2. 新疆动物疫病研究重点实验室, 乌鲁木齐 830013;
3. 新疆畜牧科学院兽医研究所, 乌鲁木齐 830013;
4. 新疆农业大学畜牧学博士后流动站, 乌鲁木齐 830052;
5. 新疆草食动物新药研究与创制重点实验室, 乌鲁木齐 830052
, WEI Yurong2,3, XU Chenghui1,5, YANG Tong1,5, SHI Huijun1,5, FU Qiang1,5, YANG Li1,4,5
2. Xinjiang Key Laboratory of Animal Disease Research, Urumqi 830013, China;
3. Institute of Veterinary Medicine, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830013, China;
4. Postdoctoral Station of Animal Husbandry, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China;
5. Xinjiang Key Laboratory of Herbivore New Drug Research and Creation, Urumqi 830052, China
肠道炎症性疾病是家禽生长过程中面临的重要问题，对家禽生长发育有重大影响[1]。沙门菌是引起家禽肠道炎症主要原因之一，其定植在家禽消化道内并侵袭黏附在肠道宿主细胞内，引起细胞膜皱褶和细菌内化，阻断宿主分泌的抗炎和抑菌因子的传递，进而在肠细胞内的囊泡中增殖，不断改变肠道形态造成肠绒毛脱落影响肠道功能，最终诱导肠道炎症[2-3]。近年来，研究发现93%的鸡场可检测出沙门菌，而疾病预防控制中心报告的病例，肠炎沙门菌是引起疾病的主要血清型之一[4-5]。肠炎沙门菌不仅会造成肉鸡肠炎性腹泻、采食量下降、生长速度减缓还会导致鸡蛋受污染，严重影响了家禽及其副产品的生产。目前，应对沙门菌感染主要以预防控制为主，主要体现在在饲料中添加抗生素。但随着消费者对食品安全的关注日益增加，各国随后颁布关于禁止使用抗生素生长促进剂的相关法规，迫使畜牧业急需开发安全有效、提高机体免疫能力、预防疾病和控制食源性病原体的绿色添加剂作为抗生素替代品，也是未来几年控制食源性致病菌和改善动物肠道健康、推动家禽业向前发展的战略重点和研究领域[6-7]。
小檗碱(berberine, BBR)又称黄连素，是中药黄连中分离出的一种异喹啉类生物碱，在临床上具有抗腹泻、抗菌、抗炎[8-9]、抗肿瘤[10]和调节血糖[11]等功效，可用于治疗消化、心血管、神经系统等多种疾病[12-13]。研究表明小檗碱可通过抑制细菌和毒素、抑制分泌和蠕动、保护肠上皮屏障等方式改善消化系统疾病，可用于治疗消化性溃疡、胃炎、肠炎等消化系统疾病[14]。目前对于BBR的药物活性研究主要集中在小鼠或大鼠的疾病模型以及人的临床治疗中，以家禽为研究对象研究其药物疗效的鲜有报道。本课题前期发现BBR可有效缓解家禽肠道炎症反应，但其作用机制尚不明确[15]。因此，本研究利用网络药理学、分子对接和分子模拟等技术初步分析和筛选BBR在治疗家禽肠道炎症中的关键作用靶点，后续建立肉鸡肠道炎症模型初步验证小檗碱治疗肠炎的分子作用机制，为小檗碱预防和治疗肠炎提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 网络药理学部分1.1.1 小檗碱靶点筛选 通过pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取BBR的3D结构后利用PharmMapper数据库(http://www.lilac-ecust.can/pharmmaper)和Swisstargets数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行靶点预测，筛除重复靶点，并通过uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)将预测靶点名称转换为基因名。
1.1.2 疾病靶点的预测与筛选 以“ulcerative colitis、enteritis、colitis”为关键词在GeneCards数据库(http://www.genecards.org)中查找肠炎靶点，筛除重复靶点，构建肠炎靶点数据库。
1.1.3 PPI网络图的构建及核心靶点的筛选 使用Venny2.1.0在线工具绘制出药物和疾病靶点韦恩图并取交集，将交集靶点录入String数据库(http://www.string-db.org)中，设置物种“Homo sapiens”，分析结果导入并Cytoscape3.8.2软件构建蛋白质相互作用(PPI)网络，对其进行分析，根据度值(degree)筛选核心靶点，degree越大该靶点越核心。
1.1.4 GO与KEGG富集分析 将药物与疾病的交集靶点导入DAVID生物信息数据库(http://david.abc.ncifcrf.gov/)中进行GO功能与KEGG通路富集。通过微生信在线网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行绘图。
