畜牧兽医学报  2023, Vol. 54 Issue (8): 3242-3251. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2023.08.011    PDF    
NR2F2基因调控猪PK15细胞增殖和凋亡的研究
张万锋, 赵天枝, 李娇, 尤紫薇, 杨阳, 蔡春波, 高鹏飞, 曹果清, 郭晓红, 李步高     
山西农业大学动物科学学院, 太谷 030801
摘要:旨在探究NR2F2基因对猪PK15细胞增殖和凋亡的影响。本研究在猪PK15细胞中过表达NR2F2基因,通过qRT-PCR、Western blot、CCK-8、EdU、流式细胞术、划痕试验等方法检测了过表达NR2F2基因对细胞增殖的影响;采用CO-IP技术验证NR2F2与Smad4蛋白结合能力;用qRT-PCR方法检测了NR2F2基因对Smad4基因表达以及下游基因Cyclin BCDK1、CDK4、Cyclin D1表达的影响;挽救试验过表达NR2F2基因且干扰Smad4基因检测下游基因及增殖基因Ki67、PCNA的表达。结果发现,过表达NR2F2基因极显著上调了Ki67基因的表达(P < 0.01),显著上调了PCNA的表达(P < 0.05),促进了细胞周期的进程,抑制了细胞凋亡,促进了细胞的增殖。CO-IP结果证明了NR2F2与Smad4蛋白物理性结合,且发现过表达NR2F2基因后,Smad4基因表达显著上升(P < 0.01),Smad4基因调控的下游基因Cyclin BCDK1、CDK4、Cyclin D1表达显著升高(P < 0.01);干扰NR2F2基因后,Smad4基因表达显著下降(P < 0.01),Smad4基因调控的下游基因表达显著降低(P < 0.01)。挽救试验发现,过表达NR2F2基因后,干扰Smad4基因的表达,能显著降低Cyclin D1、Cyclin BCDK1以及Ki67、PCNA的表达(P < 0.01,P < 0.05)。本研究结果表明,过表达NR2F2基因后促进了细胞的增殖,抑制凋亡,且NR2F2蛋白能与Smad4蛋白结合并影响Smad4基因的表达,进而影响下游基因的表达。
关键词NR2F2基因    Smad4基因    细胞增殖    PK15细胞    
Study on NR2F2 Gene Regulating Proliferation and Apoptosis of Porcine PK15 Cells
ZHANG Wanfeng, ZHAO Tianzhi, LI Jiao, YOU Ziwei, YANG Yang, CAI Chunbo, GAO Pengfei, CAO Guoqing, GUO Xiaohong, LI Bugao     
College of Animal Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
Abstract: This study aimed to explore the effect of NR2F2 gene on the proliferation and apoptosis of porcine PK15 cells. In this study, the effect of overexpression of NR2F2 gene on cell proliferation was detected by qRT-PCR, Western blot, CCK-8, EdU, flow cytometry, scratch assay and other methods in porcine PK15 cells. CO-IP technology was used to verify the binding ability of NR2F2 to Smad4 protein. The effect of NR2F2 gene on Smad4 gene expression and the expression of downstream gene Cyclin B, CDK1, CDK4, Cyclin D1 were detected by qRT-PCR. The expression of downstream genes and proliferating genes Ki67, PCNA were detected by rescue experiment overexpressed NR2F2 gene and interfered with Smad4 gene. The results showed that overexpression of NR2F2 gene significantly upregulated the expression of Ki67(P < 0.01), and significantly upregulated the expression of PCNA(P < 0.05), promoted cell cycle progression, inhibited cell apoptosis, and promoted cell proliferation. The CO-IP results proved that NR2F2 and Smad4 proteins were physically bound. After overexpression of NR2F2 gene, the expression of Smad4 gene increased significantly (P < 0.01), and the expression of downstream regulated genes by Smad4 gene Cyclin B, CDK1, CDK4 and Cyclin D1 significantly increased (P < 0.01). After interfering with NR2F2 gene, the expression of Smad4 gene significantly decreased (P < 0.01), and the expression of downstream genes regulated by Smad4 gene was significantly decreased (P < 0.01). The rescue experiments showed that after overexpression of NR2F2 gene, interfering with the expression of Smad4 gene could significantly reduce the expression of Cyclin D1, Cyclin B, CDK1, Ki67 and PCNA (P < 0.01, P < 0.05). In summary, overexpression of NR2F2 gene promoted cell proliferation and inhibited apoptosis, and NR2F2 protein could bind to Smad4 protein and affect the expression of Smad4, which in turn affected the expression of downstream genes.
Key words: NR2F2 gene    Smad4 gene    cell proliferation    PK15 cell    

