2. 哈尔滨商业大学药学院，哈尔滨 150076;
3. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457
, WANG Xuefeng2, ZHANG Mengjie1, YANG Juan1, SUN Yuelong1, ZHANG Zufeng2, ZHANG Yuxin2, DOU Jiahong3, WANG Ziying3, DAI Xiaofeng1
, LI Xiumei1
2. College of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China;
3. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China
仔猪腹泻作为养殖业中常见的仔猪疾病之一，病因复杂多样，主要包括传染性因素(病毒、细菌、寄生虫等)及非传染性因素(仔猪自身免疫不足、断奶应激、饲养环境等)[1]。它可引起仔猪食欲下降、生产性能下降，甚至导致较高病死率。目前常采用抗生素等药物治疗方法，虽成本低、见效快，但易产生较高耐药性，且复发率高。中兽医理论认为，仔猪腹泻是因体虚、正气不足及湿热等外邪侵入体内所致。为达到“标本兼治、扶正祛邪”的目的，部分中药复方已被广泛应用于预防和治疗仔猪腹泻[2-5]。其中，四黄止痢颗粒因治疗鸡、猪的湿热泻痢效果显著而逐渐受到关注。
四黄止痢颗粒是由黄连、黄柏、大黄、黄芩、板蓝根、甘草6味中药组成的中药成方制剂，收录于2020年版《中华人民共和国兽药典》[6]。四黄止痢颗粒具有清热泻火、止痢的功效，临床上多用于治疗湿热引起的鸡、猪泻痢以及细菌、病毒引起的热性疾病[7-8]。虽疗效显著，但其药味组成较多、配伍关系复杂，其相关功效物质基础及作用机制尚未阐明，且多数研究仅限于单一成分、单一靶点，缺少从系统网络水平来探索其配伍关系及作用机制方面的内容，限制了其临床应用。
网络药理学是一种以药物与疾病的相互作用为基础，通过网络分析阐明中药复方作用机制的新方法[9]。生物网络功能模块的识别和特征分析可在一定程度上简化网络结构，揭示其关键环节和核心机制[10]。MCODE(molecular complex detection)作为一种非交叠式聚类算法，最初用于检测蛋白相互作用网络中的蛋白质复合物，目前主要用于检测蛋白相互作用网络中紧密连接的区域，即功能模块的识别[11]。因此，本研究尝试在网络药理学的基础上，参考“模块药理学”的研究思路[12-13]，使用MCODE聚类算法对复杂网络进行分解和解构，筛选获得药物特异性高、疾病针对性强的网络(功能模块)，再对其进行通路富集与比较分析以及归经分析，从而全面揭示中药方剂的功效物质和作用机理。
本研究依据中兽医理论，尝试从“中药靶点-疾病靶点-生物通路-功能模块”多个层次进行关联网络分析，多维度揭示四黄止痢颗粒的作用机制，阐释其君臣佐使配伍规律，明确各单味药在复方发挥整体药效过程中的贡献，从而为新中兽药复方的发现以及应用提供参考[14]。
1 材料与方法 1.1 四黄止痢颗粒的组方理论方中黄连药性苦、寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，善于清中焦脾胃的湿热，为君药。黄柏归肾、膀胱经，善于清下焦湿热；黄芩归肺、胆、脾、大肠、小肠经，善于清上焦湿热。黄柏、黄芩药性苦、寒，二者配合可清上下焦湿热，为臣药，与黄连配伍加强清热燥湿，泻火解毒之效。大黄药性苦寒，善于泻下胃肠湿热；板蓝根有清热凉血的功效。大黄、板蓝根二者均能泻热，共为佐药。方中甘草调和诸药、缓急和中，为使药。诸药合用，共奏清热燥湿，凉血止痢之功。
1.2 四黄止痢颗粒活性成分的收集及药物靶点的预测通过检索TCMSP(https://tcmsp-e.com/)、TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)、HERB(http://herb.ac.cn/)数据库收集四黄止痢颗粒(黄柏、黄芩、黄连、大黄、板蓝根、甘草)的成分，利用口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%及类药性(drug-like index, DL)≥0.18作为筛选条件获得四黄止痢颗粒的潜在活性成分，同时筛选每个活性成分的对应靶点。
1.3 仔猪腹泻疾病相关基因与药物相关基因的差异分析以“piglet diarrhea”为关键词分别检索GeneCards、NCBI、OMIM数据库获取猪腹泻的相关靶点基因，去冗余后得到仔猪腹泻的潜在疾病靶点。使用Venny 2.1软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取四黄止痢颗粒的药物靶点和猪腹泻相关疾病靶点的交集，比较四黄止痢颗粒中6味中药的药物相关基因与仔猪腹泻疾病相关基因间的异同，分析二者的重叠基因和差异基因。