1.1.5 分子对接及动力学模拟 在PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取BBR的3D结构，在PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中下载靶点蛋白晶体结构，并利用Protein Preparation Wizard对蛋白质进行去除结晶水、补加氢原子等优化处理。根据SP方法(Standard Precise)进行分子对接，计算结合能，若结合能≤-5 kJ·mol-1，可推测BBR与相应靶点蛋白存在较强的相互作用。使用Desmond版本2020对蛋白与化合物复合物进行分子动力学模拟。
1.2 试验部分1.2.1 试验材料和仪器 肠炎沙门菌(由新疆农业大学苏战强教授馈赠)；小檗碱(中国食品药品检定研究院，编号：110713)。
1.2.2 动物 1日龄三黄鸡120只和基础饲粮均购自天康生物公司。
1.2.3 试验方法 将120只1日龄的三黄鸡(均为公鸡)，随机分为4组，每组30只，分别为对照组(C)、BBR给药组(B)、沙门菌攻毒模型组(S)和BBR治疗组(BS)。试验期间，所有仔鸡均处于同一温度可控的房间内，为避免交叉感染采用物理隔离，每10 d采集4组动物粪样PCR检测沙门菌，对照组与给药组检测结果均为阴性。1~4日龄，房间温度保持在34~35℃，后续逐渐降至22℃，湿度保持在65%~70%。仔鸡自由采食与饮水，期间每日对环境进行清洁与消毒，观察记录仔鸡数量、呼吸、粪便及采食量变化。B组和BS组三黄鸡从1日龄开始每日在饲粮中添加120 mg·kg-1 BBR，连续给药21 d；S组和BS组在9日龄时分别连续灌胃3 d 1.2×109 CFU·mL-1的沙门菌，C组和B组灌胃等量生理盐水。
1.2.4 肠道组织病理学检测 21日龄仔鸡经颈椎脱臼处死后，在无菌条件下采取部分盲肠组织冲洗干净后立即放入液氮罐中保存；用冰PBS冲洗盲肠与十二指肠组织后放入10%甲醛溶液中固定，经包埋，切片后HE染色，光学显微镜下观察并拍照。
1.2.5 qPCR检测相关基因 利用Trizol法提取各组盲肠组织总RNA，并使用核酸定量仪测定RNA浓度及纯度，立即反转录或者-80℃保存。采用qPCR法检测各组盲肠组织中HSP90AA1、PPARG、PIK3CA的转录量，本研究采用相对定量法，2-ΔΔCt值表示基因相对转录量，以β-action为内参。结果用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。HSP90AA1、PPARG、PIK3CA及内参β-cation的上、下游引物见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
采用20 μL qPCR反应体系：2×Real PCR EasyTMMix-SYBR 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，模板(cDNA/DNA)1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，DNase-Free ddH2O 7 μL。qPCR扩增程序：95 ℃预变性10 min; 95℃变性10 s，62 ℃退火30s，72 ℃延伸15 s，40个循环，熔解曲线条件为72 ℃10 s。
2 结果 2.1 网络药理学结果2.1.1 靶点预测 如图 1，预测得到BBR靶点374个，获取肠炎靶点16 354个。通过Venny分析，获得BBR与肠炎有174个共表达靶点。
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图 1 小檗碱与肠炎相关靶点交集 Fig. 1 Berberine intersects with enteritis related targets |
2.1.2 PPI网络构建与核心靶点的筛选 将174个交集靶点导入STRING平台，构建PPI网络图，使用Cytoscape进行可视化，如图 2所示, 其中较为核心的靶点为ALB、HSP90AA1、SRC、VEGFA、PIK3CA、ESR1、PPARG等。
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图 2 小檗碱与肠炎共有靶标的PPI网络 Fig. 2 PPI network of common target of berberine and enteritis |
2.1.3 GO与KEGG富集分析 如图 3所示GO富集结果得出197个条目(P<0.01)，其中GO生物过程(biological process, BP)112个，细胞组分(cell components, CC)55个，分子功能(molecular function, MF)30个, 每组根据P值进行排序，前15的条目以柱状图展示。主要涉及信号转导、蛋白磷酸化、氧化还原、细胞增殖、炎症反应等生物过程，细胞组分主要分涉及细胞液、浆膜、细胞质、胞外体等，分子功能主要涉及蛋白结合、ATP结合、蛋白激酶活性、蛋白质同源二聚活性等。
