畜牧兽医学报  2024, Vol. 55 Issue (1): 87-98. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.01.010    PDF    
北京黑猪AQP9和RPS10基因多态性及其与背膘厚的关联分析
祝雪丽1,2, 张龙超1, 王立贤1, 蒲蕾2,3, 刘欣1     
1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;
2. 天津农学院动物科学与动物医学学院, 天津 300384;
3. 天津市绿色生态饲料重点实验室, 天津 301800
摘要:旨在研究水通道蛋白9(aquaporins9,AQP9)及核糖体蛋白10(ribosomal protein S10,RPS10)基因多态性及其与北京黑猪背膘厚的相关性,以期能够获得北京黑猪背膘厚的有效标记。本研究以413头北京黑猪为研究对象,测定不同部位(肩部、6-7肋间、胸腰结合、腰荐结合)的背膘厚度。PCR扩增AQP9和RPS10基因的启动子区和外显子区序列筛选SNP位点,并将SNPs与各部位背膘厚进行关联分析。运用荧光定量PCR检测基因的差异表达。结果发现,AQP9基因启动子区有4个突变位点,其中1个SNP:rs332699245 A>C与胸腰结合处背膘厚关联显著(P<0.05),且该位点突变预测到了结合转录因子的改变;RPS10基因在3'UTR、CDS区共有8个突变位点,其中5个与背膘厚显著关联:rs80795904 C>G、rs80932213 T>C与6~7肋间背膘厚关联显著(P<0.05),rs3469834461 C>T与肩部背膘厚、四点平均背膘厚关联显著(P<0.05),rs80862457 C>T与胸腰结合处背膘厚、腰荐结合处背膘厚关联显著(P<0.05),rs336938272 A>C与6~7肋间背膘厚、腰荐结合处背膘厚、四点平均背膘厚均关联显著(P<0.05);且在3'UTR区检测到1个SNP(rs80862457 C>T),位于小RNA(microRNA,miRNA)结合靶点。基因表达差异分析表明,rs332699245 A>C中AA型个体的AQP9基因mRNA水平显著高于AC型个体(P<0.05),rs80862457 C>T中TT型个体的RPS10基因mRNA水平显著高于CC型个体(P<0.05)。综上所述,AQP9和RPS10基因与北京黑猪背膘厚显著关联,rs332699245 A>C和rs80862457 C>T位点可作为北京黑猪背膘厚选育的潜在分子标记,为北京黑猪的选育提供理论支撑。
关键词北京黑猪    AQP9    RPS10    背膘厚度    关联分析    
Association Analysis of AQP9 and RPS10 Gene Polymorphisms with Backfat Thickness in Beijing Black Pigs
ZHU Xueli1,2, ZHANG Longchao1, WANG Lixian1, PU Lei2,3, LIU Xin1     
1. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China;
3. Tianjin Key Laboratory of Green Ecological Feed, Tianjin 301800, China
Abstract: This study aimed to explore the gene polymorphisms of aquaporins9 (AQP9) and ribosomal protein S10 (RPS10) and their correlation with backfat thickness in Beijing black pigs, in order to obtain effective markers of backfat thickness in Beijing black pigs. The backfat thickness of 413 Beijing black pigs was measured at different parts (shoulder, 6-7 intercostal, thoracolumbar, lumbosacral). The promoter and exon sequences of AQP9 and RPS10 genes were amplified by PCR to screen SNP sites, and the association between SNPs and backfat thickness was analyzed. Differential gene expression was detected by fluorescence quantitative PCR. The results showed that there were 4 mutation sites in the promoter region of AQP9 gene, among which one SNP, rs332699245 A>C, was significantly associated with backfat thickness at the thoracolumbar (P<0.05), and the mutation of this site predicted the change of binding transcription factors. There were 8 mutation sites of RPS10 gene in 3'UTR and CDS region, 5 of which were significantly associated with backfat thickness: rs80795904 C>G and rs80932213 T>C were significantly correlated with 6-7 intercostal backfat thickness (P<0.05), rs3469834461 C>T were significantly correlated with shoulders backfat thickness and 4 regions average backfat thickness (P<0.05), rs80862457 C>T was significantly associated with backfat thickness at the thoracolumbar and lumbosacral (P<0.05), and rs336938272 A>C was significantly associated with 6-7 intercostal backfat thickness, backfat thickness at lumbosacral and 4 regions average backfat thickness (P<0.05). One SNP (rs80862457 C>T) was detected in the 3'UTR region, which was located at the binding target of small RNA (miRNA). Analysis of gene expression differences showed that the AQP9 mRNA expression of AA type individuals in rs332699245 A>C was significantly higher than that of AC type individuals (P<0.05), and the RPS10 mRNA expression of TT type individuals in rs80862457 C>T was significantly higher than that of CC type individuals (P<0.05). In summary, AQP9 and RPS10 genes were significantly associated with backfat thickness of Beijing black pigs, and rs332699245 A>C and rs80862457 C>T sites can be used as potential molecular markers for backfat thickness breeding of Beijing black pigs, providing theoretical support for breeding of Beijing black pigs.
Key words: Beijing black pigs    AQP9    RPS10    backfat thickness    association analysis    

