2. 甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心, 兰州 730070
, PAN Yangyang1,2, WANG Meng1,2, WANG Jinglei1, MA Wenbin1, GAO Xiang1, ZHANG Hui1, CUI Yan1,2, YU Sijiu1,2, WANG Libin1,2
2. Technology and Research Center of Gansu Province for Embryonic Engineering of Bovine and Sheep, Lanzhou 730070, China
自噬(autophagy)是一种细胞内成分自我清除和自我更新的过程。根据底物识别和作用方式不同分为分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)、微自噬(microautophagy)和巨自噬(macroautophagy)。自噬发生时，细胞内衰老或损伤的成分被具有双层膜结构的自噬体包裹，进而与溶酶体结合并降解，完成细胞内的自我清除和自我更新[1]。微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)蛋白是自噬发生过程中表达的重要蛋白之一，在胞浆内以LC3-Ⅰ的形式存在，自噬发生时LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ并定位于自噬体膜上。当自噬体与溶酶体结合时，自噬体内膜上的LC3-Ⅱ蛋白被降解，外膜上的LC3-Ⅱ蛋白被切割修饰后变为LC3-Ⅰ蛋白[2]。LC3蛋白分为A、B、C三种亚型[3]，其中LC3B在自噬过程中发挥双重作用，既作为吞噬细胞形成的重要细胞因子，又作为快速mRNA降解的RNA结合蛋白[4]。LC3B蛋白作为自噬体膜上的标记蛋白，与自噬体的发育和成熟有关，常用来监测自噬水平[5]。
在哺乳动物的繁殖过程中自噬参与配子的分化、生成及早期胚胎发育[6-9]。在雄性动物生殖系统中，支持细胞在生精细胞生成过程中起保护和营养作用[10]。据报道，自噬缺陷会影响支持细胞的骨架结构，破坏支持细胞与生精细胞联系，进而抑制精子的生成[11]。此外，自噬参与顶体反应，对精卵融合起着重要作用[12]。在雌性动物生殖系统中，自噬促进黄体细胞分泌孕酮，维持妊娠[13]。在子宫内膜粘连的小鼠中，子宫内膜自噬水平低，并且以子宫内膜纤维化为特征[14]。子宫内膜发生自噬，对胚胎植入至关重要，并且在妊娠早期发挥着重要作用[15]。有试验证据表明，自噬相关基因Atg16L是小鼠子宫内膜蜕膜化的必需基因[16]。研究发现，自噬缺陷型小鼠表现为原发性卵巢功能不全，导致生育力低下[17]。通过低氧诱导颗粒细胞发生自噬，可以促进颗粒细胞发生分化和黄体形成[18]。颗粒细胞敲除Beclin1构建的自噬缺陷型模型中，小鼠分泌孕酮的量显著减少，从而导致流产[13]。研究表明，自噬完全缺陷型胚胎停滞在4细胞到8细胞阶段，最终导致胚胎死亡，且自噬缺陷型胚胎蛋白合成率也降低了30%[19]。LC3B蛋白作为自噬发生的标识蛋白，在相关研究中被用来检测自噬的发生和评估自噬通量。
牦牛(Bos grunniens)是我国青藏高原重要的动物资源，也是牧民经济收入的主要来源之一。由于自然条件恶劣，饲养水平低下，牦牛的自然繁殖率较低，如何提高牦牛的繁殖率越来越受到重视。目前有关LC3B蛋白在牦牛生殖活动中作用机理的研究较少，且未见商业化的牦牛LC3B蛋白抗体。为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中的作用，本研究通过基因克隆、原核表达和动物免疫的方法制备牦牛特异性LC3B蛋白多克隆抗体，并应用于牦牛生殖器官中LC3B蛋白表达检测，以期为牦牛体内LC3B蛋白和繁殖过程中自噬的研究提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与样品采集1.1.1 试验动物 日本大耳白兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所，10月龄，室内饲养，饮水充足，健康状况良好。
1.1.2 样品采集 本试验中所用牦牛睾丸、卵巢、子宫、输卵管等样品来自于青海省某屠宰场。健康成年牦牛经颈动脉放血屠宰后，30 min内采集组织样，修剪周围结缔组织后用生理盐水冲洗干净，分别储存于液氮和4% 多聚甲醛溶液中运回实验室备用。牦牛输卵管上皮细胞样品由甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心提供。