细胞增殖是细胞重要的生命活动,也是机体生长、发育、繁殖和遗传的基础[1-3]。细胞增殖是一个复杂而有序的过程,主要受细胞周期因子和周期蛋白依赖激酶调控,这些基因由很多信号通路所调控,如Wnt信号通路、Notch信号通路、TGF-β信号通路,而这些通路又受到许多转录因子的调控[4-11]

鸡卵清蛋白上游启动子转录因子2(COUP-TFII,也叫NR2F2)是核受体家族超家族成员,在1986年因直接结合于卵清蛋白的启动子区调节其转录被发现[12]。在脊椎动物中,鸡卵清蛋白上游启动子转录因子家族由3个成员组成,核受体亚家族2组F成员1(NR2F1)、NR2F2和核受体亚家族2组F成员6(NR2F6)。虽然它们在不同的染色体上,但氨基酸序列是高度同源的[13]NR2F2基因在组织中广泛表达,在骨骼、肌肉、脂肪形成和代谢平衡中起重要调节作用[14-16]。NR2F2作为一种转录因子,通过多种机制调控下游靶基因的转录。NR2F2可以通过与DNA结合元件结合,直接或间接激活基因表达。NR2F2可以与Wnt家族成员10b(Wnt10b)启动子区域结合,抑制Wnt10b的表达[17]。NR2F2可以与CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)启动子结合,抑制C/EBPα的表达[18]。NR2F2可以与维甲酸X受体(RXR)的DNA结合位点竞争性结合[19]。NR2F2还作为一种转录抑制剂,可与RXR和甲状腺激素受体相互作用,抑制PPAR的表达[20]。此外,NR2F2还可以通过直接结合RXR的LBD结构域来抑制核受体的转录[21]

为了确定NR2F2基因对细胞增殖的作用机制,Ma等[22]研究发现, 在WJ-MSCs细胞中敲除NR2F2基因后导致Cyclin D1和CDK4表达降低,细胞增殖减慢。Qin等[23]对敲除NR2F2基因的PC3细胞与正常细胞进行了转录组比较,通过基因富集发现,在NR2F2基因表达低时,TGF-β信号通路下游调控的基因全部富集,说明NR2F2能调控TGF-β信号通路。敲除NR2F2基因后,显著改变了TGF-β信号通路下游基因p21、p15和Cyclin D1的表达。Wang等[24]研究发现, NR2F2基因在直肠癌细胞中与PTENSmad4基因的表达相关,而Smad4基因是TGF-β信号通路的关键基因。Smad4基因主要功能是参与TGF-β信号通路的信号传导。进一步研究发现,NR2F2蛋白能够与Smad4蛋白结合,与突变型的Smad4不能结合,直接证明了NR2F2与Smad4之间的结合作用。表明在癌细胞中,NR2F2基因可以通过与Smad4基因相互作用,进而影响TGF-β信号通路传导。

目前,围绕NR2F2基因的研究主要集中在其对人类癌症等疾病、小鼠肌肉与脂肪等组织的作用机理,针对NR2F2基因调控猪源细胞增殖的机制还未见报道。本试验旨在探究NR2F2基因对细胞增殖、凋亡的影响,为进一步研究猪生长发育的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞系和质粒   本研究中使用的PK15细胞和293 T细胞来自山西农业大学动物遗传育种与繁殖博士点实验室。

pLenti-CMV-GFP-SV-puro、pLenti-CMV-NR2F2-GFP-SV-puro、pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G、pCDNA3.1-Flag、pCDNA3.1-Flag-NR2F2、pHS-CR054、pHS-CR054-sg1、pHS-CR054-sg2质粒均为山西农业大学动物遗传育种实验室保存。