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图 3 GO富集结果分析 Fig. 3 GO enrichment results analysis |
如图 4所示，KEGG通路富集筛选得到73条信号通路(P<0.01)，主要涉及癌症通路、PI3K-Akt信号通路、神经活性配体与受体的相互作用、趋化因子、Ras、cAMP信号通路等。KEGG富集分析结果根据P值排序，选取前30的条目绘制气泡图。其中P值越小，提示该通路越可能是BBR治疗肠炎的主要通路。
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图 4 KEGG通路富集结果分析 Fig. 4 Analysis of KEGG pathway enrichment results |
2.1.4 分子对接 对核心靶点进行分子对接验证，其中HSP90AA1、PIK3CA、PPARG与BBR结合最紧密，结合能均小于-5 kJ·mol-1(表 2)。蛋白与小分子的复合物采用Pymol2.1进行可视化分析(图 5)。由图 5可看出，BBR与HSP90AA1蛋白位点的LEU-107、ILE-26、TYR-139、ILE-110、VAL-136、ALA-55、VAL-186和PHE-138氨基酸残基形成疏水相互作用；BBR与PPARG蛋白的活性位点的AVAL-339、ILE-341、LEU-330、MET-36和ILE-281氨基酸形成疏水相互作用；BBR与PIK3CA靶点蛋白的LYS-802残基形成氢键相互作用，与TRP-780、ILE-848、ILE-932、MET-922、THR-856和VAL-850形成疏水相互作用；BBR的氮杂环与TRP-780的苯环形成了π-π共轭相互作用。综上，表明3个核心靶点与BBR均具有较好的结合活性且结合体构稳定。
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表 2 蛋白质与化合物的对接结果 Table 2 Docking results between protein and compound |
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A.HSP90AA1与小檗碱对接模式的3D结构图(左)及详细模式；B.PPARG与小檗碱对接模式的3D结构图(左)及详细模式；C.PIK3CA与小檗碱对接模式的3D结构图(左)及详细模式 A.The 3D structural diagram (left) and detailed mode (right) of binding between HSP90AA1 and BBR; B.The 3D structural diagram (left) and detailed mode (right) of binding between PPARG and BBR; C.The 3D structural diagram (left) and detailed mode (right) of binding between PIK3CA and BBR 图 5 核心靶点HSP90AA1、PPARG、PIK3CA与小檗碱对接模式的3D结构图及详细模式 Fig. 5 The 3D structural diagram and detailed mode of the binding mode between core targets HSP90AA1, PPARG, PIK3CA and berberine |
2.1.5 分子动力学模拟 如图 6所示，HSP90AA1、PIK3CA和PPARG蛋白的平均RMSD均小于3Å，表明BBR与3个蛋白之间均能形成稳定的复合物。
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a、b. 小檗碱与HSP90AA1蛋白动力学过程及RMSF图；c、d. 小檗碱与PIK3CA蛋白动力学过程及RMSF图；e、f. 小檗碱与PPARG蛋白分子动力学过程及RMSF图 a, b. The kinetic process and RMSF diagram of berberine and HSP90AA1 protein; c, d. The kinetic process and RMSF diagram of berberine and PIK3CA protein; e, f. The kinetic process and RMSF diagram of berberine and PPARG Protein 图 6 小檗碱与HSP90AA1、PIK3CA、PPARG动力学过程(左)及RMSF图(右) Fig. 6 Kinetic process (left) and RMSF diagram (right) of berberine and HSP90AA1, PIK3CA, PPARG |
