2. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 兰州 730046
, KONG Xiangyu1,2, LI Xiangtong1,2, SUO Xuepeng1,2, DUAN Yueyue1,2, YUAN Cong1,2, SHI Lei1,2, ZHANG Yu1,2, MA Guoxiang1,2, ZHENG Haixue2
, WANG Qi1,2
2. Lanzhou Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Science, Lanzhou 730046, China
猪急性腹泻综合征是由猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)引起的一种猪肠道传染病，临床表现主要有感染仔猪急性腹泻、呕吐、5日龄内新生仔猪由于体重迅速下降和脱水而死亡，且死亡率高达90%[1-2]。SADS-CoV首次于2017年1月在中国广东省暴发，导致24 693头仔猪死亡[3-4]。2017年5月—2019年1月，广东猪场再没有出现新的SADS病例。然而，2019年2月中国南方再次出现SADS-CoV的感染，导致约2 000头仔猪死亡[5]。另外，有研究表明，从2020年7月1日至9月30日11个省份，包括陕西、云南、广东、江西、河南、湖北、湖南、青海、安徽和山西等发生腹泻的猪场收集300份血清样本，发现SADS-CoV血清阳性率高达81.7%(245/300)，说明这些地区存在SADS-CoV的感染，应该加强防控措施以防SADS-CoV的流行[6]。SADS-CoV与人冠状病毒229E/NL63进化距离较近，二者均可利用人的血管紧张素转化酶2(ACE2)作为入侵受体，在体外可感染人、猪、蝙蝠、小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠、鸡和灵长类细胞等，说明SADS-CoV具有跨种传播的潜在威胁[7-8]。然而，SADS至今还没有有效的疫苗和诊断试剂可用。
SADS-CoV是套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的成员，其基因组大小约27 kb。SADS-CoV与蝙蝠冠状病毒HKU2密切相关，核苷酸序列相似性达到90%以上，包含5′-UTR、ORF1a/1b、刺突蛋白(S)、非结构蛋白3(NS3)、包膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、非结构蛋白7a(NS7a)和3′-UTR[3, 9]。SADS-CoV N基因编码区长度为1 128个碱基，共编码375个氨基酸，蛋白分子质量约为41.7ku。N蛋白是一种磷酸化的蛋白，与病毒RNA结合形成核糖核衣壳，参与病毒复制、转录、翻译和病毒粒子的组装[10-11]。此外，N蛋白能够抑制宿主Ⅰ型干扰素的分泌，进而逃避宿主的免疫监测系统，促进病毒的复制[12-13]。N蛋白的免疫源性强、在不同毒株之间高度保守，且在病毒感染过程中大量表达，因此，可以作为病毒诊断候选蛋白。本研究将SADS-CoV N基因克隆至原核表达载体pET32a中，经过诱导表达，获得可溶性的蛋白；利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白，免疫小鼠制备抗SADS-CoV N蛋白单克隆抗体，进而为开发SADS-CoV新型诊断试剂以及研究该病毒的致病机制、N蛋白功能及结构提供了有用的工具。
1 材料与方法 1.1 细胞、毒株、实验动物与试剂人肝癌细胞Huh7和pET32a载体由本实验室保存。SADS-CoV GDS04毒株由中山大学曹永长教授馈赠[3]。SPF级6周龄BALB/c小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。T4 DNA连接酶、蛋白Marker及限制性内切酶XhoⅠ与BamHⅠ购自NEB(北京)有限公司。大肠杆菌DH5α和BL2l(DE3)、反转录试剂盒、PrimeSTAR Max DNA聚合酶及核酸Marker购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取及胶回收试剂盒为Omega公司产品。HAT和HT培养基添加剂、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。DMEM培养基，胎牛血清购自Gibco公司。
1.2 pET32a-N重组质粒的构建以SADS-CoV GDS04毒株N蛋白(GenBank登录号：MF167 434.1)为参考，设计特异性引物，上游P1 ∶5′-CGCGGATCCATGGCCACTGTTAATTGG-3′，下游P2∶5′-CCGCTCGAGCTAATTAATAATCTCATC-3′，在上下游引物5′端引入BamHⅠ与XhoⅠ酶切位点(下划线部分)。引物合成后，以SADS-CoV GDS04毒株cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL，P1和P2各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O补至50 μL。反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。按Omega公司EZNAGel Extraction Kit的使用说明书进行胶回收。
