表 1(Table 1)
图 1(Fig. 1)
TGFβR1介导TGF-β/Smad信号通路对绵羊颗粒细胞功能的影响
引用本文
李悦欣, 刘爱菊, 马晓菲, 郑忠, 胡伯欣, 智云霞, 田树军. TGFβR1介导TGF-β/Smad信号通路对绵羊颗粒细胞功能的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(8): 3335-3347.
LI Yuexin, LIU Aiju, MA Xiaofei, ZHENG Zhong, HU Boxin, ZHI Yunxia, TIAN Shujun. Effect of TGFβR1 on the Function of Sheep Granulosa Cells Mediated by TGF-β/Smad Signaling Pathway[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2023, 54(8): 3335-3347.
TGFβR1介导TGF-β/Smad信号通路对绵羊颗粒细胞功能的影响
1. 河北农业大学动物科技学院, 保定 071000;
2. 沧州职业技术学院农牧工程系, 沧州 061000
2. 沧州职业技术学院农牧工程系, 沧州 061000
摘要：旨在探究TGFβR1介导TGF-β/Smad信号通路调控绵羊颗粒细胞功能的机制。本试验收集绵羊卵巢颗粒细胞，通过构建pcDNA3.1（+）-TGFβR1和pcDNA3.1（+）-SMAD4过表达质粒载体及shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4干扰表达质粒载体，对绵羊颗粒细胞中TGFβR1和SMAD4基因分别进行过表达和干扰，利用CCK-8细胞增殖检测、流式细胞术、Annexin-V FITC/PI双染技术检测绵羊颗粒细胞增殖、细胞周期及凋亡功能，并结合Real-Time PCR及Western blot检测TGFβR1、SMAD4的mRNA水平和细胞凋亡相关蛋白BAX、BCL2、Caspase3的表达水平及TGF-β/Smad信号通路中TGFβR1、TGFβR2、SMAD2/3的磷酸化水平。结果显示，过表达TGFβR1和SMAD4均极显著促进颗粒细胞从G0/G1期进入S期的能力（P < 0.01）、颗粒细胞增殖及抗凋亡蛋白BCL2的表达（P < 0.01），抑制凋亡蛋白BAX和Caspase3表达（P < 0.01）。干扰TGFβR1和SMAD4均极显著促进颗粒细胞凋亡及凋亡蛋白BAX和Caspase3的表达（P < 0.01），抑制抗凋亡蛋白BCL2的表达（P < 0.01）。进一步研究发现，过表达TGFβR1可促进TGF-β/Smad信号通路中TGFβR1、TGFβR2及SMAD2/3磷酸化水平（P < 0.01），并极显著促进SMAD4的蛋白表达水平（P < 0.01）；干扰TGFβR1则显著抑制TGFβR1、TGFβR2（P < 0.01）及SMAD2/3的磷酸化水平（P < 0.05），并抑制SMAD4的蛋白表达（P < 0.01）；过表达SMAD4则会显著促进TGFβR1蛋白的表达（P < 0.01）。研究表明，TGFβR1促进绵羊颗粒细胞的增殖及周期进程，抑制颗粒细胞凋亡，通过介导TGF-β/Smad信号通路中SMAD2/3及SMAD4的表达正向调控绵羊颗粒细胞的增殖与周期，并负向调控其凋亡。
关键词：TGFβR1 绵羊 颗粒细胞 TGF-β/Smad信号通路
Effect of TGFβR1 on the Function of Sheep Granulosa Cells Mediated by TGF-β/Smad Signaling Pathway
1. College of Animal Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China;
2. Department of Agricultural and Animal Husbandry Engineering, Cangzhou Technical College, Cangzhou 061000, China
2. Department of Agricultural and Animal Husbandry Engineering, Cangzhou Technical College, Cangzhou 061000, China