1.1.2 主要试剂   PrimeScriptTM RT Master Mix、RNAiso Plus regent和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购于TaKaRa公司;PBS粉末、青链霉素混合液、胰蛋白酶购于中国索莱宝公司;FBS和DMEM购自Gibco公司;兔二抗、鼠二抗购于LI-COR公司;Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司;CCK-8试剂盒购自Dojindo公司;EdU试剂盒、细胞周期试剂盒、细胞凋亡试剂盒购自凯基生物公司;RIPA裂解液(强)、蛋白酶抑制剂、蛋白凝胶试剂盒、NC膜、脱脂奶粉购自博士德公司;β-actin抗体购自博奥森公司;NR2F2抗体购自Abcam公司;PCNA抗体购自CST公司;siRNA购自吉玛公司,siRNA序列见表 1

表 1 siRNA序列 Table 1 Sequences of siRNA
1.2 试验方法

1.2.1 慢病毒包装及转染细胞   转染前1 d,胰酶消化293 T细胞,接种细胞于10 cm细胞培养皿,培养1 d,当细胞浓度达到60%~80%时进行转染。用Lipofectamine 3000将10 μg pLenti-CMV-GFP-SV-puro或pLenti-CMV-NR2F2-GFP-SV-puro质粒与7.5 μg pCMV-dR8.91、5 μg pCMV-VSV-G包装质粒共转染293 T细胞中,转染6 h后,更换为完全培养基,继续培养48、72 h后,收集293 T细胞培养液,4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min,去除细胞碎片,0.45 μm针式滤器过滤,收集病毒液置于-80 ℃冰箱,用于感染PK15细胞。

将PK15细胞接种于6孔板中,待细胞汇合度达到50%~60%,每孔加入1 mL病毒上清液,感染6 h后,更换为完全培养基培养,感染72 h后,荧光显微后荧光显微镜检测EGFP的表达,形成稳定转染NR2F2基因的细胞。

1.2.2 质粒和siRNA转染   PK15细胞接种至10 cm培养皿中, 使用含10%FBS和1%双抗的低糖DMEM培养基在37 ℃,5% CO2条件下进行培养。将细胞进行消化计数,接种至6孔板中,细胞生长汇合至40%~50%即可进行转染。利用Lipofectamine 3000脂质体分别将pHS-CR054、pHS-CR054-sg1、pHS-CR054-sg2质粒、siRNA-NC及siRNA-Smad4转染至PK15细胞中,每组3个重复。按转染试剂操作说明,取两个1.5 mL离心管,分别加入125 μL DMEM培养液,然后于其中一管加入100 pmol siRNA或4 μg质粒吹打混匀;另一管加入10 μL转染试剂吹打混匀,室温静置5 min后,将含有siRNA或质粒的培养液加入含转染试剂的培养液中吹打混匀,室温静置20 min。将制备好的转染溶液加至6孔板,并用DMEM加至每孔2 mL,于37 ℃,5% CO2中培养,6 h后更换为含10%胎牛血清的培养液。转染后观察结果并收取细胞进行后续试验。

1.2.3 RNA提取及实时荧光定量PCR   使用RNAiso Plus提取总RNA,提取方法参照试剂盒说明书。将提取的总RNA用核酸蛋白测定仪测定其纯度及浓度,OD260 nm/OD280 nm为1.8~2.0的总RNA用于后续研究,采用PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒将RNA反转录成cDNA。

以18 S rRNA为内参基因,采用qRT-PCR对基因的表达水平进行检测。qRT-PCR反应体系:cDNA 2 μL,2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL,上、下游引物(表 2)各0.5 μL,RNAase Free ddH2O补至20 μL。反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,35个循环;熔解曲线程序为95 ℃ 15 s,60 ℃ 35 s,95 ℃。结果采用2-ΔΔCt法进行分析,每个样本做3次重复。

表 2 qRT-PCR引物序列 Table 2 The primers sequence of qRT-PCR

1.2.4 总蛋白提取和Western blot检测   提取细胞总蛋白,利用核酸蛋白浓度测定仪测定蛋白浓度。取200 ng蛋白上样,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后,采用湿转法进行转膜,5%封闭蛋白粉室温封闭1 h,一抗采用1∶1 000稀释,4 ℃孵育过夜。隔天回收一抗,PBST洗膜3次,加入荧光二抗,避光室温孵育1 h,洗膜后使用LICOR仪器曝光,使用仪器自带软件Image Studio计算分析条带光密度值。