生猪养殖在我国畜牧业中占有较大的比重,仅2021年年底全国生猪出栏量已达4亿多头[1]。过去几十年来,为了提高生产效率,猪的选择主要集中在胴体瘦肉率和生长性状上[2]。近年来,多以体脂、肌内脂肪作为猪肉品质的研究对象[3]。然而猪生长速度提高的同时,却降低了猪的肉质性状,导致适口性差,缺少风味,降低了消费者的满意度。肌内脂肪(IMF)与皮下脂肪(BF)是家畜的两个主要脂肪库[4],同时多项研究表明,食肉最佳的肌内脂肪含量为2%~3.5%[5]。因此,如何在稳定皮下脂肪含量、提高瘦肉率的情况下,提高肌内脂肪含量,是当今猪业生产中需要解决的问题。

本研究所关注的水通道蛋白,目前已在哺乳动物中发现13种(AQP0~AQP12),按功能可以分为传统的水通道蛋白[6]和甘油水通道蛋白(可以通透中性溶质如甘油、其他小的非离子物质和水)[7]。水通道蛋白9(aquaporin9,AQP9)属于甘油水通道蛋白一类,于1998年首次在人类白细胞和大鼠肝脏中被发现[8],较其他水通道蛋白更易通透水、甘油等小分子溶质[9]。另在小鼠研究中发现AQP9主要在肝脏中表达,参与甘油转运,是血浆甘油转运的主要通道[10]。AQP9促进肝脏的甘油摄取并代谢为脂肪合成中间产物3-磷酸甘油,将脂解产生的甘油运输进肝脏,将肝脏中3-磷酸甘油运输进血浆参与脂肪合成,有效的将脂解与脂肪合成通过甘油连接起来[11]。同时,甘油在血浆与肝脏间转运的增强,也促使机体内AQP9表达量的增加[12]。另有研究表明,AQP9是氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的靶基因,PPARαPPARγ作为典型的成脂相关基因,其表达量均影响AQP9的表达[13]。综上,可以推断AQP9可能是影响动物脂肪沉积的潜在基因。

核糖体蛋白(ribosomal protein, RP)是真核生物核糖体的重要组成成分,参与蛋白质的合成[14],是核糖体小亚基的组成蛋白,属于核糖体蛋白家族成员[15]。RPS10的甲基化对核糖体的蛋白质合成、细胞增殖过程的调节具有重要作用[16]。有诸多研究报道了RPS10与猪的生产性状相关,在对中国东乡斑点猪的两个外部性状(斑点毛色和面部类型)进行全基因组关联分析(GWAS)中也发现RPS10是影响面部变异的潜在基因[17]。Lü等[18-19]在研究中指出,RPS10可能与猪的骨骼生长及体型有关。将恩施黑猪的基因组库与中国野猪的全基因组结合,鉴定了嵌入到恩施黑猪基因组中的400多个蛋白质编码基因,并将包括RPS10在内的5个基因列为与猪肉脂肪沉积相关的候选基因[20]。因此,可以推测RPS10对猪的脂肪沉积有影响。