1.4 靶点蛋白相互作用网络(protein-protein interaction network, PPI)的构建及功能模块的识别将上述重叠基因导入UniProt(https://www.uniprot.org)数据库获得物种为“PIG”的标准蛋白名，上传至STRING数据库(https://string-db.org/)构建PPI网络图，设置物种为“Sus scrofa”，置信度≥0.04；运用Cytoscape 3.5.1软件构建四黄止痢颗粒的药物靶点-仔猪腹泻靶点的蛋白相互作用网络图。
1.5 模块的功能富集分析应用MCODE插件对上述PPI网络进行功能模块识别。MCODE聚类算法主要通过顶点加权的方式生成聚类，包括3个步骤：1)基于局部网络密度的节点赋权重；2)模块预测；3)后期处理操作。应用David数据库进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析，探讨四黄止痢颗粒治疗仔猪腹泻的关键靶点和相关信号通路。
2 结果 2.1 四黄止痢颗粒中活性成分的检索及靶点预测由表 1可知，通过检索TCMSP、TCMID、HERB数据库共获得活性成分180个。其中黄连活性成分10个(生物碱类8个、黄酮类1个、苷类1个)，黄柏活性成分21个(生物碱类12个、黄酮类1个，苷类2个、其它6个)，黄芩活性成分30个(生物碱类2个、黄酮类21个、苷类1个、其它6个)，大黄活性成分9个(蒽醌类2个、黄酮类1个、苷类3个、其它3个)，板蓝根活性成分27个(生物碱类2个、酮类4个、其它21个)，甘草活性成分83个(黄酮类51个、其它32个)。由图 1可知，除佐药含有蒽醌类代表性成分外，君、臣、佐药均含有生物碱、黄酮及苷类成分。通过检索GeneCards、NCBI以及OMIM数据库筛选获得四黄止痢颗粒的药物靶点共88个。
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表 1 四黄止痢颗粒的主要活性成分 Table 1 Main active ingredients of Sihuang Zhili granules |
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图 1 君臣佐使药的主要活性成分 Fig. 1 Main active ingredients of traditional Chinese medicine named monarch, minister, assistant and guide medicines |
由表 2及图 2可知，利用GeneCards、NCBI、OMIM数据库获取猪腹泻相关靶点并去重后得到470个，与四黄止痢颗粒药物靶点求交集得到35个。其中，君药、臣药、使药均能调控BCL2L1、CASP3、CAV1等28个靶点；佐药调控EDN1、HP、NR3C1及UCP2等17个靶点。另外，臣药还能调控靶点CYCS、NR3C1；使药能调控靶点HMGCR及SLPI。
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表 2 四黄止痢颗粒的关键靶点 Table 2 Key targets of Sihuang Zhili granules |
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图 2 四黄止痢颗粒与仔猪腹泻交集靶点的Venny图 Fig. 2 Venny diagram of the intersection targets between Sihuang Zhili granules and piglet diarrhea |
由图 3可知，靶点蛋白PPI网络包含33个节点、175条边。MCODE算法是根据复合物中每个蛋白的平均连接数量(即MCODE评分，MCODE评分=密度×节点数)对模块进行排序。MCODE算法在该PPI网络图中共识别1个模块(节点数>3)，包含17个节点(CASP3、EDN1、IL1B、IL1A、SERPINE1、CRP、NOS2、NOS3、SELE、BCL2L1、IFNG、TNF、NFKBIA、FOS、HMOX1、IL10、IL6)和103条边，评分12.875。