如图 7A所示，BBR与HSP90AA1蛋白活性位点的MET-98、LEU-107、PHE-138、VAL-186存在很好的疏水相互作用，在整个分子的动力学模拟过程中氢键以及疏水相互作用存在的时间均大于18%，这表明小分子在蛋白位点存在持续有效的相互作用。如图 7B所示，BBR与PIK3CA蛋白活性位点的MET-772、TRP-780、LE-800、ILE-848、VAL-850、MET-922、ILE-932、PHE-934形成很强的疏水相互作用，对稳定蛋白口袋中的小分子起重要作用，另外BBR还能够与GLN-859形成氢键相互作用，对稳定蛋白口袋中小分子也有着重要贡献。如图 7C所示，BBR与PPARG的ILE-249、LEU-255、ILE-262、LYS-263、LEU-270、ILE-281、PHE-287、ILE-341、MET-348存在很强的疏水相互作用，且疏水相互作用时间均>25%。此外，BBR与GLU-343还存在静电相互作用。
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图 7 HSP90AA1(A)、PIK3CA(B)、PPARG(C)蛋白与BBR相互作用残基图 Fig. 7 The interaction residues of HSP90AA1(A), PIK3CA(B) and PPARG(C) protein with Berberine |
2.2.1 一般行为学表现 经造模后，S组明显出现腹泻，采食量下降，精神萎靡不振，毛发无光泽，体重下降的情况，BS(治疗组)症状有所缓解。
2.2.2 BBR和沙门菌对肠道组织的影响 如图 8，肉鸡盲肠和十二指肠组织切片结果显示，B组与BS组肉鸡盲肠和十二指肠未见异常；与对照组相比，S组盲肠与十二指肠有明显的炎性细胞浸润。
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a. C组盲肠组织切片；b. B组盲肠组织切片；c. S组盲肠组织切片；d. BS组盲肠组织切片；e. C组十二指肠切片；f. B组十二指肠切片；g. S组十二指肠切片；h. BS组十二指肠切片 a. Group C cecal tissue section; b. Group B cecal tissue section; c. Group S cecal tissue section; d. Group BS cecal tissue section; e. Group C duodenal tissue section; f. Group B duodenal tissue section; g. Group S duodenal tissue section; h. Group BS duodenal tissue section 图 8 仔鸡肠道组织切片 Fig. 8 Section of intestinal tissue of broiler |
2.2.3 BBR对肠炎关键靶点HSP90AA1、PIK3CA、PPARG转录的影响 如图 9所示，与对照组相比，S组(沙门菌攻毒模型组)中HSP90AA1基因转录量升高，PIK3CA基因转录量降低，PPARG基因表达量降低；与S组相比，BS组(治疗组)中HSP90AA1基因转录量降低(P<0.001)，PIK3CA基因转录量升高(P<0.01)。
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*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001 图 9 BBR对仔鸡盲肠组织中HSP90AA1、PIK3CA、PPARG基因表达量的影响 Fig. 9 Effects of Berberine on the expression of HSP90AA1, PIK3CA and PPARG genes in the cecum of broilers |
BBR是一种天然的以季异喹啉为基础的生物碱，小檗碱及相关中药(如黄连)数千年来一直被广泛应用治疗腹泻等胃肠道疾病，《伤寒论》中记载：“伤寒胸中有热，胃中有邪气，腹中痛，欲呕吐者，黄连汤主之”。研究表明，BBR能够显著缓解急性肠胃炎患者呕吐、腹痛和腹泻症状，改善白细胞计数和中性粒细胞百分比。BBR能有效治疗溃疡性肠炎，降低血清和结肠组织促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量及蛋白水平，增加抗炎因子IL-10、TGF-β、IL-4含量及蛋白水平[16]。此外，近年来, 有许多研究证实小檗碱对由三硝基苯磺酸、脂多糖、葡聚糖硫酸钠、乙酸诱导的肠道炎症模型中表现出极强的治疗作用，可缓解肠道屏障损伤[17]。例如，徐晓帆[8]研究发现, BBR可以缓解聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠道炎症损伤，抑制溶菌酶的分泌。Li等[18]研究表明, BBR可通过调控肠神经系统中的肠胶质细胞功能，减轻炎症浸润和免疫细胞过度激活，调节肠黏膜免疫稳态，维持肠黏膜屏障的结构和功能，进而改善小鼠的溃疡性结肠炎。