N基因PCR胶回收产物与pET32a载体用BamHⅠ与XhoⅠ双酶切后，进行连接、转化DH5α感受态细胞。将构建好的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切鉴定为阳性的质粒再进行测序鉴定，阳性重组质粒命名为pET32a-N。
1.3 重组N(rN)蛋白的诱导表达及纯化将测序正确的重组质粒pET32a-N转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落于5 mL氨苄抗性的LB中，待OD600 nm约为0.8时，加入终浓度为1 mmol·L-1的IPTG进行诱导表达。诱导后5 h，12 000 r·min-1离心2 min收集沉淀，沉淀用适量的PBS重悬后，进行超声处理5 min(超声3 s，停3 s)，超声后4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，分别收集上清和沉淀。取上清液和沉淀加入5×loading buffer，沸水中煮沸10 min，进行SDS-PAGE鉴定。pET32a-N蛋白成功表达后，扩大培养，取超声后裂解上清，进行Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白，并利用SDS-PAGE分析蛋白纯度。
1.4 动物免疫选取6周龄雌性BALB/c小鼠3只，将纯化的rN蛋白按30 μg·只-1的量免疫小鼠。首次免疫，将rN蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀后进行乳化，采用多点皮下注射免疫小鼠(背部一个点，腹部两个点)。每隔2周进行加强免疫，共免疫四次，加强免疫是将rN蛋白和弗氏不完全佐剂等体积混匀进行乳化，免疫方法同首次免疫。四免后7 d尾部采血测定抗体效价。
1.5 ELISA方法检测多克隆抗体效价将SADS-CoV病毒液与包被液1 ∶1稀释包被ELISA板，50 μL·孔-1，4 ℃过夜包被，用PBST洗四次后，加入2%海藻糖4 ℃封闭10 h。将阳性血清和阴性血清用PBST倍比稀释，稀释梯度从1 ∶100至1 ∶12 800，稀释8个梯度，37 ℃作用30 min，PBST洗4次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1 ∶20 000稀释)，50 μL·孔-1，37 ℃作用30 min，PBST洗4次后，TMB室温显色10 min，最后用2 mol·L-1 H2SO4终止，随后置酶标仪上测定OD450 nm。
1.6 间接免疫荧光(IFA)检测多克隆抗体的反应性将0.01 MOI的SADS-CoV感染Huh7细胞，病毒感染后36 h，用4%的多聚甲醛室温固定细胞30 min，用PBS洗3次，加入0.1%的TritonX-100通透细胞，室温作用10 min，PBS洗三次，N蛋白免疫鼠多抗血清及健康鼠血清用PBS稀释(1 ∶500)加入病毒感染细胞，37 ℃作用1 h，PBS洗三次后，随后孵育FITC-抗鼠二抗(1 ∶100)，37 ℃作用1 h，PBS洗三次后，DAPI染细胞核，室温作用10 min，PBS洗三次后，置荧光显微镜下观察。
1.7 单克隆抗体的制备选取抗体效价最高的小鼠，取其脾，置细胞筛中研磨，将脾细胞与SP2/0细胞利用PEG进行细胞融合，随后加入HAT培养基进行培养。大约10 d后，融合细胞集落增殖到合适大小，利用间接ELISA方法筛选阳性细胞孔，阳性孔细胞再经过3次亚克隆后，可获得针对N蛋白的阳性杂交瘤细胞株。
1.8 腹水的制备及纯化取10~12周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5 mL，1周后每只小鼠腹腔注射5×105个杂交瘤细胞(0.2 mL)，7~10 d后，鼠体腹腔明显隆起，采集腹水。收集的腹水按照PIERCE公司NAbTM Protein G Spin Purification Kit进行亲和层析纯化，后经SDS-PAGE电泳鉴定纯度。
1.9 单克隆抗体反应性的验证1.9.1 间接ELISA检测 将纯化的rN蛋白(100 ng·孔-1)、SADS-CoV病毒液(1 ∶1)或His标签的无关蛋白(isotype control，100 ng·孔-1)用包被液进行稀释包被ELISA板，其包被和封闭条件同“1.6”。采集的腹水或无关单抗(1 ∶1 000)用PBST稀释，50 μL·孔-1，加入ELISA板，37 ℃作用30 min，PBST洗四次后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1 ∶20 000稀释)，50 μL·孔-1，37 ℃作用30 min，PBST洗四次后，TMB室温显色10 min，最后用2 mol·L-1 H2SO4终止，随后置酶标仪上测定OD450 nm。
