于-80 ℃。

1.3 单克隆抗体的制备、纯化与鉴定

用纯化后的SUMO-Cap重组蛋白100 μg·只^-1免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠，3次免疫后再进行一次冲击免疫。取免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，进行3次亚克隆，采用间接ELISA方法进行筛选，获得阳性杂交瘤细胞株，将细胞扩大培养并制备腹水，将采集后的腹水送至南京钟鼎生物技术有限公司进行纯化与HRP酶标。用pCold-SUMO空载作为阴性对照，PCV2-VLP作为无关蛋白对照，进行Western blot鉴定。将PCV3-Cap真核质粒转染PK-15细胞，用制备的单抗作为一抗，进行间接免疫荧光(IFA)检测，以此来鉴定单抗的特异性。

1.4 阻断ELISA方法的建立与最佳反应条件的优化

根据方阵滴定法，以2、1.5、1.0、0.5、0.25 μg·mL^-1蛋白浓度100 μL·孔^-1进行抗原包被；抗原包被条件分为37 ℃ 2 h、4 ℃ 12 h以及37 ℃ 2 h转至4 ℃ 12 h三种方法；PBST洗3次，封闭液选择1%BSA、2%BSA、5%脱脂乳、2%明胶，200 μL·孔^-1在37 ℃下进行封闭，封闭时间设置为1、2和3 h；PBST洗3次，阳性血清和阴性血清按照1 ∶1、1 ∶5、1 ∶10、1 ∶50进行稀释，100 μL·孔^-1加入后，在37 ℃下作用时间分为0.5、1、1.5、2、2.5 h；PBST洗3次，酶标单抗按照1 ∶2 000、1 ∶2 500、1 ∶3 000、1 ∶3 500进行稀释，100 μL·孔^-1加入后，在37 ℃下作用时间分为0.5、1、1.5、2 h；PBST洗3次，避光加入100 μL·孔^-1的TMB，在37 ℃下作用时间分为5、10、15、20、25 min；显色结束后，加入50 μL·孔^-1终止液。酶标仪测定OD₄₅₀值，阻断率(PI)=(阴性血清OD_{450 nm}值-被检血清OD_{450 nm}值)/阴性血清OD_{450 nm}值×100%。

1.5 阻断ELISA方法临界值的确定

用建立的阻断ELISA方法检测50份已知的PCV3阴性血清，计算PI的平均值(x)与标准差(s)，然后以x +2 s和x +3 s的值确定临界值。

1.6 特异性试验

按照已经优化好条件的阻断ELISA方法检测猪圆环病毒3型(PCV3)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清，重复3次取平均值后计算PI，以此评判该方法的特异性。

1.7 敏感性试验

将3份PCV3阳性血清进行连续倍比稀释，用建立的阻断ELISA方法进行检测，以此评判该方法的敏感性。

1.8 重复性试验

使用同一批次包被的酶标板检测3份PCV3阳性血清，重复3次，计算批内变异系数。包被3批不同批次的酶标板，检测3份阳性血清，重复3次取平均值，计算批间变异系数。综合上述结果，评判该方法的重复性。

1.9 符合率试验

用本研究建立的阻断ELISA方法与IPMA方法相对比，检测150份猪血清样品，根据公式计算Kappa值。当0＜Kappa≤0.4时，说明试验的一致性较差；当0.4＜Kappa＜0.75时，说明试验具有中度的一致性；当Kappa≥0.75时，说明试验具有高度的一致性。IPMA试验方法如下：将Sf9细胞铺于96孔板中，细胞汇合度为80%以上时，将PCV3杆状病毒液加入到细胞中培养48 h，弃掉培养基，每孔加入含1%H₂O₂的甲醇进行固定，15 min后弃掉固定液，PBST洗3次，5%脱脂乳200 μL·孔^-1，4 ℃封闭过夜。弃掉封闭液，PBST洗3次，加入0.5%Triton X-100进行透膜，PBST洗3次，待检血清进行1 ∶100稀释，100 μL·孔^-1加入到细胞板中，37 ℃作用1 h。PBST洗3次，用1 ∶5 000稀释HRP标记的羊抗猪酶标二抗，100 μL·孔^-1加入到细胞板中，37 ℃作用45 min。PBST洗3次，100 μL·孔^-1加入AEC显色液，37 ℃避光作用15 min，用超纯水洗3次，观察结果。显红色说明血清为阳性，不显色说明血清为阴性。

2 结果 2.1 目的蛋白的纯化与鉴定

SDS-PAGE结果显示，SUMO-Cap重组蛋白主要存在于包涵体中，经包涵体纯化后可得到纯度较高的蛋白，相对分子质量大小约为40 ku(图 1A)，与预期结果一致。Western blot结果表明，纯化后的重组蛋白可与PCV3猪源阳性血清发生特异性反应(图 1B)。

2.2 单克隆抗体的纯化与鉴定

多次亚克隆筛选后得到杂交瘤细胞株2E6，制备腹水使用ProteinA/G的方法纯化获得抗体(图 2A)。Western blot结果表明，得到的单克隆抗体可与SUMO-Cap重组蛋白发生特异性反应(图 2B)。IFA结果显示，2E6单克隆抗体与PCV3具有良好的反应性(图 2C)。