1.2.5 CCK-8、EdU试验   将细胞接种至96孔细胞板中,每孔细胞约1 000个,在铺板后0、1、2、3、4、5 d分别进行检测,检测前每孔加入10 μL的CCK-8试剂,在细胞培养箱孵育3 h后,使用酶标仪检测450 nm吸光度。

取处于对数生长期的细胞,以每孔4 000~10 000个细胞接种于96孔板中,每孔加入100 μL EdU染液和100 μL Hoechst33342溶液,染色完毕后使用荧光显微镜成像。

1.2.6 流式细胞术检测   将细胞接种至6 cm细胞培养皿,培养至细胞浓度80%~90%时,收集的细胞在70%冷乙醇中重悬,4 ℃固定过夜,复温后加入400 μL PI染色,4 ℃避光孵育30 min,流式细胞仪检测。

将细胞接种至6 cm细胞培养皿,培养至细胞浓度80%~90%时,PBS洗2次,收集细胞;加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞,加入5 μL Annexin V-APC混匀后,加入5 μL 7-AAD染液,混匀,室温、避光、孵育15 min;流式细胞仪检测。

1.2.7 伤口愈合试验   将细胞接种至6孔板中,待其长满后,用1 mL蓝枪头在六孔板内划线,PBS清洗2次,加培养基继续培养,观察0、12、24、36、48 h时划痕处细胞的生长状态。

1.2.8 CO-IP试验   收集转染了过表达NR2F2且携带Flag标签蛋白载体的PK15细胞,加入40 μL Flag树脂的裂解液在4 ℃下轻轻摇晃孵育过夜,然后用500 μL细胞裂解缓冲液漂洗树脂,混匀仪上室温漂洗5 min,4 ℃ 500 r·min-1离心5 min,重复3次,加入50 μL洗脱缓冲液,漩涡震荡20 s,放摇匀仪上,室温洗脱10~15 min,漩涡震荡20 s,4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min,取上清到新的离心管中,用于Western blot。

1.2.9 数据分析   应用SPSS 22.0进行统计分析。数据采用单因素方差分析和独立样本t检验进行比较,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。

2 结果 2.1 慢病毒包装及NR2F2基因过表达效率

病毒液感染PK15细胞48 h后,荧光显微镜观察发现OE-NC组和OE组都表达了绿色荧光蛋白(图 1A)。qRT-PCR和WB检测过表达NR2F2基因的效率,结果发现,慢病毒液感染PK15细胞后,NR2F2基因mRNA水平和蛋白水平极显著增加(P<0.01,图 1B~D)。

A. 绿色荧光蛋白EGFP表达(标尺为100 μm);B~D. 过表达NR2F2基因mRNA和蛋白水平表达。“ **”表示差异极显著(P<0.01),“*”表示差异显著(P<0.05)。下同 A. Expression of green fluorescent protein EGFP(bar=100 μm); B-D. Expression of NR2F2 gene at mRNA and protein levels. " **" indicate extremely significant difference (P < 0.01), "*" indicate significant difference (P < 0.05). The same as below 图 1 过表达NR2F2基因效率 Fig. 1 The efficiency of overexpression of NR2F2 gene
2.2 过表达NR2F2基因对细胞增殖、凋亡的影响

慢病毒感染PK15细胞后,结果显示Ki67基因mRNA表达极显著增加(P<0.01,图 2A);qRT-PCR、WB检测结果显示,PCNA表达量显著增加(P<0.05,图 2A2B2C)。CCK-8结果显示,过表达NR2F2基因后细胞的吸光度值随着时间的增加极显著上升(P<0.01),差异具有统计学意义,表明促进了细胞的增殖(图 2D)。EdU结果显示,过表达NR2F2基因后S期细胞数量显著增多(P<0.01),表明促进了细胞的增殖(图 2EF)。流式细胞仪检测过表达NR2F2基因后细胞周期变化,发现过表达NR2F2基因后,处于G1期细胞的数量显著低于对照组(P<0.01),S期细胞的数量显著高于对照组(P<0.01),表明NR2F2基因可以改变细胞周期,促进G1期向S期转变,从而促进细胞增殖(图 2GH)。通过流式细胞仪检测过表达NR2F2基因对细胞凋亡的影响, 结果发现,过表达NR2F2基因后,早凋细胞占比增多,晚凋细胞占比减少,表明NR2F2基因可以抑制细胞的凋亡(图 2I)。通过划痕试验检测NR2F2基因对细胞迁移的影响,结果表明,过表达NR2F2基因后,细胞迁移速度加快,在48 h后基本汇合,而对照组细胞还未完全融合(图 2J)。