1.9.2 间接免疫荧光(IFA)检测 将腹水用PBS稀释(1 ∶500)加入SADS-CoV感染细胞，37 ℃作用1 h，PBS洗三次后，随后孵育FITC-抗鼠二抗(1 ∶100)，37 ℃作用1 h，PBS洗三次后，DAPI染细胞核，室温作用10 min，PBS洗三次后，置荧光显微镜下观察。
1.9.3 Western blot检测 取纯化的rN蛋白或收集病毒感染和未感染的Huh7细胞进行SDS-PAGE，随后将蛋白胶转移至NC膜上，进行Western blot验证。一抗为单克隆抗体用PBST稀释(1 ∶5 000)，室温作用1 h，用PBST洗四次，随后加入HRP-抗鼠IgG二抗(1 ∶10 000)，室温作用1 h，用PBST洗四次，置化学发光(ECL)成像仪进行显色。
1.10 单克隆抗体的亚类鉴定按照Southern Biotech公司的SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明对所获得的单抗进行抗体亚类鉴定。
1.11 单克隆抗体识别表位的初步鉴定将N基因截短为三段R1(编码1―142 aa)，R2(编码143―264 aa)及R3(编码265―364 aa)，根据这三段基因序列设计特异性引物，R1-P1引物同P1引物，R1-P2 ∶5′-CCGCTCGAGCTAAACAACAGTCAGGTCT-3′；R2-P1 ∶5′-C CGCGGATCCGAGGTTACTTCTAGAAGTG-3′，R2-P2 ∶5′-CCGCTCGAG CTAACCGTGCTGAACGAGGTCA-3′；R3-P1 ∶5′-CGCGGATCCGTTGAAGCTAAGCACTTTC-3′，R3-P2引物同P2引物。按照“1.2”及“1.3”操作方法构建重组质粒并诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE后转移至NC膜，孵育抗N蛋白单克隆抗体进行Western blot鉴定。
1.12 单克隆抗体可变区基因PCR扩增与序列测定利用RNA提取试剂盒提取单克隆抗体杂交瘤细胞RNA，利用Oligo-dt或随机引物将其逆转录合成cDNA。抗体可变区基因采用套式PCR扩增。抗体可变区基因扩增的引物参照文献[14]。以上述cDNA为模板，利用第一轮鼠源抗体IgG及κ轻链引物扩增抗体可变区基因，然后以第一轮产物为模板，利用第二轮鼠源抗体IgG及κ轻链引物扩增抗体可变区基因。PCR反应体系：PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL，P1和P2各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O补至50 μL。反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。
扩增完成后进行1%琼脂糖凝胶电泳，重链、κ轻链可变区基因大小约为300 bp，切胶回收目的片段。将回收的目的片段插入pMD-19 T载体中，进行序列测定。
2 结果 2.1 N基因的扩增及重组质粒的构建以SADS-CoV cDNA为模板扩增N基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图 1A所示，N片段大小约为1 000 bp。N基因PCR胶回收产物与pET32a载体用BamHⅠ与XhoⅠ双酶切后，进行连接、转化DH5α感受态细胞。将构建好的重组质粒pET32a-N进行双酶切鉴定，酶切结果如图 1B所示，双酶切产物在5 000 bp以上(载体条带)及在1 000 bp左右(目的片段)处均出现条带，与预期相符。将酶切鉴定为阳性的质粒进行测序鉴定，测序结果与目的序列一致。
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A. N基因PCR扩增(M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1. N基因；2. 阴性水对照)；B. 重组质粒pET32a-N的双酶切鉴定(M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1. pET32a-N质粒) A. Amplification of N gene by PCR (M. DL2000 DNA marker; 1. N gene; 2. Negative control); B. Identification of pET32a-N recombinant plasmid by double enzyme digestion (M. DL2000 DNA marker; 1. pET32a-N plasmid) 图 1 N基因的PCR扩增及重组质粒pET32a-N的双酶切鉴定 Fig. 1 Amplification of N gene by PCR and identification of pET32a-N recombinant plasmid by double enzyme digestion |
