脂肪沉积的过程十分复杂,而广灵大尾羊尾部脂肪的含量在动物体脂肪沉积中占较大比例,脂肪沉积量的提高在绵羊养殖中具有重要意义[1-3]。羊尾脂作为动物皮下脂肪组织的一类,是在恶劣生存环境下通过自然选择遗传进化而来的,不仅能为胴体提供日常营养[4],还能为对抗缺水少粮的恶劣环境提供能量[5]。此外,羊尾脂在工业方面、医药方面、饮食方面都发挥着重要的作用[6]。机体多余的能量以甘油三酯为最主要的存在形式存储于绵羊尾部的白色脂肪组织中[7],在能量平衡中起着不可或缺的作用,为机体提供所需的大量热能[8]。脂肪细胞作为脂肪组织的主要成员之一,受调控因子的影响进而决定脂肪组织的沉积量。许多研究表明,microRNAs(miRNAs)等调控因子直接或间接参与脂肪组织发育以及能量代谢[9]。研究脂肪细胞的细胞发育和能量代谢中发挥重要作用的调控因子及其作用机制具有重要意义。
miRNAs是小的内源性RNA,由大约22个核苷酸组成,miRNAs(从核苷酸2到8)与靶标mRNA的3′非翻译区域(UTR)互补性介导,从而抑制mRNA翻译[10]。miRNAs在不同的物种有较高的保守性,这表明它们在生物体生理学中具有重要作用,参与关键的细胞过程和疾病[11-13]。在miRNAs中,miR-150被称为循环miRNA,参与脂蛋白运输的过程[14-16]。bta-miR-150通过靶向mTOR信号通路中的AKT1,抑制牛前体脂肪细胞的分化[17]。miR-150可以通过调节小鼠B细胞与其他免疫细胞的相互作用来调节肥胖相关的胰岛素抵抗和组织炎症[14]。miR-150对B细胞发育至关重要,并通过调节脂肪组织B细胞功能抑制肥胖相关的炎症[18]。综上,miR-150影响着各物种机体的脂质代谢,但miR-150对广灵大尾羊的尾部脂肪发育过程的影响尚不清楚。
含铜胺氧化酶3(amine oxidase copper contatining 3,AOC3),又称为血管凋亡诱导蛋白1(vascular apoptosis-inducing protein 1,VAP1)。AOC3在哺乳动物组织中的分布范围很广,在脂肪细胞和脂肪组织中表现出相对较高的表达[19]。AOC3与白细胞外渗到发炎组织中有关,被作为粘附蛋白。但在脂肪细胞中AOC3被认为不作为粘附蛋白起作用,其作用可能是参与胰岛素信号传导和脂肪酸代谢的调节[20]。小鼠敲除AOC3,可减少白细胞浸润到脂肪组织中,有利于小鼠脂肪沉积[21]。在猪中,AOC3是DNA甲基化的候选基因之一,且通过DNA甲基化来调控脂肪的沉积,进而影响肥胖症[22]。综上,AOC3在脂肪代谢中有着重要的作用,但AOC3在脂肪细胞发育过程中的作用机制尚不明确。
本研究基于本课题组前期的测序结果及幼龄动物的组织细胞比老龄动物的组织细胞更易于培养的经验,在5日龄的广灵大尾羊中采集试验材料。旨在研究miR-150通过靶向AOC3的3′-UTR调控绵羊前体脂肪的分化,调控脂肪的沉积作用,更为清晰的阐述miRNA通过靶向下游靶基因的3′-UTR调控绵羊脂质代谢的作用机制。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 样品的采集 在实验室内采集5日龄广灵大尾羊的尾部脂肪,采样步骤如下:屠宰后,立刻用剃毛器除去广灵大尾羊的尾部毛发,露出尾部皮肤,防止毛发污染脂肪组织。用手术刀在尾部皮肤上开出创口,使得尾部脂肪暴露于表面。用无菌的手术剪与手术镊将脂肪组织与动物体分离,分离时尽量避开尾部的血管。分离后,先在75%的酒精中清洗脂肪组织,之后转移至含有1%双抗(青霉素与链霉素)的预冷PBS(phosphate buffered solution)中,冰上保存,立刻带入细胞房中,在超净台中进行组织分离与细胞培养。
1.1.2 仪器与试剂 Ⅱ型胶原酶、牛胰岛素、罗格列酮、地塞米松、IBMX和油红O染色试剂购自索莱宝生物有限公司;TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser和Trizol试剂购自TaKaRa公司;细胞培养级PBS、高糖培养基、胰蛋白酶和双抗购自Gibco公司;胎牛血清购自Dcell公司;蛋白裂解试剂盒与蛋白凝胶制备试剂盒购自BOSTER公司;AOC3抗体购自Proteintech公司;β-actin抗体购自Immunoway公司;胶回收与质粒提取试剂盒购自Omega公司;转染试剂Lip3000购自Invitrogen公司;Dual-Luciferase® Reporter Assay System购自Promega公司。