Abstract: The study aimed to explore the mechanism of the TGF-β/Smad signaling pathway mediated by TGFβR1 regulating the function of sheep granulosa cells. In this study, sheep ovarian granulosa cells were collected, and pcDNA3.1(+)-TGFβR1 and pcDNA3.1(+)-SMAD4 overexpressed plasmid vectors and shRNA-TGFβR1 and shRNA-SMAD4 interfering plasmid vectors were constructed to overexpress and interfere with TGFβR1 and SMAD4 genes in sheep granulosa cells, respectively. The proliferation, cell cycle and apoptosis of sheep granulosa cells were detected by CCK-8 cell proliferation assay, flow cytometry and Annexin-V FITC/PI double staining. The mRNA levels of TGFβR1 and SMAD4, the protein expression levels of apoptosis-related proteins BAX, BCL2, and Caspase3 and the phosphorylation levels of TGFβR1, TGFβR2 and SMAD2/3 in the TGF-β/Smad signaling pathway were detected by Real-Time PCR and Western blot. The results showed that overexpression of TGFβR1 and SMAD4 extremely significantly promoted the ability of granulosa cells to enter the S phase from the G0/G1 phase (P < 0.01), the proliferation of granulosa cells and the expression of anti-apoptotic protein BCL2 (P < 0.01), and inhibited the expression of apoptotic protein BAX and Caspase3 (P < 0.01). Interference with TGFβR1 and SMAD4 both promoted granulosa cell apoptosis and the expressions of apoptotic protein BAX and Caspase3 (P < 0.01) and inhibited the expression of anti-apoptotic protein BCL2 (P < 0.01). Further studies showed that overexpression of TGFβR1 could promote the phosphorylation levels of TGFβR1, TGFβR2 and SMAD2/3 in the TGF-β/Smad signaling pathway (P < 0.01), and extremely significantly promote the protein expression level of SMAD4 (P < 0.01). Interference with TGFβR1 significantly inhibited the phosphorylation levels of TGFβR1, TGFβR2 (P < 0.01) and SMAD2/3 (P < 0.05), and inhibited the protein expression of SMAD4 (P < 0.01). Overexpression of SMAD4 could significantly promote the expression of TGFβR1 protein (P < 0.01). The results showed that TGFβR1 promoted the proliferation and cycle of sheep granulosa cells, inhibited granulosa cell apoptosis, positively regulated the proliferation and cycle of sheep granulosa cells, and negatively regulated the apoptosis of sheep granulosa cells by mediating the expression of SMAD2/3 and SMAD4 in TGF-β/Smad signaling pathway.
Key words:
TGFβR1 sheep granulosa cell TGF-β/Smad signaling pathway