1.2 主要仪器与试剂PCR仪购自德国艾本德公司，超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物公司，酶标仪购自美国Thermo公司，显微拍照仪购自日本Olympus公司，Taq PCR Master Mix、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒购自湖南艾科瑞生物公司，Trizol试剂盒、RIPA裂解液、通用型DNA纯化回收试剂盒购自北京全式金公司，pMDTM19-T Vector Cloning Kit、JM109感受态细胞均购自日本TaKaRa公司，pET-32a载体质粒购自美国Thermo公司，6×蛋白上样缓冲液、氨苄青霉素(ampicillin, Amp)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside, X-gal)，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG(isopropyl-β-D-thiogal-actopyranoside, IPTG)均购自北京Solarbio公司，Western blot所用试剂均购自武汉博士德公司，GoatAnti-Rabbit IgG/HRP antibody、SP试剂盒及DAB试剂盒购自北京Bioss公司，Protein marker购自加拿大Fermentas公司，亲和层析柱料购自美国GE Healthcare公司，佐剂购自上海Sigma Aldrich公司，感受态细胞BL21(DE3)、PMSF购自北京碧云天公司。
1.3 牦牛LC3B基因克隆1.3.1 引物设计 参照GenBank公布的牛(Bos taurus)LC3B基因序列(NM_001 001 169.1), 利用Primer 5进行引物设计，由上海生工进行引物合成，引物序列为LC3B-F：CACGAGCCAACTCGC，LC3B-R：ATCGGTGATTAGATGAACT，产物长度为519 bp，退火温度为54 ℃，用于克隆牦牛LC3B基因。
1.3.2 总RNA的提取及反转录 以体外培养的牦牛输卵管上皮细胞为材料，参照Trizol试剂盒说明书提取牦牛输卵管上皮细胞总RNA，并进行反转录合成cDNA，-20 ℃保存。
1.3.3 LC3B基因的扩增与克隆 以cDNA为模板对LC3B基因进行扩增。反应体系为20 μL：2×Exp Taq HS PCR Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，dd H2O 7 μL；反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；4 ℃保存。反应结束后用1% 琼脂糖凝胶进行电泳验证。将胶回收产物与pMD-19 T vector连接转化入DH5α感受态细胞(Escherichia coli)并涂布于LB(Luria-Bertani) 固体培养基(Amp，X-gal，IPTG)，过夜培养，挑取阳性单克隆菌落接种于LB液体培养基(Amp) 摇菌16 h，吸取100 μL菌液并送往北京擎科生物科技有限公司测序。
1.3.4 牦牛LC3B基因生物信息学分析 用NCBI-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对牦牛LC3B基因进行同源性比对；利用MEGA7.0绘制进化树；用NCBI在线软件进行开放阅读框分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)；用在线软件预测LC3B蛋白的二级结构(http:bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)、三级结构(https://swissmodel.Expasy.org)，分析LC3B蛋白的理化性质(https://web.expasy.org/protparam)，用在线软件分析LC3B蛋白亲疏水性(https://web.expasy.org/protscale)，用在线软件TMHMMServerV2.0预测跨膜结构域(http:www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和磷酸化位点(http:www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)。
1.4 LC3B重组质粒的构建与原核表达测序比对正确的LC3B基因由武汉戴安生物技术有限公司合成，与表达载体pET-32a(该载体含有Trx和His标签蛋白，分子量约为20 ku)连接。将构建好的阳性质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞，接种氨苄抗性LB培养基，过夜；挑选转化平板的4个单克隆，分别接种3 mL抗性液体培养基；37 ℃，220 r·min-1培养至OD600 nm为0.5~0.6，加入0.5 mmol·L-1 IPTG 20 ℃诱导表达3.5 h；离心收集菌体，超声破碎，SDS-PAGE检测表达情况。