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圆形代表关键靶点(红色代表模块1的靶点)，灰色线条代表相互作用关系 The circle represents the key target (red represents the target of module 1), and the gray line represents the interaction relationship 图 3 四黄止痢颗粒治疗猪腹泻的PPI网络图及其功能模块 Fig. 3 The PPI network and functional module of Sihuang Zhili granules for treatment of piglet diarrhea |
比较君、臣、佐、使药作用的关键靶点和模块1包含的靶点发现，除EDNI外，模块1中16个蛋白与君、臣药作用的靶点存在交集，占比94%(16/17)；7个蛋白与佐药作用的靶点存在交集，占比41%(7/17)。可见，君、臣、使药作用的靶点基本包含模块1的整个模块，进一步确定模块1属于整个复方的功能模块，即发挥功效的关键靶点的集合。
2.4 功能富集分析及比较由图 4可知，四黄止痢颗粒中君药的作用靶点主要涉及IL-17、TNF、Inflammatory bowel disease等26个信号通路；臣药主要涉及IL-17、Salmonella infection、TNF等26个信号通路；佐药主要涉及IL-17、Estrogen、HIF-1等13个信号通路，使药主要涉及IL-17、TNF、Inflammatory bowel disease等26个信号通路；模块1主要涉及TNF、IL-17、HIF-1、NF-κB等17个信号通路。整个复方中君、臣、使药作用的主要信号通路基本一致；相较于君、臣、使药，佐药作用的通路数量减少，但均包含于它们作用的26个信号通路中；模块1作用的通路数量较佐药多，同样包含于它们作用的26个信号通路中。
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a. 君药作用的通路；b. 臣药作用的通路；c. 佐药作用的通路；d. 使药作用的通路；e. 模块1作用的通路 a. Pathways of monarch medicine action; b. Pathways of minister medicine action; c. Pathways of assistant medicine action; d. Pathways of guide medicine action; e. Pathways of module 1 action 图 4 KEGG富集分析 Fig. 4 KEGG enrichment analysis |
由图 5可知，君药黄连归脾、胃、大肠、心、胆、肝经；臣药黄芩归脾、大肠、胆、肺、小肠经，黄柏归肾、膀胱经；佐药大黄归脾、胃、大肠、肝、心包经，板蓝根归胃、心经；使药甘草归脾、胃、心、肺经。整个复方覆盖了动物机体的11个脏腑经络，且主要归脾、胃经，其次是大肠、心、肝、胆、肺、小肠、肾、膀胱和心包经。
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蓝色椭圆形代表脏腑经络，橙色长方形代表药物，线条代表药物对脏腑经络有调控作用(黄色线条代表君药对脾、胃、大肠、心、胆、肝经存在调控作用) The blue oval represents collateral channel of internal organ, the orange rectangle represents medicine, and the line represents the regulatory effect of medicine on collateral channel of internal organ (The yellow line represents the regulatory effect of monarch medicine on the spleen, stomach, large intestine, heart, gall bladder and liver meridians) 图 5 四黄止痢颗粒的归经分析 Fig. 5 The analysis of channel tropism of Sihuang Zhili granules |
《素问·至真要大论》：“主病之谓君，佐君之谓臣，应臣之谓使”。组成方剂的药物可按其在方剂中所起的作用分为君、臣、佐、使药。君指方剂中针对主证起主要治疗作用的药物；臣指辅助君药治疗主证，或主要治疗兼证的药物；佐指配合君臣药治疗兼证，或抑制君臣药的毒性，或起反佐作用的药物；使指引导诸药直达病变部位，或调和诸药的药物。