绵羊的排卵数/胎产羔数与卵泡的生长发育和闭锁密切相关[1]，颗粒细胞作为卵泡内数量最多、比例最大以及功能最全的细胞群，其增殖、凋亡、分化和激素生成等对卵泡生长发育及卵泡闭锁至关重要[2-3]。本课题组最新研究发现，TGF-β信号通路在具有高繁殖力的绵羊卵泡内发挥正调控作用[4]。TGFβR1作为TGF-β信号通路的核心信号分子，是否通过介导TGF-β/Smad分支信号通路调控绵羊卵泡内颗粒细胞的功能，目前尚不清楚。
TGF-β/Smad是TGF-β信号通路的一个重要分支，其中磷酸化的TGFβ受体活性因子(TGFβR1)作为核心信号分子，会依次与SMAD2/3结合并将其活化，共同与SMAD4结合后调控下游基因的表达。在小鼠和猪等哺乳动物的卵巢颗粒细胞中，TGF-β信号通路的激活可促进颗粒细胞增殖[5-7]，而失活则会导致颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁[8-10]。Zhang等[11]研究表明，TGFβR1和SMAD3的表达受到阻碍时，导致猪颗粒细胞的生长和分化减少，并致使细胞凋亡。现有研究发现，SMAD3基因敲除会导致大鼠雌激素产生减少和颗粒细胞凋亡增加[12]。Yu和Liu[13]的研究发现，SMAD2是miR-30d-5p的靶基因，SMAD2过表达增强了大鼠卵巢颗粒细胞增殖并抑制了细胞凋亡。SMAD4是细胞核中TGF-β信号通路的介体和效应器，调节众多细胞过程，包括细胞增殖、分化、自身免疫、多能性和可塑性以及细胞生长、凋亡、自噬、侵袭和转移[14-17]。SMAD4失调与胚胎、骨骼肌分化缺陷、干细胞丢失、神经系统发育障碍和延迟、女性不育和其他疾病有关[18-22]。
为此，本试验拟构建pcDNA3.1(+)-TGFβR1和pcDNA3.1(+)-SMAD4过表达质粒载体及shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4干扰表达质粒载体，对绵羊颗粒细胞中TGFβR1和SMAD4基因分别进行过表达和干扰，利用CCK-8细胞增殖检测、流式细胞术、Annexin-V FITC/PI双染技术检测绵羊颗粒细胞增殖、周期及凋亡功能，并结合Real-Time PCR及Western blot检测TGFβR1、SMAD4的mRNA水平和TGF-β/Smad信号通路中TGFβR1、SMAD2/3等的磷酸化水平，探究TGFβR1、SMAD4对颗粒细胞增殖、凋亡、周期及TGF-β信号通路的影响，进而揭示TGFβR1介导TGF-β/Smad信号通路调控绵羊卵泡内颗粒细胞功能的机制。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 绵羊卵巢 从河北省保定市唐县屠宰场采集绵羊卵巢，将其放入加有1%双抗的37 ℃生理盐水中，于3 h内运回实验室。
1.1.2 主要试剂 胎牛血清、胰酶、双抗、0.25% Tripsin-EDTA均购自Gibco公司；DME/F-12、PBS购自Hyclone公司；TRIzol® Plus RNA Purification Kit购自Invitrogen公司；RNase-Free DNase Set购自Qiagen公司；SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR、Power SYBR® Green PCR Master Mix购自Roche公司；30%丙烯酰胺溶液购自Bio-Rad公司；PVDF转印膜购自Millipore公司；ECL DualVue WB Marker购自GE公司；SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate购自Thermo Pierce公司；X-ray film购自华东医药；细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物。
1.1.3 主要仪器设备 二氧化碳培养箱购自Thermo Fisher公司；Quantstudio多重实时荧光定量PCR仪购自美国life technologies公司；Mini-PROTEAN电泳系统、Mini Trans-Blot转印系统购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪购自美国Becton-Dickinson FACS Calibur公司。
1.2 试验方法1.2.1 颗粒细胞采集及培养 剪下屠宰绵羊的卵巢，用75%酒精喷洗，放于37 ℃灭菌生理盐水(含双抗)的保温瓶中，于4 h内回到实验室，进行颗粒细胞采集。采用预热37 ℃的生理盐水冲洗卵巢，使用灭菌剪刀剪掉卵巢周围系膜，生理盐水反复冲洗至干净，在DME/F-12培养基(含10%胎牛血清)中用无菌刀片划破3~7 mm的卵泡，将卵泡液和培养基混合液转移至离心管(10 mL)中，1 500 r ·min-1离心8 min，弃上清，PBS清洗两次，加入DME/F-12培养基(含10%胎牛血清)吹打混匀后接种于培养皿中，置于37 ℃，50 mL ·L-1 CO2培养箱中培养。参照韩红叶[23]的方法对颗粒细胞进行免疫荧光鉴定。