本研究所采用的北京黑猪是我国著名的培育品种,由通县猪等本地猪与大白猪杂交形成[21],其肌内脂肪含量可达到3%,肉质优良,风味独特深受消费者欢迎[22]。然而北京黑猪因含地方猪血统,背膘较厚,因此需对其背膘厚开展研究。在本课题组的前期研究中,通过对背膘厚极端差异组进行转录组分析,确定了AQP9基因为脂肪沉积相关的候选基因[23]。对大白、民猪杂交群体6~7肋间背膘厚进行GWAS,注释到SSC7上多个SNPs,并在连锁不平衡(LD)区间发现了RPS10基因[24]。上述两基因虽已被确定为影响背膘厚度的候选基因,但其在北京黑猪的多态性及与背膘厚的相关性尚不清楚。本研究通过对AQP9和RPS10基因进行突变位点检测,并开展基因型与背膘厚度性状的关联分析,以期筛选到影响北京黑猪背膘厚的候选功能位点,为今后北京黑猪背膘厚度性状的分子选育提供标记,并为背膘厚的遗传机制研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 组织样本及表型数据收集

本研究所用413头北京黑猪均来自北京黑六牧业科技有限公司,屠宰后使用游标卡尺测量试验猪右侧胴体背部脂肪不同位置(肩部、6~7肋间、胸腰结合处、腰荐结合处)的背膘厚度,从左侧胴体采集背部脂肪样品于液氮速冻后,-80 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取

使用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kti)从组织样本中提取基因组DNA,利用超微分光光度计(IMPLEN)检测DNA浓度,并用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量评估,检测合格的DNA样品存放于-20 ℃冰箱中。

1.3 RNA提取

对组织样品进行研磨,并使用RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)进行RNA提取,随后通过超微分光光度计(IMPLEN)检测其浓度及质量。对于合格的RNA,用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit)进行反转录,反转好的cDNA样品置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 引物设计及合成

利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI,http://www.ncbi.nim.nih/)的基因序列对AQP9(Gene ID: 100127153)和RPS10(Gene ID: 100155444)的启动子及外显子区域共设计22对引物,部分引物见表 1,设计好的引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成。

表 1 PCR引物信息 Table 1 PCR primers information
1.5 聚合酶链式反应(PCR)及基因分型

对413头北京黑猪进行PCR扩增,反应体系:(2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,DNA 1 μL,dNTP 0.5 μL,上、下引物各1 μL,聚合酶0.5 μL,RNase-free水8.5 μL)。PCR反应程序如下:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,57~62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30~90 s,35个循环;72 ℃延伸2 min。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后,由北京六合华大基因科技有限公司进行Sanger测序。

1.6 AQP9和RPS10基因表达量的检测

利用NCBI(http://www.ncbi.nim.nih/)的基因序列对AQP9和RPS10基因设计荧光定量PCR引物,引物见表 2,设计好的引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

表 2 RT-qPCR引物信息 Table 2 RT-qPCR primers information

GAPDH基因为内参,反转录后的cDNA为模板,开展实时荧光定量PCR,检测AQP9、RPS10基因的表达。采用20 μL反应体系:10 μL TB Green,0.4 μL PCR Forward Primer,0.4 μL PCR Reverse Primer,0.4 μL ROX Reference Dye П,2 μL模板,6.8 μL无菌水。RT-qPCR反应条件为:预变性阶段(95 ℃ 30 s);扩增阶段(95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 共40循环);建立熔解曲线阶段(60~95 ℃,每10 s缓慢升温0.5 ℃)。