1.2 试验方法1.2.1 脂肪组织的分离与细胞培养 将待分离的脂肪组织放入少量含1%双抗的PBS的6 cm培养皿中,用组织分离剪与镊子(无菌)将组织上微量血管剔除,并将其剪碎至肉糜状,收集至无菌的15 mL离心管中,向离心管中加入与组织液等量的Ⅱ型胶原酶在孵育摇床上消化(30 min、37 ℃、300 r·min-1),加入完全培养基(含1%双抗和10%胎牛血清)终止消化后,分别用70和40 μm的细胞筛过滤,铺至10 cm的培养皿中,得到前体脂肪细胞。
在培养箱(37 ℃,5% CO2)中培养细胞,每隔2 d更换一次完全培养基。待细胞长满后,更换为诱导分化培养基(0.5 mmol·L-1 IBMX、1.0 μmol·L-1地塞米松和1.0 μmol·L-1牛胰岛素),诱导分化3 d后,更换为维持培养基(1.0 μmol·L-1牛胰岛素),待细胞分化10 d后,对细胞进行油红O染色处理,显微镜下观察脂滴的生成量。采用细胞免疫荧光法检测脂肪细胞因子Adiponectin的含量以鉴定细胞的纯度[23]。
1.2.2 qPCR检测 本试验采用Trizol-氯仿-异丙醇法提取组织和细胞的总RNA,使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂对提取的总RNA进行反转录得到所需cDNA后,并使用TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂对目的基因进行qPCR检测试验,qPCR引物如表 1所示。
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表 1 qPCR引物序列 Table 1 The primer sequences of qPCR |
1.2.3 miR-150过表达与干扰载体的构建 根据miRbase数据库查询出oar-mir-150的成熟序列,由上海生物工程股份有限公司合成miR-150的mimics、mimics NC、inhibitors和inhibitors NC,序列如表 2所示。
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表 2 miR-150的序列信息 Table 2 Sequences information of miR-150 |
1.2.4 miR-150的靶基因预测 依据本课题组对广灵大尾羊尾部脂肪的高通量测序数据分析结果,miR-150靶向AOC3、IBTK、KHNYN和VAMP2等多个基因,使用BiBiServ2、miRBas等多个软件对miR-150与AOC3进行结合位点的预测,发现二者存在结合位点,说明miR-150与AOC3可能存在靶标关系。
依据NCBI数据库中绵羊AOC3(登录号:XM_015098797.3)的序列,设计AOC3的3′-UTR野生型与突变型扩增引物序列,引物序列见表 3。
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表 3 AOC3的3′-UTR序列信息 Table 3 Sequences information of AOC3 3′-UTR |
1.2.5 绵羊AOC3过表达和干扰载体的构建 根据NCBI中AOC3的数据,设计2对AOC3 CDS区序列的干扰序列(AOC3-sh1、AOC3-sh2)和1对干扰对照序列(AOC3-shNC),序列如表 4所示。
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表 4 AOC3的表达引物序列信息 Table 4 The primer sequences information of AOC3 expression |
体外培养绵羊尾部前体脂肪细胞4 d后,细胞形态呈梭形(图 1A)。诱导分化10 d后,细胞形态发生改变生成大量脂滴,采用油红O染色的方法对其鉴定,脂肪细胞分化的脂滴呈红色(图 1B)。采用免疫荧光染色检测Adipogenictin的表达发现,红色荧光分布于细胞质中(图 1C),蓝色荧光表示细胞核(图 1D),95%以上的细胞带有红色荧光(图 1E),表明试验中体外培养的绵羊尾部脂肪细胞为绵羊前体脂肪细胞,纯度达到95%以上,可用于后续试验。