1.2.2 pcDNA3.1(+)-TGFβR1和pcDNA3.1(+)-SMAD4真核表达载体的构建 使用Nhe I和Hind Ⅲ两个限制性内切酶对pcDNA3.1质粒载体进行双酶切线性化处理，并通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，切胶回收线性化的pcDNA3.1载体。通过PCR扩增获取TGFβR1和SMAD4基因的目的片段，引物由上海桑尼生物合成，TGFβR1与SMAD4引物序列见表 1。PCR扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，29个循环；72 ℃ 10 min。胶回收目的片段后进行重组反应，重组反应体系：目的片段1 μL，线性化载体1 μL，2×Super Fusion Mix 5 μL，H2O 3 μL，50 ℃水浴1 h完成重组反应。将重组产物转化至感受态细胞DH5α中，将菌液涂板37 ℃恒温箱培养12 h，挑取单克隆菌落37 ℃摇菌16 h，酶切验证后将阳性菌液送公司测序鉴定。对符合条件的质粒命名为pcDNA3.1(+)-TGFβR1和pcDNA3.1(+)-SMAD4质粒载体(文中简称为pc3.1-TGFβR1和pc3.1-SMAD4)，对照组为pcDNA3.1空白载体(文中简称为PC组)。
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表 1 PCR引物序列 Table 1 Primers sequence for PCR |
1.2.3 shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4质粒的构建 使用Age I和EcoR I两个限制性内切酶对pLKO.1质粒进行双酶切线性化处理，并通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，切胶回收线性化的pLKO.1载体。TGFβR1和SMAD4的shRNA oligo序列信息见表 2。shRNA oligo退火后得到双链shRNA，使用T4连接酶将双链shRNA和线性化的pLKO.1载体进行连接反应，连接反应体系：退火得到的双链DNA片段2 μL，线性化载体1 μL，T4连接酶1 μL，T4 buffer 2 μL，H2O 14 μL，16 ℃反应过夜。将重组产物转化至感受态细胞DH5α中，将菌液涂板37 ℃恒温箱培养12 h，挑取单克隆菌落37 ℃摇菌16 h，酶切验证后将阳性菌液送公司测序鉴定。对符合条件的质粒命名为shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4质粒载体，对照组为shRNA-NC空白载体。
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表 2 shRNA oligo序列信息 Table 2 shRNA oligo sequence information |
1.2.4 过表达与干扰质粒载体转染 颗粒细胞正常培养达到70%~80%融合度后，胰蛋白酶消化、PBS清洗，完全培养基重悬，以5×105个细胞铺于6孔板中，每个组别3个重复。利用Lipofectamine 3000转染试剂分别将pcDNA3.1(+)-TGFβR1、pcDNA3.1(+)-SMAD4、shRNA-TGFβR1和shRNA-SMAD4质粒转染至绵羊颗粒细胞，参照lipo3000转染说明书进行转染，取两个1.5 mL离心管，分别加入125 μL opti-MEM、5 μL lipo3000试剂和125 μL opti-MEM、2.5 μL质粒、5 μL lipo3000试剂，轻轻混匀，按1 ∶1轻轻混合两管溶液于室温下孵育10~15 min，将转染溶液添加至6孔板中，在37 ℃培养48 h后收取细胞进行后续试验。
1.2.5 细胞增殖、凋亡及周期的检测 采用CCK-8细胞增殖检测技术对颗粒细胞进行测定，将细胞接种于96孔板中培养24 h，在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的OD值。采用细胞周期检测试剂盒检测颗粒细胞的细胞周期情况，收集处理好的细胞，加入500 μL PI/RNase A染色工作液，室温混匀避光30 min，使用流式细胞仪检测周期情况。采用Annexin-V FITC/PI试剂盒检测颗粒细胞的凋亡情况，在悬浮细胞中加入10 μL Annexin-V FITC和5 μL PI溶液，混匀避光20 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.6 TGFβR1和SMAD4基因表达水平的检测 采用TRIzol法提取颗粒细胞的总RNA，并用cDNA链合成试剂盒得到cDNA，通过Real-Time PCR检测转染后颗粒细胞中TGFβR1和SMAD4的mRNA表达水平，采用Primer Premier 6.0进行引物设计(表 3)。配制20 μL反应体系: Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。反应条件为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，40个循环。每个样品重复3次，各个基因的相对表达水平用2-ΔΔct表示。