重组质粒pET32a-N转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，加入终浓度为1 mmol·L-1的IPTG进行诱导表达，诱导产物超声处理后进行SDS-PAGE鉴定，结果显示rN在上清和沉淀中均有表达(图 2A)，说明N蛋白有部分是可溶性的，因此，采用Ni-NTA亲和层析方法对该蛋白进行纯化。由图 2B可见，获得了纯度较高的N蛋白。
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A. rN蛋白诱导表达产物的SDS-PAGE分析(M. 蛋白质相对分子质量标准；1. rN诱导前；2. rN裂解上清；3. rN裂解后沉淀)；B. SDS-PAGE鉴定rN蛋白纯化产物(M. 蛋白质分子质量标准；1. 纯化后的rN蛋白) A. Expression analysis of rN protein by SDS-PAGE (M. Protein molecular weight marker; 1. rN pro-induced products; 2. Suspension of rN lysate; 3. Precipitate of rN lysate); B. Purification of recombinant protein of rN analyzed by SDS-PAGE (M. Protein molecular weight marker; 1. Purified protein of rN) 图 2 rN蛋白诱导的诱导表达及纯化 Fig. 2 Expression and purification of rN protein |
纯化的rN蛋白免疫BALB/c小鼠，共免疫四次，随后进行抗体效价检测。用SADS-CoV灭活后的病毒液包被ELISA板，以未免疫小鼠血清作为阴性对照(NC)，结果显示，血清1 ∶12 800稀释时，1、2和3号免疫鼠OD450 nm与NC组的OD450 nm的比值大于2.0，说明该抗体效价能达到1 ∶12 800以上(图 3A)。其次，通过IFA试验验证发现免疫后的鼠血清与SADS-CoV反应性良好，均能检测到特异性绿色荧光信号(图 3B)。
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A. ELISA检测N蛋白多克隆抗体效价；B. IFA检测N蛋白多克隆抗体与病毒的反应性 A. The titer of polyclonal antibody of N protein was detected by ELISA; B. The reaction of polyclonal antibody of N was identified by IFA analysis 图 3 N蛋白多克隆抗体的效价及反应性鉴定 Fig. 3 Identification of the titer and reactivity of polyclonal antibody of N protein |
通过细胞融合技术，筛选得到5株特异性识别SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体，将其命名为1C10、4B10、6G1、6F3和6E8。IFA结果显示，这5株单克隆抗体作用SADS-CoV感染的Huh7细胞均能够检测到特异性的绿色荧光信号，而SP2/0细胞上清液(NC)作用SADS-CoV感染细胞未见荧光信号(图 4A)。ELISA鉴定结果显示，这5株单抗均与rN蛋白反应，而只有6E8与SADS-CoV反应；此外，在His标签无关蛋白组(isotype control)，只有阳性血清反应(PC)，其余均不反应，进一步说明获得的单抗是针对SADS-CoV N蛋白的单抗(图 4B)。Western blot结果显示，这5株单克隆抗体均能识别纯化的rN蛋白以及病毒感染细胞中的N蛋白(图 4C~G)。
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A. IFA鉴定mAb与SADS-CoV的反应性；B. ELISA鉴定mAb与rN蛋白及SADS-CoV的反应性；C~G. Western blot检测mAb 1C10(C)、4B10(D)、6G1(E)、6F3(F)和6E8(G)与rN蛋白及SADS-CoV感染表达N蛋白的反应性(M. 蛋白质相对分子质量标准；1. 重组N蛋白；2. 未感染SADS-CoV的Huh7细胞；3. 感染SADS-CoV的Huh7细胞) A. The reactivity of the mAbs with SADS-CoV was identified by IFA; B. The reactivity of the mAbs with the rN protein or SADS-CoV was identified by ELISA; C-G. The reactivity of the mAbs 1C10 (C), 4B10 (D), 6G1 (E), 6F3 (F), and 6E8 (G) with the rN protein or the native N protein in cells infected with SADS-CoV was identified by western blot (M. Protein molecular weight marker; 1. The purified rN protein; 2. SADS-CoV mock-infected Huh7 cells; 3. SADS-CoV-infected Huh7 cells) 图 4 单克隆抗体(MAb)特异性鉴定 Fig. 4 Identification of the specificity of monoclonal antibodies (MAbs) |