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A.绵羊前体脂肪细胞;B.成脂诱导的绵羊前体脂肪细胞;C~E. Adiponectin标记的绵羊前体脂肪细胞纯度鉴定 A. Ovine preadipocytes; B. Adipogenic induction of ovine preadipocytes; C-E. Purity identification of ovine preadipocytes marked by Adiponectin 图 1 绵羊前体脂肪的分离培养与油红O鉴定 Fig. 1 Isolation, culture and Oil Red O identification of ovine preadipocytes |
在前期课题组测序结果中可筛选出miR-150,且3个不同部位脂肪组织定量结果显示,所筛选出的miR-150在各组织中均有表达,miR-150在尾部脂肪表达量高,差异极显著(P<0.001, 图 2)。因此选择miR-150为后续试验对象,在绵羊尾部脂肪中进行功能验证。
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***表示P<0.001;n.s.表示P>0.05,下同 *** indicate P < 0.001; n.s. indicate P > 0.05, the same as below 图 2 miR-150在不同组织中的表达谱 Fig. 2 Expression profiles of miR-150 in different adipose tissues |
培养绵羊尾部前体脂肪细胞,待汇集度达到80%后,通过转染miR-150 mimics与miR-150 inhibitors来实现对miR-150的过表达与抑制。48 h后检测转染效率显示,与其阴性对照组相比过表达miR-150组的表达极显著上调(P<0.001),抑制miR-150则结果相反(图 3A),说明成功实现了对miR-150的过表达与抑制。
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A. 过表达和干扰miR-150后miR-150的相对表达;B. 过表达和干扰miR-150后AOC3的相对表达;C. 过表达miR-150后成脂标志基因的相对表达;D. 干扰miR-150后成脂标志基因的相对表达;E. AOC3蛋白的表达;F. AOC3蛋白相对表达量。* P<0.05,** P<0.01,下同 A. Relative expression of miR-150 after overexpressing and interfering miR-150; B. Relative expression of AOC3 after overexpressing and interfering miR-150; C. The mRNA expression of adipogenic marker genes after overexpressing miR-150; D. The mRNA expression of adipogenic marker genes after interfering miR-150; E. Expression of AOC3 protein; F. The relative expression of AOC3 protein. * P < 0.05, ** P < 0.01, the same as below 图 3 miR-150对绵羊前体脂肪细胞分化的影响 Fig. 3 Effect of miR-150 on differentiation of ovine preadipocytes |
待前体脂肪细胞汇集度达到100%时,用诱导分化培养基对细胞进行4 d的诱导培养,维持培养基进行6 d的培养。检测得到,过表达miR-150后,下游靶基因AOC3和脂肪分化标志基因C/EBPα的mRNA表达量极显著下降(P<0.01),其他脂肪分化标志基因Adiponectin、PPARγ和FABP4的mRNA表达量显著下降(P<0.05, 图 3B、3C)。抑制miR-150后,则结果相反(图 3B、3D)。Western blotting检测得到,过表达miR-150组与NC组相比较,AOC3蛋白的相对表达量极显著下调(P<0.01),抑制miR-150组与NC组相比较,结果相反(图 3E、3F)。油红O染色可知,过表达miR-150的细胞较其对照组产生较少脂滴;而抑制miR-150则脂滴较多,表明miR-150抑制脂滴沉积(图 4)。综上,miR-150下调AOC3和成脂分化标志基因的表达,抑制绵羊前体脂肪细胞的成脂分化。