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表 3 Real-Time PCR的引物序列 Table 3 Primer sequence for Real-Time PCR |
1.2.7 蛋白水平的检测 提取颗粒细胞的总蛋白，通过Western blot方法检测TGFβR1、BAX、BCL2、Caspase3、SMAD4、p-TGFβR1、p-TGFβR2、p-SMAD2/3的蛋白水平。做SDS-PAGE电泳分析，电泳结束后进行蛋白质转膜和转印膜封闭后进行一抗杂交，4 ℃孵育过夜，T-TBS漂洗4次，每次5 min；二抗室温孵育1 h，T-TBS漂洗5次，每次5 min；ECL工作液处理后放于成像仪中显色留图，采用Image J软件对蛋白条带进行分析。
1.2.8 统计分析 本试验均重复3次，使用SPSS 26.0软件进行统计学分析，结果均以“平均值±标准差”表示，采用单因素方差分析检验数据的差异显著性，P＜0.05表示具有显著性差异，P＜0.01表示具有极显著性差异，采用Origin 2021软件进行绘图。
2 结果 2.1 绵羊卵巢颗粒细胞的鉴定绵羊卵巢颗粒细胞可特异性表达FSHR蛋白，检测FSHR的存在状况可鉴定颗粒细胞，如图 1所示，FSHR在细胞质中表达，经FSHR染色后，细胞的胞浆部分呈绿色荧光，而DAPI染色后细胞核清晰呈现蓝色荧光，通过重叠可直观表现出细胞的细胞核及细胞质的分布区域，显微镜下可见的FSHR表达率＞90%，表明分离培养的绵羊颗粒细胞纯度较高，符合后续试验对颗粒细胞的条件要求。
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图 1 绵羊颗粒细胞FSHR免疫荧光染色情况 Fig. 1 Immunofluorescence staining of FSHR in sheep granulosa cells |
通过Real-Time PCR及Western blot对转染过表达和干扰TGFβR1载体的颗粒细胞中TGFβR1的表达量进行检测，结果显示(图 2A)，pc3.1-TGFβR1过表达载体转染颗粒细胞后，TGFβR1的表达量较对照组(PC组)极显著升高(P < 0.01)，而shRNA-TGFβR1组转染颗粒细胞后，TGFβR1的表达量较shRNA-NC组极显著降低(P < 0.01)。通过Western blot方法对转染过表达或干扰TGFβR1载体的颗粒细胞中TGFβR1蛋白表达变化进行检测，结果表明(图 2B)，过表达TGFβR1会极显著增加其蛋白的表达量(P < 0.01)，干扰TGFβR1会极显著降低蛋白的表达量(P < 0.01)。以上结果表明, TGFβR1过表达载体和干扰载体能够显著改变TGFβR1的表达水平，可用于后续试验。
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A. TGFβR1 mRNA相对表达量；B. TGFβR1蛋白相对表达量。*.P＜0.05；**.P＜0.01，下同。过表达组基因相对表达量均按PC=1的标准进行均一化处理；干扰组基因相对表达量均按shRNA-NC=1的标准进行均一化处理。下同 A. Relative expression of TGFβR1 mRNA; B. Relative expression level of TGFβR1 protein. *.P < 0.05; **.P < 0.01, the same as below.Relative expression levels of overexpressed genes were homogenized according to the standard of PC=1. The relative expression levels of interfering genes were homogenized according to shRNA-NC=1. The same as below 图 2 TGFβR1过表达和干扰的转染效率 Fig. 2 Transfection efficiency of TGFβR1 overexpression and interference |