A~C. 过表达NR2F2基因后增殖相关基因表达变化;D. CCK-8检测细胞增殖;E、F. EdU检测细胞增殖;G、H. 流式细胞术检测细胞周期;I. 流式细胞术检测细胞凋亡;J. 划痕试验检测细胞增殖 A-C. The expression change of proliferation related genes after overexpression of NR2F2 gene; D. Cell proliferation was determined by CCK-8; E, F. Cell proliferation was determined by EdU; G, H. Cell cycle was determined by flow cytometry; I. Apoptosis was detected by flow cytometry; J. Cell proliferation was detected by scratch assay 图 2 NR2F2基因对细胞增殖、凋亡的影响 Fig. 2 The effects of NR2F2 gene on cell proliferation and apoptosis
2.3 NR2F2与Smad4物理结合并调控其表达进而影响下游基因的表达

为了确定NR2F2基因调控细胞增殖的具体机制,本研究通过蛋白相互作用软件预测了一些与NR2F2相互作用的蛋白。发现能与NR2F2互作的蛋白有15个,其中我们将关注点聚焦在Smad4蛋白上(图 3A)。进行了Co-IP分析来检测NR2F2和Smad4之间的相互作用。用Flag标签蛋白调取与它结合的复合物,能检测到Smad4蛋白,说明NR2F2蛋白能与Smad4蛋白相互作用行使功能(图 3B)。

A. NR2F2结合蛋白预测;B. CO-IP结果 A. Prediction of NR2F2-binding proteins; B. The result of CO-IP 图 3 NR2F2结合蛋白预测及CO-IP结果 Fig. 3 The results of NR2F2 binding protein prediction and CO-IP

为了探究NR2F2基因是否调控Smad4基因的表达,检测了过表达和敲除NR2F2基因对Smad4基因表达的影响,发现过表达NR2F2基因后,Smad4基因表达量升高(P<0.01,图 4A),下游基因Cyclin BCDK1、CDK4、Cyclin D1表达量均显著上升(P<0.01,P<0.05,图 4C);而敲除NR2F2基因后,Smad4基因表达量降低(P<0.01,图 4B),下游基因Cyclin BCDK1、CDK4、Cyclin D1表达量均显著下降(P<0.01,图 4D)。

A. 过表达NR2F2后Smad4的表达变化;B. 敲除NR2F2后Smad4的表达变化;C. 过表达NR2F2后Smad4调控的下游基因的表达变化;D. 敲除NR2F2后Smad4调控的下游基因的表达变化。不同大写字母表示差异极显著(P<0.01);不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 下同 A. The expression change of Smad4 after overexpression of NR2F2; B. The expression change of Smad4 after knockout of NR2F2; C. The expression change of Smad4-regulated downstream genes after overexpression of NR2F2; D. The expression change of Smad4-regulated downstream genes after knockout of NR2F2. Different capital letters indicate extremely significant differences(P < 0.01); Different lowercase letters indicate significant differences(P < 0.05). The same as below 图 4 NR2F2基因对Smad4及下游基因表达的影响 Fig. 4 The effects of NR2F2 gene on the expression of Smad4 gene and downstream genes

挽救试验中,在过表达NR2F2基因后,干扰Smad4基因表达,Smad4表达量显著降低(P<0.01,图 5A),且能够显著缓解过表达NR2F2基因引起的Smad4下游基因Cyclin D1、Cyclin BCDK1的表达的升高,降低了它们的表达量(P<0.01,P<0.05, 图 5B)。通过检测增殖相关基因的表达,结果发现,干扰Smad4基因表达,能缓解过表达NR2F2基因对细胞增殖的影响,PCNAKi67的表达量显著降低(P<0.01,P<0.05, 图 5C)。

A. 干扰Smad4的效率;B. 过表达NR2F2且干扰Smad4后下游基因表达的变化;C. 过表达NR2F2且干扰Smad4后增殖基因表达的变化 A. Interference efficiency of Smad4; B. The expression change of Smad4-regulated downstream genes after overexpression of NR2F2 and interfering with Smad4; C. The expression change of proliferation related genes after overexpression of NR2F2 and interfering with Smad4 图 5 挽救试验结果 Fig. 5 The result of rescue experiment
3 讨论