1.7 数据统计分析

利用Excel 2016对基因型频率和各位点的等位基因频率进行统计。分别计算各突变位点的多态信息含量、杂合度及哈代-温伯格平衡检验。使用SAS9.4软件进行不同基因型个体间背膘厚的差异显著性分析(P<0.05), 采用混合线性模型,加入体重作为协变量,利用协方差分析法,具体模型如下:

$ Y_{i j}=\mu+G_i+b W+e_{i j} $

其中,Yij表示性状测定值;μ表示群体均值;Gi表示基因型效应;W表示体重协变量效应;b为协变量的回归系数;eij为随机误差。

采用2-ΔΔCt法计算AQP9、RPS10基因的相对表达量(以GAPDH基因为内参),采用T检验评估不同基因型间定量表达结果差异的显著性(P<0.05)。

1.8 突变位点功能预测

使用转录因子结合谱数据库(A database of transcription factor binding profiles, JASPAR)预测AQP9基因启动子区转录因子结合位点,及突变前后转录因子的变化。使用miRDB(miRDB-Custom Prediction)分析RPS10基因3′UTR区潜在的miRNA结合位点。

2 结果 2.1 表型数据整理

对413头北京黑猪的肩部背膘厚、6~7肋间背膘厚、胸腰结合处背膘厚、腰荐结合处背膘厚、四点平均背膘厚的测定结果进行统计分析,均值分别为3.86、3.07、2.57、2.74、3.07 cm(表 3)。

表 3 北京黑猪不同部位背膘厚度性状的表型值统计 Table 3 Statistics of phenotypic values of backfat thickness traits at different parts of Beijing black pigs
2.2 AQP9和RPS10基因SNP位点基因型频率及群体遗传特征

通过对AQP9和RPS10基因的启动子区及外显子区进行PCR扩增,最终在AQP9和RPS10基因共发现12个突变位点(表 4表 5)。其中AQP9中有4个突变位点位于启动子区,而RPS10中有8个突变位点,包括7个突变位置在3′UTR区,1个在CDS区。AQP9和RPS10基因突变位点的基因型频率和群体遗传特性,见表 4表 5。全部12个SNPs的基因型频率变化范围在1%~87%,等位基因变化频率为7%~92%。该群体中rs80862457 C>T、rs80795904 C>G、rs80932213 T>C、rs3469834461 C>T、rs3469834461 C>A显示了中等多态性(0.25 < PIC < 0.5),处于哈代-温伯格平衡状态(P>0.05),因此选择潜力较大。

表 4 AQP9基因多态位点群体遗传特性 Table 4 Population genetic characteristics of AQP9 SNPs
表 5 RPS10基因多态位点群体遗传特性 Table 5 Population genetic characteristics of RPS10 SNPs
2.3 AQP9、RPS10基因多态性和不同部位背膘厚性状的关联分析

AQP9和RPS10基因筛选出的12个SNPs位点与猪的肩部背膘厚、6~7肋间背膘厚、胸腰结合处背膘厚、腰荐结合处背膘厚、四点平均背膘厚进行关联分析(表 6表 7)。在AQP9的4个启动子区突变中,rs332699245 A>C与胸腰结合处背膘厚度显著关联(P<0.05),其余3个位点与各个部位背膘厚度关联均不显著。在RPS10的8个SNPs中,7个位于3′UTR区的突变位点中,有4个SNPs与背膘厚度显著相关(P<0.05),分别是:rs80862457 C>T与胸腰结合处背膘厚、腰荐结合处背膘厚均显著关联;rs80795904 C>G和rs80932213 T>C与6~7肋背膘厚显著关联;rs3469834461 C>T与肩部背膘厚和四点平均背膘厚均显著关联。另位于CDS区的位点rs336938272 A>C与6~7肋背背膘厚、腰荐结合处背膘厚、四点平均背膘厚均显著关联(P<0.05)。