网络药理学作为重要的系统生物学研究方法，从整体的角度探索药物与疾病的关联性，可建立药物与疾病靶点之间的预测模型，整合两者之间的相互作用网络，分析药物与各个网络模块中特定节点的相互作用，从系统的角度研究药物与潜在靶点之间的相互作用关系[19]。本研究基于网络药理学寻找BBR与肠炎的靶点，筛选出BBR治疗肠炎的核心靶点，对交集靶点进行分析，核心靶点为ALB、HSP90AA1、PIK3CA、VEGFA、ESR1、SRC、NOS3、IGF1R和PPARG等。其中，HSP90AA1与炎症密切相关，可调节细胞的增殖和凋亡，抑制HSP90AA1能诱导自噬从而改善溃疡性结肠炎[20-22]，Su等[23]研究发现，BBR与HSP90抑制剂功能相似，可抑制结肠癌SW840细胞中HSP90蛋白的表达，进而抑制SW840细胞的增殖。PPARG参与体内多种生理及病理过程，包括细胞的分化、炎症反应、凋亡[24]。PPAR在肠上皮、巨噬细胞和血管内皮细胞中均具有高表达，有助于在疾病状态下保持肠道内稳态[25]。Feng等[26]利用LPS建立大鼠急性内毒血症模型，发现BBR可抑制LPS诱导的PPARγ磷酸化，证明黄连素对PPARγ活性具有潜在的保护作用，此外BBR也是PPARγ途径调节剂，可缓解肠黏膜炎症。有研究发现, 灌服BBR可通过激活PPARγ途径减少诱导COX-2的过量生产，可负向干扰p38/ATFs信号级联，缓解回肠黏膜损伤[27]。黄连素可通过PPARγ途径对肠、肺、肝等其他器官具有保护作用[26]。现有研究表明，PIK3CA的表达可激活PI3K-Akt信号通路，改善细胞凋亡和氧化应激[28-29]。本研究利用qRT-PCR检测沙门菌攻毒后肉鸡盲肠组织中HSP90AA1、PIK3CA以及PPARG的mRNA转录量，借以进一步研究HSP90AA1、PIK3CA以及PPARG在盲肠中对细菌感染过程中发挥的作用，结果发现, 沙门菌攻毒后HSP90AA1 mRNA水平显著上升，PIK3CA和PPARG的mRNA水平显著降低，而在饲料中添加BBR可显著降低由沙门菌攻毒引起的盲肠组织中HSP90AA1和PIK3CA mRNA的异常转录。此外，分子对接结果也发现BBR与HSP90AA1、PIK3CA和PPARG蛋白的多个残基相结合且结合稳定，进一步佐证了BBR可能通过调控HSP90AA1、PIK3CA和PPARG的表达进而干预肠道炎症的发生发展。由此，可以推测小檗碱对肠炎的治疗作用可能与多靶点协同合作有关，具体体现在小檗碱能调控细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应等。
由GO富集结果及KEGG代谢通路的结果分析可知，GO-BP与信号转导、蛋白磷酸化、凋亡过程、氧化还原过程、细胞增殖等有关，GO-MP集中于蛋白结合、ATP结合、蛋白激酶活性、酶结合等。KEGG结果显示, BBR通过多种通路途径干预肠炎的发展，如PI3K-Akt、Ras、cAMP、Rap1、HIF-1、AMPK、FoxO信号通路及趋化因子信号通路、癌症通路等。其中，PI3K-AKT信号通路参与众多细胞因子的表达和分泌，可调节促炎和抗炎细胞因子的表达失衡，有研究表明BBR引起细胞阻滞的的机制可能与抑制PI3K信号通路有关，且PI3K-Akt信号通路参与细胞的生长、存活、增值、凋亡、自噬等过程[30-32]。Wu等[33]研究发现，BBR可抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症反应，BBR通过抑制PI3K/Akt磷酸化，细胞中组胺、IL-4和TNF-α的产生进而缓解炎症反应。本研究KEGG结果显示, 核心靶点HSP90AA1、PIK3CA均参与此信号通路，推测BBR缓解家禽肠道炎症可能主要通过调控该信号通路。另有研究发现BBR可以呈剂量和时间依赖性降低ox-LDL诱导的炎症，其中p-AMPK/AMPK的比例增加，说明小檗碱发挥抗炎作用可能与激活p-AMPK/AMPK信号通路相关[34]。徐晓帆[8]研究发现, BBR可缓解葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠炎，此外还可通过BBR显著增加p-AMPK蛋白的表达量，IEC-18细胞自噬，缓解炎症反应。cAMP信号通路是环核苷酸系统的一种，上调能调控星形细胞的极化，从而降低炎症的发生[35]。FoxO信号通路主要与炎症信号转导相关，一旦被激活，其介导的NF-κB就会释放大量的炎症因子进而加剧炎症反应[36]。有研究发现, BBR对甲氨蝶呤诱导的大鼠肠道炎症具有良好的治疗效果，主要通过下调NRF2、SIRT1、FOXO-3、Akt和mTOR的表达，上调GSK-3β、JAK1和STAT-3的表达[37]。据此推测，BBR可能通过调节细胞周期与细胞凋亡参与治疗肠炎的过程。
4 结论本研究通过网络药理学和分子对接技术发现BBR通过多靶点、多通路协同作用缓解家禽肠道炎症，进一步建立家禽肠道炎症模型，发现BBR可调控HSP90AA1和PIK3CA的表达，显著缓解家禽肠道屏障损伤，但更深入的分子机制还需进一步挖掘与验证。
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(编辑 白永平)