本研究通过网络药理学筛选发现，黄连、黄柏、板蓝根的功效物质为生物碱及苷类成分，黄芩、甘草的功效物质为黄酮及苷类成分，大黄的功效物质为蒽醌及苷类成分；比较分析四黄止痢颗粒中君(黄连)、臣(黄柏、黄芩)、佐(大黄、板蓝根)、使(甘草)药的成分后发现，除佐药含有蒽醌类代表性成分外，君、臣、佐药均含有生物碱、黄酮、苷类成分。现代药理学研究发现，黄连主要含有生物碱类成分，可减弱特异性免疫功能，同时具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用。黄连总生物碱中小檗碱含量最高，达10%，其次是巴马汀、黄连碱、小檗红碱等，均具有显著的药理活性[15]。其中小檗碱可通过抑制细菌内毒素、细菌表面蛋白排序酶活性[16]以及逆转大肠杆菌相关毒素的分泌[17]、调节肠道运动[18]、改善肠屏障功能治疗各种细菌相关性腹泻[19]。黄连碱、巴马汀可抑制大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌等的活性[20]，且黄连碱具有保护胃黏膜的作用[21]。小檗红碱作为小檗碱的主要代谢物之一，其抗炎、抗真菌效果显著[22-23]。黄柏主要含有生物碱、黄酮类成分，其中小檗碱不仅含量高达6%，且抗炎效果显著[24-26]。黄芩的主要成分为黄酮及其苷类成分，达130余种，具有显著的抗菌、抗病毒、抗炎及增强免疫功能的作用。其中黄芩苷、黄芩素可通过直接调节线粒体的凋亡途径，加速活化B、T细胞的凋亡发挥抗炎作用[27-28]。大黄的主要活性成分是蒽醌类，含量达3%~5%，共分离得到34种，其中芦荟大黄素、大黄素可通过抑制MAPK、核转录因子-κB和胞内磷脂酰肌醇-3激酶途径抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子的产生，从而发挥抗炎作用；大黄酸可通过影响Toll样受体5 (TLR5)/NF-κB信号通路, 减少炎症因子的分泌和淋巴细胞的浸润, 从而缓解小鼠溃疡性结肠炎[29-30]。板蓝根作为预防和治疗流感病毒的代表药，已有200余种化学成分被分离和鉴定，其中生物碱类成分具有抗炎、抗病毒、解热等药理作用；黄酮类成分具有较强的抗病毒作用[31-32]。甘草作为临床常用配伍药材，共分离得到300余种黄酮类化合物。甘草总黄酮可通过抑制ERK/MAPK、NF-κB通路及活化PPAR-γ通路，抑制炎症因子的表达从而发挥抗炎效果，其中有14种黄酮化合物能清除羟自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢、单线态氧以达到抗氧化的目的[33]。
综合以往的研究发现，6味药中生物碱、黄酮、蒽醌、苷类成分不仅含量丰富，且具有显著的药理活性。本研究表明，四黄止痢颗粒复方的主要功效物质并非单一的某个或某类成分，复方药效是多类成分共同作用的结果，这与本研究中网络筛选的结果一致。依据四黄止痢颗粒的组方理论进一步推测，各单味药之间可能通过共有成分相互联系、相互配合以发挥复方的整体药效。黄连作为复方君药，主要通过生物碱类成分对仔猪腹泻产生治疗作用；臣药中生物碱类成分可能辅助君药以增强胃肠道的调控功能及抗菌、抗炎作用；佐药中蒽醌、苷类成分均有较好的抗炎活性，可进一步配合君臣药发挥治疗作用；使药甘草的活性成分最多，药理作用广泛，可调和诸药药性。此推测在一定程度上符合复方的组方规则，且本研究也尝试从物质基础层面阐释四黄止痢颗粒中君臣佐使的配伍规律以及明确各单味药在复方发挥整体抗腹泻作用过程中的贡献，但后续仍需进一步的试验验证。
3.2 四黄止痢颗粒的作用靶点及功能模块蛋白相互作用网络结果发现，四黄止痢颗粒主要通过作用于35个关键靶点蛋白治疗仔猪腹泻，黄连作用于其中28个靶点，占比80%(28/35)；黄柏、黄芩不仅作用于黄连调控的所有靶点，还能调控靶点CYCS、NR3C1，甘草还能调控HMGCR、SLPI；大黄、板蓝根调控EDN1、HP、NR3C1等17个靶点，其中13个靶点与黄连的靶点重合。结果表明，黄连调控的关键靶点与其它药均存在较高的重合率，是四黄止痢复方中发挥主要治疗作用的药物，为君药；其它药物能够辅助或配合黄连发挥药效，符合中药复方的组方规则。在此基础上，本研究进一步识别并确定模块1为整个复方的功能模块。除EDNI外，其包含的16个蛋白与君药调控的靶点存在交集。CASP3，又称胱天蛋白酶3，属于细胞凋亡信号分子。有研究发现木犀草素、川芎嗪等中药成分能通过调控CASP3介导的外源性死亡受体和内源性线粒体凋亡途径抑制病毒感染诱导的细胞凋亡[34-36]。EDN1基因编码的蛋白为内皮素-1，是由血管内皮细胞合成的多功能肽类激素。有研究发现miRNAs与其结合后可参与奶牛乳脂代谢的调控[37]。