按照小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对1C10、4B10、6G1、6F3和6E8单抗进行亚型鉴定，鉴定结果显示，1C10、4B10、6G1和6F3单抗重链恒定区为IgG1型，6E8为IgG2a型，它们的轻链恒定区为Kappa型(图 5)。
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图 5 单克隆抗体(MAb)亚类鉴定 Fig. 5 Subclasses identification of monoclonal antibodies (MAbs) |
为了鉴定单克隆抗体识别N蛋白的表位，将N蛋白进行如图 6A所示的截短，重组质粒分别命名为R1、R2和R3。将R3插入原核表达载体pET32a中不能诱导表达该蛋白，R1和R2均能表达(图 6B)。Western blot结果显示，5株单抗均能识别R1，而不能识别R2(图 6C~G)。因此，5株单抗识别区域为1―142 aa。
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A. N蛋白截短示意图；B. R1和R2的诱导表达(M. 蛋白质相对分子质量标准；1. R1诱导前；2. R1裂解上清；3. R1裂解后沉淀；4. R2诱导前；5. R2诱导表达菌)；C~G. Western blot检测单抗1C10(C)、4B10(D)、6G1(E)、6F3(F)和6E8(G)与R1及R2蛋白的反应性(M. 蛋白质相对分子质量标准；1. R1蛋白；2. R2蛋白) A. Diagram of N protein truncation; B. Expression analysis of R1 and R2 protein by SDS-PAGE (M. Protein molecular weight marker; 1. R1 pro-induced products; 2. Suspension of R1 lysate; 3. Precipitate of R1 lysate; 4. R2 pro-induced products; 5. R2 induced products); C-G. The reactivity of the mAbs 1C10 (C), 4B10 (D), 6G1 (E), 6F3 (F), and 6E8 (G) with the rN protein or the native N protein in cells infected with the R1 and R2 protein was identified by western blot (M. Protein molecular weight marker; 1. The R1 protein; 2. The R2 protein) 图 6 单克隆抗体(MAb)识别表位初步鉴定 Fig. 6 Preliminary identification of the epitopes of monoclonal antibodies (MAbs) |
从1C10、4B10、6G1、6F3和6E8杂交瘤细胞cDNA中扩增得到大小约为300 bp重链可变区(HV)和轻链可变区(LV)的PCR产物(图 7A和B)，与预期扩增产物大小一致；切胶回收后，克隆至pMD19 T载体测序。将测序结果与抗体基因库(IMGT)进行比对分析，单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的互补决定区(complementarity determining region, CDR)序列如下表 1所示。HV序列分析结果显示，1C10和6F3具有相同的CDR1和CDR2序列，根据测序结果并没有得到CDR3序列；4B10、6G1和6E8的CDR1、CDR2和CDR3序列均不同。LV序列分析结果显示，1C10和6E8具有相同的CDR1、CDR2和CDR3序列；4B10、6G1和6F3的CDR1、CDR2和CDR3序列均不同。