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mimics. 过表达miR-150;mimics NC. 过表达对照;inhibitors. 干扰miR-150;inhibitors NC. 干扰对照 mimics. Overexpressing miR-150; mimics NC. Overexpressing negative control; inhibitors. Interfering miR-150; inhibitors NC. Interfering negative control 图 4 过表达和干扰miR-150后绵羊前体脂肪细胞油红O染色结果 Fig. 4 Oil Red O staining of ovine preadipocytes after overexpression and interference of miR-150 |
由BiBiServ2预测软件可知miR-150的种子区序列与下游基因AOC3的3′-UTR存在结合位点,如图 5A所示。图 5B所示为miR-150与AOC3的3′-UTR的种子区结合位点。分别构建AOC3的3′-UTR的野生型与突变型载体,并同miR-150 mimics与mimics NC进行共转染。由图 5C可知,miR-150 mimics极显著降低了AOC3的3′-UTR野生型的荧光活性(P<0.001),而AOC3的3′-UTR的突变型组与其阴性对照的荧光活性差异不显著(P>0.05)。结果可知,AOC3是miR-150的下游靶基因。
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A, B. RNAhybird预测miR-150和AOC3的结合位点;C. AOC3 3′-UTR重组双荧光质粒的相对荧光活性 A, B. RNAhybird predicts the binding site of miR-150 and AOC3; C. The relative luciferase activity of recombinant dual-fluorescence plasmids containing 3′-UTR of AOC3 图 5 miR-150与AOC3预测结合位点和相对双荧光素活性 Fig. 5 miR-150 and AOC3 predicted binding sites and relative dual luciferase activity |
构建AOC3的慢病毒过表达和干扰载体,通过共转染工具细胞293 T,对绵羊前体脂肪细胞进行慢病毒介导来实现AOC3的过表达与干扰。在293 T细胞和绵羊前体脂肪细胞中都出现了大量绿色荧光。分别如图 6A、6B所示。表明AOC3慢病毒包装效果良好,并成功感染了绵羊前体脂肪细胞。
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A. 在293T细胞中包装慢病毒;B. 慢病毒感染绵羊前体脂肪细胞。pHB-AOC3. 过表达AOC3;pHB-NC. 对照;AOC3-sh1.干扰AOC3-1;AOC3-sh2. 干扰AOC3-2;AOC3-shNC. shRNA对照; 下同 A. Lentivirus packing in 293T cells; B. Ovine preadipocytes were infected with lentivirus. pHB-AOC3. Overexpressing AOC3; pHB-NC. Negative control; AOC3-sh1. Interfering AOC3-1; AOC3-sh2. Interfering AOC3-2; AOC3-shNC. shRNA negative control; the same as below 图 6 细胞慢病毒感染效果图 Fig. 6 Effect of cell lentivirus infection |