NR2F2作为一种转录因子,在细胞的生命过程中起着重要的作用。啮齿类动物的遗传模型揭示了NR2F2基因在脂肪形成、脂质代谢、肝脏糖异生、胰岛素分泌和血压调节等生物过程中的重要作用[25-27]。本研究发现,在PK15细胞中,NR2F2基因促进细胞增殖。NR2F2基因对PK15细胞的生长促进作用是通过加速细胞周期从G1期到S期的进程来介导的。这些结果表明,NR2F2基因能促进细胞增殖。在之前的研究中,NR2F2已被证明在细胞的增殖中发挥促进作用。NR2F2在多种肿瘤细胞中高表达,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡[28]。在肾细胞癌细胞中,下调NR2F2可通过上调BRCA1来抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡[29]NR2F2通过调节IGF-1表达来调节小鼠出生后小脑的生长和成熟[30]。过表达NR2F2基因可改变细胞粘附蛋白和细胞增殖的表达[31]。敲除NR2F2后,Ki67基因表达减少,细胞增殖被抑制,凋亡细胞增加[32]NR2F2沉默后,细胞增殖和侵袭减少,细胞被阻断在G1期[33]。可见,NR2F2基因在细胞增殖中起着重要作用,但其具体的作用机制还需进一步研究。

NR2F2基因属于核受体转录因子家族。作为一种转录因子,NR2F2不直接调节激酶活性。NR2F2可能通过调节其他基因的表达来调节激酶活性。在不同的细胞模型中,ERαCEBP/αWnt10b已被证明受NR2F2的调控。在本研究中,通过蛋白质相互作用软件预测了一些与NR2F2相互作用的蛋白质,发现有15个蛋白可以与NR2F2相互作用,其中,Smad4比较值得注意。本研究采用Co-IP直接验证了PK15细胞中NR2F2蛋白与Smad4蛋白的结合。而过表达NR2F2可提高Smad4的水平。NR2F2的沉默可降低Smad4的水平。这说明NR2F2可能改变了Smad4基因的表达。

Smad4为抑癌基因,属于Smad家族。转化生长因子-β(TGF-β)信号可以通过以下反应激活:1)TGF-β与受体结合,然后诱导Smad2/3磷酸化;2)共同介质Smad4与磷酸化的Smads结合,然后迁移到细胞核;3)Smad复合物与各种转录因子相互作用,然后调节细胞的增殖和迁移。先前的研究表明,Smad4的缺失会影响细胞的增殖和迁移。敲除Smad4的细胞增殖较慢,细胞迁移减少[34-35]。miR-144可以靶向Smad4基因,降低Smad4基因的表达,从而抑制细胞增殖和迁移[36]Smad4基因表达水平的降低增加了对DNA拓扑异构酶抑制剂的敏感性,促进细胞凋亡,从而抑制细胞增殖[37]。这些研究表明Smad4可以调节细胞周期。

TGF-β信号通路在组织发育、稳态和修复中起着重要作用,并调控细胞增殖、分化、凋亡和迁移等细胞过程[38-39]。Smad4作为唯一的通用受体和TGF-β信号通路的中介,在将受体信号转导到核中的靶基因中起核心作用[40]Smad4的异常表达可引起细胞中TGF-β超家族成员的异常变化,影响下游靶基因的表达,并影响细胞的生长发育。细胞增殖周期相关因子是TGF-β信号通路的下游效应因子[41]。研究发现,敲除NR2F2可以显著下调细胞周期相关基因的表达;而过表达NR2F2可显著上调细胞增殖周期相关基因的表达。挽救试验中过表达NR2F2和干扰Smad4后,可以有效缓解过表达NR2F2基因的影响。这说明NR2F2通过与Smad4相互作用,影响TGF-β信号通路,从而影响细胞增殖周期相关因子的表达。因此,发现NR2F2通过影响Smad4基因的表达来影响细胞增殖。

4 结论

过表达NR2F2基因后促进了细胞的增殖,抑制了凋亡,且NR2F2蛋白能与Smad4蛋白结合并影响Smad4基因的表达,进而影响下游基因的表达。

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(编辑   郭云雁)