2.3 阻断ELISA最佳反应条件的优化

通过不断优化阻断ELISA的反应条件，确定了最佳条件如下：抗原包被浓度为0.5 μg·mL^-1，包被条件为37 ℃ 2 h转至4 ℃ 12 h；最佳封闭剂为5%脱脂乳，封闭条件为37 ℃ 3 h；血清稀释度为1 ∶1，反应条件为37 ℃ 2.5 h；酶标单抗最佳稀释度为1 ∶3 000，反应条件为37 ℃ 1 h；TMB的最佳反应条件为37 ℃ 15 min。

2.4 临界值的确定

按照优化后的阻断ELISA方法检测50份已知PCV3的阴性血清，如表 1所示，平均阻断率为14.81%，标准差为6.74%，x +2 s=28.30%，x +3 s=35.05%。综上可得：当PI≤28.30%时，判定结果为阴性；当PI≥35.05%时，判定结果为阳性；当28.30%＜PI＜35.05%时，判定为可疑，重复一次试验后如果结果仍为可疑，则判定为阳性。

2.5 特异性检验

使用本试验中建立好的阻断ELISA方法检测PCV3、PCV2、PRV、PRRSV和CSFV抗体阳性血清，结果如图 3所示，PCV3阳性血清的PI值为83.12%，其他病原的阳性血清PI值均小于28.30%，由此说明该方法的特异性较好。

2.6 敏感性检验

将3份PCV3阳性血清进行倍比稀释，按照已经优化好的阻断ELISA方法进行检测，结果如图 4所示，检测效价可达到1 ∶128。

2.7 重复性检验

使用建立好的阻断ELISA方法检测3份PCV3阳性血清，进行批内和批间重复，结果如表 2、3所示，批内变异系数为0.46%~0.92%，批间变异系数为1.29%~4.11%，两者的变异系数均小于10%，说明该方法具有良好的重复性。

2.8 符合率检验

2.8.1 IPMA法检测PCV3阳性血清 　　将PCV3杆状病毒液感染Sf9细胞48 h后，待检临床猪血清作为一抗，二抗使用HRP标记的羊抗猪酶标二抗，用AEC法显色。如图 5所示，不显色说明血清为阴性，显红色说明血清为阳性。

2.8.2 比对试验 　　使用本研究中优化后的阻断ELISA方法，与本实验室前期建立的IPMA方法同时检测150份猪血清样品，根据公式计算Kappa值，结果如表 4所示，与IPMA方法比对，计算得到的Kappa值为0.9。该阻断ELISA方法与IPMA方法比对后的Kappa值大于0.75，说明该方法具有良好的符合率。

3 讨论

当猪体感染PCV3后，据文献报道主要损伤的是呼吸与消化系统^{[7, 14]}。与此同时，会引起肠道微生物群的动态变化，破坏了菌群的平衡，其次伴随着渗出性皮炎等症状^[15-16]。PCV3存在垂直传播，会穿过胎盘屏障并且在胎儿的组织内复制，产生较高的病毒载量，甚至导致怀孕母猪出现死胎与木乃伊胎^[17-20]。PCV3持续性病毒血症的出现，增加了再次感染的可能性，虽然病毒可能在猪体内长时间存在，但却不会表现出明显的临床症状^{[11, 21-23]}。不同阶段的猪均可以检出PCV3，在木乃伊胎儿中的比例最高，该病毒可能是导致繁殖失败的原因之一^[24-25]。研究表明，PCV3可感染多种动物，不只局限于猪^[9]。由于该病毒存在众多的中间宿主，此特性也为其在种间传播提供了可能，将对养猪业的健康发展造成了巨大的威胁。

在临床检测中，PCV3会出现病毒血症，部分猪体在咽拭子与肛门拭子中也可检出PCV3阳性^[26]。关于PCV3病毒载量的测定，淋巴结中的病毒载量明显高于肺和其他组织^[4]。该病毒具有广泛的组织嗜性，使用免疫组织化学法(IHC)，可在感染PCV3猪体的肾、肺以及淋巴结中观察到病原的位置^[27-28]。当前检测PCV3常用的方法有PCR、ELISA、IHC、原位杂交以及组织病理学观察等^[29-30]。

目前，尚无有效预防PCV3感染的相关疫苗以及治疗药物，这为防范PCV3的感染增加了难度^[31]。加强猪场的日常管理与环境卫生是预防PCV3的主要手段，做到尽早发现并快速阻止病毒的进一步扩散^[32]。因此，实时监测临床中PCV3的流行情况，持续分析相关分子流行病学动态变化是至关重要的。本研究中的重组蛋白有大规模可获得性且操作简便等优点，将重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6，以此制备腹水得到的单克隆抗体具有构象表位，可识别具有空间结构的PCV3病毒粒子，为后期对PCV3的深入研究提供了有利的条件。此外，市面上并没有特异性较好的商品化阻断ELISA抗体检测试剂盒，本研究中建立的方法特异性较高，与PCV2、PRV、PRRSV、CSFV抗体阳性血清均不发生反应；具有可重复性，批内变异系数为0.46%~ 0.92%，批间变异系数为1.29%~4.11%，两者的变异系数均小于10%；该方法与IPMA方法比对后的Kappa值均大于0.75，说明该方法具有良好的符合率；能够快速检测出PCV3抗体的存在，可应用于猪场的日常管理中。与此同时，应该尽快开发出针对性强的疫苗，不断提高对PCV3的防控，减少养殖过程中引发的经济损失。

4 结论

本研究成功筛选到1株具有良好阻断效果的猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体，并在此基础上建立了一种具有较高重复性和特异性的阻断ELISA检测方法，为临床PCV3流行病学调查提供了技术支撑。