表 6 AQP9基因SNPs与背膘厚度性状的关联分析 Table 6 Association analysis of AQP9 gene SNPs with backfat thickness
表 7 RPS10基因SNPs与黑猪背膘厚度性状的关联分析 Table 7 Association analysis of RPS10 gene SNPs with backfat thickness
2.4 SNPs位点突变功能分析

使用JASPAR (https://jaspar.genereg.net/)分析AQP9基因启动子区与背膘厚显著关联的SNP rs332699245 A>C潜在的转录因子(Transcription Factor,TF)结合位点。结果显示,rs332699245 A>C位于转录因子SPI1的结合位点处。

使用miRDB(miRDB-Custom Prediction)预测RPS10基因位于3′UTR区的4个与背膘厚显著关联的突变位点(rs80862457 C>T、rs80795904 C>G、rs80932213 T>C、rs3469834461 C>T)中潜在的miRNA结合位点,发现rs80862457 C>T为miR-6777-5p的结合位点。

2.5 AQP9 rs332699245 A>C和RPS10 rs80862457 C>T不同基因型个体的基因表达差异分析

根据rs332699245 A>C位点AA型和AC型个体背膘厚差异显著,利用RT-qPCR技术检测AA与AC型个体背膘组织中AQP9基因的表达情况。结果显示,AA基因型个体的AQP9表达量显著高于AC型个体(P<0.05),见图 1

*.P<0.05。下同 *.P<0.05. The same as below 图 1 AQP9基因相对表达量 Fig. 1 Relative expression of AQP9 gene

根据rs80862457 C>T位点AA和CC型个体背膘厚差异显著,利用RT-qPCR技术检测了CC与TT型个体背膘组织中RPS10基因的表达情况。结果显示,TT基因型个体的RPS10表达量显著高于CC型个体(P<0.05),见图 2

图 2 RPS10基因相对表达量 Fig. 2 Relative expression of RPS10 gene
3 讨论

背膘厚对猪的胴体性状、繁殖性能、肉质性状等均有影响, 是评价胴体瘦肉率、育肥效果、繁殖性能等重要性状的指标。关红民等[25]研究表明,背膘厚与胴体瘦肉率呈高度负相关,可以作为衡量瘦肉率的指标。育肥猪背膘厚增加可以提高背最长肌的肌内脂肪含量、风味和多汁性,从而影响猪肉品质[26]。此外,背膘厚在各品种间存在显著差异[27],是重要的数量性状[28]。本研究所用北京黑猪在pH、保水力、嫩度等肉质指标上相比于长白猪、大约克猪等外来瘦肉型猪种有较大优势[29],但存在中国地方猪种背膘较厚、生长速度较慢的问题[30]。因此,对北京黑猪背膘厚遗传机制的研究是必要的。

目前,研究人员在不同猪种上均发现了与背膘厚显著相关的SNPs。吴正常等[31]在丹系大白猪上利用55K SNP芯片对背膘厚性状进行全基因组关联分析(GWAS),筛选出2个与背膘厚显著相关的SNPs,发现4个候选基因;Zhu等[32]对一个大白、长白杂交群体进行全基因组关联分析,在7条染色体上检测到25个与背膘厚显著关联的SNPs;刘欣[33]在576头长白猪、民猪的杂交群体中发现与6~7肋背膘厚度显著相关的35个SNPs位点。本课题组前期研究中也发现了AQP9、RPS10均为影响北京黑猪背膘厚的候选基因,但并未明确上述两基因多态性与北京黑猪背膘厚的相关性关系,因此,本研究对AQP9、RPS10不同多态位点与背膘厚度进行了分析,为之后北京黑猪背膘厚的分子育种提供了理论依据。