用CCK-8方法检测转染过表达和干扰TGFβR1载体的颗粒细胞增殖的情况，结果表明(图 3A)，TGFβR1过表达促进颗粒细胞增殖，TGFβR1干扰较shRNA-NC对照组会抑制颗粒细胞的增殖。细胞周期检测结果显示(图 3B)，TGFβR1过表达，G0/G1期细胞数量极显著降低，对应S期细胞数量极显著增加(P＜0.01)，G2/M期细胞数量无显著变化(P＞0.05)；TGFβR1干扰可极显著降低G0/G1和S期的细胞数量，而G2/M期细胞数量则极显著增加(P＜0.01)。通过Annexin-V FITC/PI检测细胞凋亡结果显示(图 3C)，与PC组对比，TGFβR1过表达可以显著降低颗粒细胞的凋亡数量(P＜0.05)；与shRNA-NC对照组相比，TGFβR1干扰则显著增加颗粒细胞凋亡数量(P＜0.05)。TGFβR1过表达和干扰会影响凋亡蛋白的表达(图 3D)，TGFβR1过表达会极显著抑制BAX和Caspase3蛋白的表达水平，TGFβR1干扰会极显著抑制BCL2蛋白的表达水平(P < 0.01)。
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A. TGFβR1过表达/干扰后颗粒细胞CCK-8检测结果；B. TGFβR1过表达/干扰处理后颗粒细胞周期流式检测结果；C. TGFβR1过表达/干扰处理后颗粒细胞凋亡检测结果(Q1.坏死；Q2.凋亡晚期；Q3.凋亡早期；Q4.正常)；D. TGFβR1过表达/干扰处理凋亡蛋白BAX、BCL2、Caspase3表达水平检测结果 A. Detection results of granulosa cell CCK-8 after TGFβR1 overexpression/interference; B. Flow cytometry of granulosa cell cycle after TGFβR1 overexpression/interference; C. Apoptosis detection results of granulosa cells after TGFβR1 verexpression/interference (Q1.Necrosis; Q2.Late apoptosis; Q3.Early apoptosis; Q4.Normal); D. Apoptotic protein expression levels of BAX, BCL2 and Caspase3 after TGFβR1 overexpression/interference treatment 图 3 TGFβR1过表达/干扰对颗粒细胞增殖、周期、凋亡的影响 Fig. 3 Effects of overexpression/interference of TGFβR1 on proliferation, cycle, apoptosis of granulosa cells |
通过Real-Time PCR及Western blot对过表达和干扰SMAD4载体的颗粒细胞中SMAD4的表达量进行检测，结果显示(图 4A)，pc3.1-SMAD4载体转染颗粒细胞后，SMAD4的表达量较对照组(PC组)极显著升高(P < 0.01)，而shRNA-SMAD4组转染颗粒细胞后，SMAD4的表达量较shRNA-NC组极显著降低(P < 0.01)。通过Western blot方法对转染过表达和干扰SMAD4载体的颗粒细胞中SMAD4的蛋白表达变化进行检测，结果表明(图 4B)，SMAD4过表达会极显著增加其蛋白的表达量(P < 0.01)，干扰SMAD4极显著降低其蛋白的表达量(P < 0.01)。以上结果表明, SMAD4过表达载体和干扰载体能够显著改变SMAD4的表达水平，均可用于后续试验。
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A. SMAD4 mRNA相对表达量；B. SMAD4蛋白相对表达量 A. Relative expression level of SMAD4 mRNA; B.Relative expression of SMAD4 protein 图 4 SMAD4过表达和干扰的转染效率 Fig. 4 Transfection efficiency of SMAD4 overexpression and interference |
通过CCK-8方法检测转染过表达和干扰SMAD4载体的颗粒细胞增殖的情况(图 5A)，SMAD4过表达可极显著促进颗粒细胞的增殖(P＜0.01)，干扰SMAD4可极显著抑制颗粒细胞的增殖(P＜0.01)。细胞周期检测结果显示(图 5B)，SMAD4过表达，G0/G1期的细胞数量极显著下降(P＜0.01)，G2/M期细胞数量显著降低(P＜0.05)，而S期细胞数量则极显著增加(P＜0.01)；干扰SMAD4后的颗粒细胞，G0/G1期的细胞数量极显著下降，G2/M期和S期细胞数量极显著增多(P＜0.01)。细胞凋亡检测结果显示(图 5C)，pc3.1-SMAD4载体转染颗粒细胞后，降低了凋亡细胞比例，对细胞凋亡的抑制具有积极作用；shRNA-SMAD4组转染颗粒细胞后与对照组(shRNA-NC组)相比，细胞凋亡数量有所增多。进一步探究SMAD4对凋亡蛋白表达水平的影响发现(图 5D)，SMAD4过表达会极显著抑制BAX和Caspase3蛋白的表达，干扰SMAD4会极显著抑制BCL2蛋白的表达(P＜0.01)。