待细胞汇集到90%以上,对细胞进行诱导分化处理。检测得到,过表达组与其阴性对照组相比,AOC3的表达极显著上调(P<0.01),AOC3-sh1、AOC3-sh2与其阴性对照组相比,AOC3-sh1显著下调了AOC3的表达(P<0.05),AOC3-sh2极显著下调了AOC3的表达(P<0.01),说明成功实现了对AOC3的过表达与干扰,并且AOC3-sh2的干扰效果更好(图 7A、7C)。所以选择AOC3-sh2作为后续试验对象。过表达AOC3后,成脂分化标志基因PPARγ(P<0.001)、Adiponectin、C/EBPα和FABP4的mRNA表达量均极显著上调(P<0.01),如图 7B所示。干扰AOC3后,结果与其相反(图 7D)。过表达AOC3组与NC组相比较,AOC3蛋白的相对表达量极显著上调(P<0.001),干扰AOC3组与NC组相比较,结果相反(图 7E、7F)。说明在蛋白水平也成功实现了对AOC3的过表达和干扰。AOC3能够上调成脂分化标志基因的表达,进而促进绵羊前体脂肪的成脂分化。
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A. 过表达AOC3后AOC3的相对表达;B. 过表达AOC3后成脂标志基因的相对表达;C. 干扰AOC3后AOC3的相对表达;D. 干扰AOC3后成脂标志基因的相对表达;E. AOC3蛋白的表达;F. AOC3蛋白相对表达量 A. Relative expression of AOC3 after overexpressing AOC3; B. The mRNA expression of adipogenic marker genes after overexpressing AOC3; C. Relative expression of AOC3 after interfering AOC3; D. The mRNA expression of adipogenic marker genes after interfering AOC3; E. Expression of AOC3 protein; F. The relative expression of AOC3 protein 图 7 AOC3对绵羊前体脂肪细胞分化的影响 Fig. 7 Effect of AOC3 on differentiation of ovine preadipocytes |
油红O结果显示,过表达AOC3组产生较多脂滴,干扰AOC3组产生的脂滴较少(图 8)。表明过表达AOC3后,促进了绵羊前体脂肪细胞的脂滴形成。综上所述,可知AOC3可促进绵羊前体脂肪细胞的成脂分化。
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图 8 过表达和干扰AOC3后绵羊前体脂肪细胞油红O染色结果图 Fig. 8 Oil Red O staining of ovine preadipocytes after overexpression and interference of AOC3 |
miRNA与相应的靶基因相互作用,抑制mRNA的表达,并阻断翻译过程或启动切割。miRNA和mRNA之间复杂的相互作用有助于更好地了解潜在的生物过程[24]。最初研究发现,miRNAs可多结合于靶基因的3′-UTR,例如miR-15a、miR-15b和miR-16通过靶向MYCN的3′-UTR抑制其表达[25]。经研究发现,miR-346通过靶向APP的5′-UTR区上调其表达和淀粉样蛋白β产生[26];miR-532-5p mimics通过与人HT-29 CRC细胞中RUNX3的5′-UTR特异性结合,显着下调了RUNX3的表达量和蛋白质水平[27]。关于结合位点处于CDS区的位置研究表明,miR-646通过靶向MIIP的CDS区破坏了其mRNA的稳定性,抑制了MIIP的表达,进而抑制了胰腺癌细胞在体内外的增殖和侵袭能力[28]。由此可知,miRNAs与靶基因的结合位点存在多样性。本研究通过双荧光素酶活性报告验证得到miR-150与AOC3的3′-UTR存在结合位点。且miR-150与AOC3的表达呈负相关性。由以上可知,miRNAs与下游靶基因的结合位置存在差异性,miRNAs靶向基因的5′-UTR时正调控基因的表达;靶向基因的3′-UTR和CDS区时负调控基因的表达。因此,对基因的调控作用是否受二者结合位点所在位置影响,可以做更进一步的探究。