AQP9在维持体内能量代谢与平衡、脂肪合成以及个体的生长发育等方面都具有至关重要的作用。本研究在北京黑猪群体中对AQP9基因的4个SNPs位点与背膘厚度性状进行关联分析,结果发现仅有rs332699245 A>C位点与胸腰结合处背膘厚显著相关。基因表达差异分析表明,rs332699245 A>C中AQP9基因mRNA水平表达量AA基因型个体显著高于AC基因型个体。脂肪的生成及分化受到多种转录因子(transcription factor,TF)的影响,转录因子(TF)是人类中存在的最大的蛋白质组之一, TF直接控制基因表达。AQP9启动子区的rs332699245 A>C被预测为TF结合位点,该位点的突变导致出现新的转录因子SPI1的结合位点。转录因子沙门氏菌致病岛1(SPI1)是ETS家族的重要成员,它首先在弗里德氏小鼠红细胞白血病中被鉴定为一个促癌基因[34]。SPI1是一种造血转录因子,经鉴定可促进糖酵解过程,通过促进有氧糖酵解促进癌症进展,该转录因子通过影响糖酵解,进而影响脂肪的合成[35]。但其在猪上的功能尚不清楚,仍需后续研究。

据报道,RPS10与猪的生长性状(肌肉生长、脂肪沉积)有强的相关性[20]。本研究在北京黑猪群体中对RPS10基因的8个位点与各部位背膘厚度性状进行关联分析,并发现5个(rs3469834461 C>T、rs80932213 T>C、rs80795904 C>G、rs80862457 C>T、rs336938272 A>C)SNPs与背膘厚显著关联。基因表达差异分析表明,rs80862457 C>T不同基因型个体背膘组织中RPS10基因mRNA表达量在TT基因型个体显著高于CC基因型个体。在RPS10的3′UTR区域的突变位点(rs80862457 C>T)通过预测被确定为潜在的miR-6777-5p的结合位点。miRNAs是真核生物中具有竞争性和靶向调控作用的非编码RNA[36],长度约为19~25个核苷酸[37],大多数的miRNA位于蛋白编码基因的3′UTR区域[38]、内含子区域,参与生物胚胎发育、脂质代谢、神经调节等多种调控过程[39]。miRNA主要是通过与靶基因mRNA碱基配对达到使mRNA降解或阻碍蛋白质翻译,调控个体的生理活动[40]。有研究表明,miRNA是肌肉和脂肪组织代谢平衡的关键调节因子[41],也可作为脂代谢调节的潜在媒介[42],主要通过抑制脂代谢靶基因的翻译从而影响脂肪、胆固醇的合成等过程。在脂肪生成过程中可以加速或抑制脂肪细胞分化,调节脂肪发育[43],miR-122-5p、miR-142-3p、miR-143等已被报道是脂肪沉积的调节因子[44-45]。miR-6777-5p在人类青光眼的临床症状中被观察到,并被证明参与了青光眼发病机制的调控[46]。但其在猪上的功能研究尚不完全,仍需后续完善。

4 结论

通过对413头北京黑猪开展AQP9和RPS10基因多态性与背膘厚性状的关联分析,共发现12个SNPs位点,其中AQP9基因内发现4个SNPs,RPS10基因内发现8个SNPs。关联分析结果表明,AQP9基因内1个SNP(rs332699245 A>C)与背膘厚显著关联;RPS10基因内5个SNPs(rs3469834461 C>T、rs80932213 T>C、rs80795904 C>G、rs80862457 C>T、rs336938272 A>C)与背膘厚显著关联。AQP9基因rs332699245 A>C和RPS10基因rs80862457 C>T不同基因型个体间基因表达差异显著。本研究结果为猪AQP9、RPS10基因调控背部脂肪含量的分子机理提出了新见解,以期探索调控性状变异的候选基因功能位点,为进一步阐述性状变异的遗传机理奠定基础,为北京黑猪的分子遗传育种提供理论参考。

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(编辑   郭云雁)