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A. SMAD4过表达/干扰后颗粒细胞CCK-8检测结果；B. SMAD4过表达/干扰后颗粒细胞周期流式检测结果；C. SMAD4过表达/干扰处理后颗粒细胞凋亡检测结果(Q1.坏死；Q2.凋亡晚期；Q3.凋亡早期；Q4.正常)；D. SMAD4过表达/干扰后凋亡蛋白BAX、BCL2、Caspase3的蛋白表达水平检测结果 A. Detection results of granulosa cell CCK-8 after SMAD4 overexpression/interference; B. Results of cell cycle flow cytometry after SMAD4 overexpression/interference; C. Apoptosis detection results of granulosa cells after SMAD4 overexpression/interference (Q1.Necrosis; Q2.Late apoptosis; Q3.Early apoptosis; Q4.Normal); D. The protein expression levels of BAX, BCL2 and Caspase3 after SMAD4 overexpression/interference treatment 图 5 SMAD4过表达/干扰对颗粒细胞增殖、周期、凋亡的影响 Fig. 5 Effects of SMAD4 overexpression/interference on granulosa cell proliferation, cycle, apoptosis |
TGFβR1过表达与干扰载体转染颗粒细胞后发现(图 6)，TGFβR1过表达会极显著促进SMAD4蛋白的表达(P＜0.01)，干扰TGFβR1后极显著降低SMAD4蛋白的表达(P＜0.01)，表明TGFβR1对SMAD4蛋白的表达具有促进作用。
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图 6 TGFβR1过表达和干扰对SMAD4蛋白表达的影响 Fig. 6 Effects of TGFβR1 overexpression and interference on SMAD4 protein expression |
SMAD4过表达和干扰载体转染颗粒细胞后，检测TGFβR1蛋白的表达情况发现(图 7)，SMAD4过表达会极显著增加TGFβR1蛋白的表达(P＜0.01)，干扰SMAD4极显著降低TGFβR1蛋白的表达(P＜0.01)。
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图 7 SMAD4过表达和干扰对TGFβR1蛋白表达的影响 Fig. 7 Effects of SMAD4 overexpression and interference on TGFβR1 protein expression |
TGFβR1过表达和干扰载体转染颗粒细胞后，检测TGF-β信号通路蛋白(p-TGFβR1、p-TGFβR2、p-SMAD2/3)的表达情况发现(图 8)，TGFβR1过表达极显著促进了TGFβR1、TGFβR2及SMAD2/3蛋白的磷酸化水平(P＜0.01)，与此同时，TGFβR1干扰会极显著抑制p-TGFβR1与p-TGFβR2的表达(P＜0.01)，会降低SMAD2/3的磷酸化水平。
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A. TGFβR1过表达后p-TGFβR1、p-TGFβR2、p-SMAD2/3蛋白的相对表达量；B. TGFβR1干扰后p-TGFβR1、p-TGFβR2、p-SMAD2/3蛋白的相对表达量 A. Relative expression level of p-TGFβR1, p-TGFβR2 and p-SMAD2/3 proteins after overexpression of TGFβR1; B. Relative expression level of p-TGFβR1, p-TGFβR2 and p-SMAD2/3 proteins after TGFβR1 interference 图 8 TGFβR1过表达和干扰对TGF-β信号通路相关蛋白表达的影响 Fig. 8 Effect of TGFβR1 overexpression/interference on TGF-β signaling pathway-related proteins expression |