miRNAs通过调控靶基因的表达既能促进脂肪细胞的分化,又能抑制脂肪细胞的分化。研究表明,gga-miR-106-5p通过结合KLF15,抑制鸡的腹部脂肪生成[29]。MYOD1通过结合miR-206来抑制KLF4表达进而抑制脂肪细胞分化[30]。miRNAs与目的基因结合抑制了脂肪的分化。也有文献提出,miR-34a通过靶向AdipoR2抑制AMPK信号通路进而抑制PPARα的信号传导,使脂滴生成量增加[31]。miR-370-3p、miR-345-5p分别通过结合MKNK1和VEGF-B的3′-UTR,调控脂肪生成和脂肪酸代谢[32-33]。本研究表明,在绵羊前体脂肪细胞中,miR-150有效地降低了成脂分化标志基因的表达,从而减少了脂滴的沉积量。可知,miRNAs对脂肪分化有着重要的影响,因此,研究miRNA对广灵大尾羊尾部前体脂肪细胞分化的影响可提高绵羊养殖场的经济效益。
miR-150是调节脂肪细胞炎症的小RNA之一[34],可在生理上调节细胞和动物的脂质代谢和炎症反应[35]。一项有关于巨噬细胞的研究显示, miR-150可调控脂质积累并且与细胞的促炎因子表达升高有关[36]。敲除miR-150的小鼠高脂饮食后,全身重量减轻,脂肪堆积减少,表现出肥胖相关组织炎症和全身胰岛素抵抗加剧[14]。以上多项研究表明, miR-150是影响脂质代谢和炎症发生的研究热点。而在家畜模型中的研究发现,在猪脂肪组织中,miR-150-5p通过调控CYP3A4促进游离脂肪酸诱导脂肪变性[37]。miR-150能够促进肉牛前体脂肪细胞的增殖,在肉牛前体脂肪细胞分化的阶段,miR-150又可以通过靶向AKT1抑制肉牛前体脂肪细胞分化[17]。近几年有关于miR-150的研究从小鼠动物模型转向了家畜。因此,本研究以绵羊前体脂肪细胞为模型,在广灵大尾羊尾部前体脂肪细胞中转染miR-150 mimics后,脂肪分化标志基因C/EBPα(P<0.01)、Adiponectin(P<0.05)、PPARγ(P<0.05)和FABP4(P<0.05)的表达量均下调,脂滴的形成减少;干扰miR-150后,得到相反结果。由以上结果可知,miR-150通过抑制成脂分化基因的表达,进而抑制绵羊前体脂肪细胞分化,同时也抑制了下游靶基因AOC3的表达。然而,miR-150对绵羊前体脂肪细胞的调控是直接作用于脂肪标志基因,还是通过其他调控因子间接作用于脂肪标志基因有待研究。因此,本试验还对miR-150的下游靶标基因AOC3进行了研究。
慢病毒载体是递送遗传物质最常用的转移载体之一,是分子转染试验的首选载体[38]。慢病毒生产系统是基于瞬时生产的,通过快速有效地共转染293 T细胞。转染48~72 h后收获病毒上清液,滴度达到106~108 UT·mL-1[39]。本试验在对AOC3功能验证中采用了慢病毒载体转染293 T细胞,在慢病毒包装质粒和293 T的辅助下,成功包装为具有感染性的病毒颗粒,收集病毒液后感染绵羊前体脂肪细胞,在绿色荧光以及AOC3的表达量定量数据的鉴定下,成功实现了对目的基因AOC3在绵羊前体脂肪细胞中的过表达和抑制。采用慢病毒包装质粒对目的基因进行功能验证,该试验过程需小心谨慎和防止感染液的污染,但该试验方法可以更直观的观察试验现象,并及时发现试验是否有必要继续进行。
AOC3通过编码胺氧化酶调控脂肪组织中的组胺氧化促进脂肪细胞的分化[40],因此AOC3在脂质形成中发挥着重要作用。本研究过表达AOC3后,成脂分化标志基因的表达量均极显著上调(P<0.01),脂滴的形成增多。因此,AOC3能够通过调控脂肪分化标志基因的表达进而促进绵羊前体脂肪细胞的分化。研究表明,AOC3是DNA甲基化的候选基因之一,且通过DNA甲基化来调控脂肪的沉积,进而影响肥胖症[22, 41]。以上文献说明,AOC3与脂质代谢密切相关。本试验在广灵大尾羊的前体脂肪细胞中对AOC3进行分子水平的验证,可为分子遗传提供一定的理论基础。
4 结论通过软件预测与试验验证,miR-150与AOC3的3′-UTR存在结合位点。在脂肪细胞分化的过程中,miR-150与AOC3的表达量呈负相关性,miR-150作为绵羊前体脂肪细胞分化的抑制剂,通过靶向下游靶基因AOC3的3′-UTR抑制脂肪分化,减少脂滴生成,从而影响绵羊脂肪细胞的分化,为绵羊尾脂在工业、医药和饮食方面的重要作用提供更好的科学理论依据。
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(编辑 郭云雁)