IL-1是趋化因子家族的一种细胞因子，局部低浓度的IL-1主要发挥免疫调节作用。IL1A、IL1B是其两种不同的形式，二者结合相同的受体复合物，具有相似的生物学活性。IL1A主要参与调控细胞生长和免疫反应[38]。IL1B可通过抑制钠-钾-ATP酶的活性，抑制水、钠的吸收，促进腹泻及肠道运动功能紊乱的发生[39]。SERPINE1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，可介导细胞外基质的降解，促进细胞的侵袭和转移[40-41]。NOS属于一氧化氮合酶，参与产生信号分子NO。NOS2为钙非依赖型，在肠道炎症的发生过程中发挥保护和破坏的双重作用[42]。NOS3属于内皮型一氧化氮合酶，是内皮细胞合成NO的关键酶，有研究发现黄连素可上调一氧化氮合酶的基因和蛋白表达[43]。SELE是在免疫黏附中起作用的细胞表面糖蛋白，可参与机体肠胃炎性反应[44]。BCL2L1属于细胞死亡的有效抑制剂，可减轻炎症损害，抑制IL1B的释放，参与机体多种炎性反应[45]。IFNG是由T细胞和NK细胞等产生的Ⅱ型干扰素，通过激活效应免疫细胞和增强抗原呈递，在抗菌、抗病毒反应中发挥关键作用[46]。TNF是在急性炎症期间由巨噬细胞、单核细胞产生的一种炎症细胞因子[47]。IL-10是由多种细胞产生的抗炎细胞因子[48]。IL-6是在免疫、组织再生和代谢中具有多种生物学功能的促炎细胞因子[49]。NFKBIA是调控转录因子NF-κB进出细胞核的抑制剂[50]。FOS在信号转导、细胞增殖和分化中具有重要作用[51]。HMOX1是一种血红素加氧酶，能催化血红素分解代谢，促使血红素分解为胆绿素、亚铁离子和一氧化碳[52]。以往的研究结果表明模块1包含的靶点蛋白主要参与调控机体的炎症、免疫调节、氧化应激等过程。因此，本研究通过富集分析模块1的功能和通路有利于进一步探讨四黄止痢颗粒治疗仔猪腹泻的作用机制。
3.3 四黄止痢颗粒治疗仔猪腹泻的信号通路比较君、臣、佐、使药及模块1的KEGG通路富集分析结果发现，君、臣、使药能作用于相同的26条信号通路，佐药、模块1作用的信号通路均包含其中，进一步表明臣、佐、使药能辅助、配合君药发挥治疗作用，同时证明模块1是中药复方四黄止痢的功能模块。模块1主要涉及的通路包括TNF、IL-17、NF-κB等17个炎症相关信号通路。TNF-α是免疫的中间调节因子[53]，通过刺激NF-κB p65的磷酸化使其转移到细胞核，同时激活多种靶基因[54]，形成促炎反应的积极循环[55]。NF-κB信号传导是一种关键的促炎途径[56]。富集分析结果表明，四黄止痢颗粒主要通过作用于炎症相关信号通路以达到治疗仔猪腹泻的目的。
3.4 四黄止痢颗粒的归经分析归经，即药物作用的定位。归经分析是指把药物作用与动物机体的脏腑经络密切联系起来，以说明药物作用对机体某部分的选择性[57]。本研究通过对各单味药进行归经分析发现，复方四黄止痢颗粒能作用于动物机体11个脏腑经络，且主要归脾、胃经，其次是大肠、心等，表明四黄止痢颗粒趋向于选择调节脾、胃为主的多个脏腑经络以发挥止泻作用，从而为该复方的应用提供理论参考。
本研究通过综合分析四黄止痢颗粒的主要功效物质基础、作用靶点及功能模块、信号通路、归经，再次验证了中药复方多成分、多靶点、多途径以及多个作用部位的药理作用特点。此外，通过查阅《中华人民共和国兽药典》发现，四黄止痢颗粒的质量标准尚不完善，定性鉴别部分仅考虑君药黄连(盐酸小檗碱)、臣药黄芩(黄芩苷)、佐药大黄的薄层色谱鉴别，含量测定部分仅考虑黄芩苷的含量(每1 g四黄止痢颗粒含黄芩以黄芩苷计，不得少于4.8 mg)[58]。可见，四黄止痢颗粒的质量标准仍缺少臣药黄柏、佐药板蓝根、使药甘草的定性鉴别以及其他有效成分的含量鉴定。本研究通过开展中药靶点-疾病靶点-生物通路-功能模块多层次关联网络分析不仅揭示了四黄止痢颗粒治疗仔猪腹泻的关键作用机制，其筛选得到的生物碱、黄酮、蒽醌、苷类成分可作为反映中兽药复方四黄止痢颗粒的潜在质量标志物(quality marker, Q-markers)[59]，为进一步提高和完善四黄止痢颗粒的质量标准提供科学依据。
4 结论 4.1生物碱、黄酮、蒽醌、苷类成分是四黄止痢颗粒复方的主要物质基础，具有抗菌、抗炎、抗氧化等作用。方中君臣佐使药的主要活性成分种类各异，可能通过共有成分相互联系、相互配合以发挥四黄止痢颗粒复方的整体药效。
4.2四黄止痢颗粒主要通过作用于功能模块1调控TNF、IL-17、NF-κB等信号通路，调节脾、胃等脏腑经络，进而发挥治疗仔猪腹泻的作用。
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(编辑 范子娟)