绵羊胎产羔数的提升是近年来国内外研究的热点之一。绵羊卵泡发育影响繁殖力的高低，许多研究表明，颗粒细胞的发育状态与卵泡的命运有关。颗粒细胞增殖促进卵泡成熟和排卵，而凋亡导致卵泡闭锁和退化[24]，抑制卵巢颗粒细胞凋亡，可促进卵泡发育，提高排卵率和胎产羔数。TGF-β/Smad信号通路在细胞增殖分化、个体发育、软骨发生以及生殖发育、组织创伤修复等过程中都发挥着极其重要的作用[25-26]。本试验探讨了TGFβR1对绵羊颗粒细胞增殖凋亡的作用，并进一步探究TGFβR1如何通过TGF-β/Smad信号通路参与颗粒细胞功能的调控。结果发现，过表达TGFβR1可加快细胞进程进入S期，促进绵羊颗粒细胞增殖，抑制颗粒细胞凋亡，干扰TGFβR1会发生G2/M期阻滞，抑制绵羊颗粒细胞的增殖，促进其凋亡。这些发现与前人的研究结果类似，TGFβR1是TGFβ配体的1型受体[27-28]，参与下丘脑-垂体-卵巢轴的调控，促进卵子的发育成熟及黄体形成，参与滋养细胞的增殖、分化[29]；TGFβR1还可以介导生长分化因子9(GDF9)的信号，促进颗粒细胞的增殖和人腔前卵泡的生长[30]；敲除TGFβR1基因的小鼠能排卵和产生卵母细胞，但会发生胚胎死亡[31]，同时还伴随着严重的输卵管畸形[28, 32]，这些结果显示，TGFβR1会对颗粒细胞的增殖产生促进作用。进一步研究发现，TGFβR1会抑制促凋亡基因BAX和Caspase3的表达，促进抗凋亡基因BCL2的表达。有研究表明，抗凋亡蛋白BCL2和促凋亡蛋白BAX是细胞凋亡的关键调节因子，其主要作用部位是线粒体膜：前者抑制细胞色素c(Cytc)的释放，后者启动Cytc的释放。BCL2蛋白通过调节生殖细胞和体细胞的凋亡，在卵泡生长发育和卵泡闭锁中发挥重要作用。BCL2基因缺陷的小鼠表现出卵母细胞和原始卵泡数量的减少[33]，而BCL2的过表达减少了大的有腔卵泡的颗粒细胞凋亡，从而增加卵泡发生，提高排卵率。而BAX在卵母细胞和颗粒细胞中都有表达，缺失BAX基因的小鼠表现出过多的异常卵泡[34]。与正常卵泡相比，闭锁卵泡颗粒细胞中BAX的表达较强[35]。在猪颗粒细胞中，闭锁卵泡BAX的表达高于健康卵泡[24, 36]。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中发挥重要作用[37]，Caspase3是参与多种凋亡信号转导途径的关键执行分子[38-39]，活化的Caspase3会裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡[40]。这些结果表明，TGFβR1通过调控BCL2、BAX和Caspase3基因的表达，参与颗粒细胞的增殖凋亡进程。干扰TGFβR1会抑制TGFβR1、TGFβR2以及SMAD2/3的磷酸化，表明TGF-β信号通路被阻断。SMAD2/3是转化生长因子-β信号转导的核心成分，是转化生长因子-β的信号中间产物，激活的TGFβR1通过磷酸化SMAD2/3(R-Smads)蛋白激活Smad信号通路，磷酸化的R-Smads共同与SMAD4蛋白结合，将信号由胞浆转移至细胞核内，调节靶基因的转录，诱导下游目的基因的表达[11, 41]。
由于在TGF-β/Smad信号通路中，TGF-β二聚体结合TGFβR2，并导致TGFβR2自身磷酸化激活，同时将TGFβR1募集到高度保守的近膜区域，之后TGFβR2磷酸化激活TGFβR1并和其之间形成异四聚体复合物，磷酸化的TGFβR1将依次招募SMAD2和SMAD3与其结合将其磷酸化后转为活化状态，将信号传递到胞浆中，SMAD2/3与SMAD4形成异构体复合物，最终将信号由胞浆传递至细胞核中，在细胞核中调节下游基因的表达。SMAD4在该通路中发挥着关键作用，故进一步探究了TGF-β/Smad通路中TGFβR1下游的关键调节因子SMAD4与颗粒细胞功能的关系，研究发现，TGF-β/Smad通路的关键调节因子SMAD4与颗粒细胞的增殖凋亡有密切关系，过表达SMAD4会加快细胞进程进入至S期，促进颗粒细胞的增殖，抑制促凋亡蛋白BAX和Caspase3的表达，促进抗凋亡蛋白BCL2的表达；抑制SMAD4则发生G2/M期阻滞，抑制颗粒细胞增殖，抑制BCL2的表达，促进BAX和Caspase3的表达。SMAD4作为一种常见的TGF-β信号转导介质，被认为在调节卵泡生长和雌性生殖方面发挥了重要作用[9]。敲除卵巢特异性基因SMAD4的小鼠出现生育能力下降，生殖力随着时间的推移而下降，卵泡发生中存在多种缺陷，如严重的卵丘细胞缺陷和颗粒细胞过早黄体化[42]。已有研究发现，腔前颗粒细胞中SMAD4基因的缺失会导致后续卵泡发育和分化的严重缺陷[9]。以上发现证实, TGFβR1介导的TGF-β/Smad通路可以调控绵羊颗粒细胞功能，当SMAD4基因过表达即该信号通路信号传递增强时，可促进绵羊颗粒细胞的增殖，并抑制其凋亡。
4 结论TGFβR1促进绵羊颗粒细胞的增殖及周期进程，抑制颗粒细胞凋亡，通过介导TGF-β/Smad信号通路中SMAD2/3及SMAD4的表达正向调控绵羊颗粒细胞的增殖与周期，并负向调控其凋亡。
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(编辑 郭云雁)