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A. PCR扩增重链可变区；B. PCR扩增轻链可变区；M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1. 阴性对照；2. 1C10；3. 4B10；4. 6G1；5. 6F3；6. 6E8 A. Amplification of heavy chain variable (HV) by PCR; B. Amplification of light chain variable (LV) by PCR; M. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2. 1C10; 3. 4B10; 4. 6G1; 5. 6F3; 6. 6E8 图 7 PCR扩增单克隆抗体(MAb)可变区 Fig. 7 Amplification of monoclonal antibodies (MAbs) variable region by PCR |
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表 1 抗体可变区CDR序列 Table 1 CDR sequences of antibody variable region |
近年来，冠状病毒呈现新发和再发现象，对人类及家畜的健康构成极大的危害，引起了国内外学者的广泛关注。SADS-CoV是一种蝙蝠来源的新型猪肠道冠状病毒[15]。目前为止，已知的猪肠道冠状病毒有四种，除SADS-CoV外，还包括猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)和猪丁型冠状病毒(porcine delta coronavirus, PDCoV)[16]。SADS-CoV的临床症状与PEDV、TGEV和PDCoV极为相似，在临床上这几种疾病很难区分，这为SADS-CoV的确诊带来一定的困难。另外，SADS-CoV与PEDV、TGEV和PDCoV的混合感染增加了猪的发病率和死亡率。由于人们对SADS-CoV从蝙蝠感染猪的发病机制不清楚，目前还没有特别有效的防控措施。
冠状病毒N蛋白具有较好的保守性，常作为检测靶标来监测病毒的感染。有研究表明，根据SADS-CoV N蛋白的基因序列设计特异性引物，建立RT-PCR、SYBR Green或Taq Man荧光定量RT-PCR以及实时荧光RT-LAMP检测方法能够快速、准确的检测SADS-CoV[17-21]。由于SADS-CoV相应抗体的缺乏，进而限制了对病毒蛋白的检测。周芝海等[22]利用原核表达系统表达重组N蛋白，免疫小鼠制备的多克隆抗体能特异性识别SADS-CoV，说明N蛋白具有较好的免疫原性。相对于多克隆抗体，单克隆抗体由一个B细胞活化增殖的细胞群分泌而来，具有特异性强、敏感性高以及纯度高等特点。本研究通过细胞融合技术，制备了5株特异性识别SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体。ELISA鉴定结果表明，5株单抗均能特异性识别rN蛋白，而除了6E8单抗外，其余4株(1C10、1B10、6G1、6F3)均不与SADS-CoV反应，推测其原因可能是4株单抗识别N蛋白的表位没有暴露出来，致使不能与病毒结合。IFA及Western blot结果表明，5株单抗不仅能识别rN蛋白而且识别SADS-CoV感染后表达的N蛋白，说明获得的抗体具有良好的反应性。亚类鉴定结果表明，获得的5株单抗的轻链均为κ链，除6E8的重链为IgG2b外，其余4株为IgG1型。表位初步鉴定结果显示，5株单抗识别N蛋白的1—142 aa。利用细胞融合技术，Han等[23]获得了1株特异性识别SADS-CoV N蛋白的单克隆抗体3E9，表位鉴定结果表明，该单抗识别表位为343DAPVFTPAP351，位于R3区(265—376 aa)，说明本实验室获得的单抗识别表位与3E9不同。
抗体可变区是抗体识别和结合抗原的关键区域。利用套式PCR技术，作者扩增获得了这5株单克隆抗体的抗体可变区基因序列，后期可以采用常规基因工程或蛋白质工程方法获得本研究的单克隆抗体。抗体可变区由4个框架区(framework region，FR)和3个CDR组成。FR氨基酸序列相对比较保守，而CDR则变化较大。CDR是抗体特异性结合抗原的关键区域[24]。HV序列测定分析表明，1C10和6F3具有相同的CDR1和CDR2序列；4B10、6G1和6E8的CDR1、CDR2和CDR3序列均不同。LV序列分析结果显示，1C10和6E8具有相同的CDR1、CDR2和CDR3序列；4B10、6G1和6F3的CDR1、CDR2和CDR3序列均不同。本研究为后续研究N蛋白的生物学功能、开展SADS-CoV相关的一系列基础性研究以及病原诊断试剂的开发奠定了基础。
4 结论利用原核表达系统成功表达了SADS-CoV N蛋白，用表达的N蛋白免疫BALB/c小鼠，获得5株能特异性识别N蛋白的单克隆抗体，其中，1C10、4B10、6G1和6F3重链为IgG1型，6E8为IgG2a型，它们的轻链为Kappa型。截短表达分析表明，5株单抗识别N蛋白的区域为1―142 aa。本研究为SADS-CoV新型诊断方法的开发以及SADS-CoV N蛋白功能及结构的研究奠定了基础。
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(编辑 白永平)