1.5 LC3B重组蛋白的纯化选择原核表达良好的60 μL菌株接种至200 mL抗性液体培养基，37 ℃，220 r·min-1培养过夜。加入新鲜抗性培养基至800 mL，培养2 h至OD600 nm为0.5~0.6。加入200 μL的1 mol·L-1 IPTG 37 ℃诱导表达3.5 h。4 ℃离心收集菌体(66 r·s-1，15 min)，弃上清，加入30 mL PBST悬浮菌体，加入终浓度1 mmol·L-1 PMSF，超声波200 W破碎6 min之后摇床4 ℃孵育1 h。4 ℃高速离心(133 r·s-1，15 min)，取上清，加入400 μL于镍柱中，4 ℃过夜。收集镍柱(33 r·s-1，5 min)，用20 mmol·L-1咪唑洗脱液洗涤磁珠，洗去杂蛋白(1 mL，3次)。加入300 μL 300 mmol·L-1咪唑洗脱液与磁珠充分结合1 h，离心收集上清。再次向磁珠加入300 μL的洗脱液，洗脱1 h，离心收集上清。两次洗脱液合为一管，对PBS缓冲液透析换液。进行SDS-PAGE鉴定蛋白质。
1.6 多克隆抗体的制备及效价检测用纯化后的400 μg LC3B重组蛋白与弗氏完全佐剂1∶1融合乳化，背部多点注射免疫日本大耳白兔，分别在第一次注射后的28、42、47、54 d进行4次加强免疫，每次150 μg。第四次加强免疫10 d后采集兔子血液，置于4 ℃冰箱，次日离心收集血清。10 mL抗血清与Sepharose4B亲和纯化柱过夜孵育，pH为5.0 HCl洗去杂抗体，pH为2.5，0.15 mol·L-1甘氨酸缓冲液洗脱，10×PBS缓冲液中和，制备亲和纯化抗体。将牦牛重组LC3B蛋白包被液稀释至1 μg·mL-1作为抗原加至96孔板(100 μL·孔-1)于4 ℃冰箱中过夜，次日弃去孔内液体，洗涤3次，每孔加200 μL封闭液，室温静置1 h。兔抗LC3B蛋白抗体按1∶10 000稀释后作为一抗，未注射任何免疫原的兔子血清作为阴性对照，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，一抗、二抗皆于37 ℃孵育1 h，孵育抗体前后PBST洗涤5次。每孔加50 μL显色液，室温显色20 min后用50 μL终止液终止显色。以OD450 nm阳性血清/OD450 nm阴性血清＞2.1的最大稀释倍数为抗体效价。
1.7 Western blot鉴定牦牛LC3B多克隆抗体1.7.1 蛋白变性 经液氮快速冷冻后的组织样品充分研磨，每100 mg组织样加入1 mL高效RIPA裂解液和10 μL PSMF，冰浴反应3 h，4 ℃，1 500 r·min-1离心15 min，取上清液，与6×蛋白上样缓冲液3∶1混合，100 ℃变性10 min后冷却至室温，-20 ℃保存。
1.7.2 Western blot检测牦牛LC3B蛋白抗体特异性 制备12% 的分离胶与5% 的浓缩胶，进行SDS-PAGE，电泳后转膜至PVDF上，用5%脱脂奶粉封闭3 h。弃去封闭液，分别以所得的兔血清和牦牛LC3B抗体为一抗(1∶1 000), 4 ℃孵育12 h，PBST清洗5次，10 min·次-1，HRP标记的羊抗兔抗体为二抗(1∶7 000), 室温摇床孵育1 h，PBST清洗4次，10 min·次-1。之后在PVDF膜上滴加电化学发光液，使用化学发光仪进行检测。
1.8 LC3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达定位经4%多聚甲醛固定的睾丸、卵巢、输卵管、子宫样品进行脱水后，制作石蜡切片，用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，滴加3% H2O2溶液37 ℃作用10 min，PBS洗涤3次，3 min·次-1，后滴加封闭液，室温封闭15 min，滴加牦牛LC3B抗体(1∶500)，阴性对照滴加PBS，4 ℃孵育12 h。PBS洗涤3次(3 min·次-1)，滴加二抗，37 ℃作用15 min后PBS洗涤3次，3 min·次-1，滴加三抗，37 ℃作用15 min，PBS洗涤3次。滴加DAB工作液显色，蒸馏水终止，苏木精复染，脱水，透明，树脂封片，观察拍照。
1.9 免疫荧光鉴定0.25%胰酶消化原代输卵管上皮细胞，用PBS清洗输卵管上皮细胞3次，制成细胞悬液，将4×105个·mL-1接种至有盖玻片的六孔板中，温箱培养24 h，进行细胞贴壁，取出爬片，用PBS洗涤3次，3 min·次-1。2%多聚甲醛进行固定，洗涤后加入含有0.1%Trition-X 100室温透化20 min后，PBS洗涤3次，5 min·次-1，用牛血清白蛋白(BSA)室温封闭2 h，弃去封闭液，加入牦牛LC3B抗体(1∶500)，4 ℃过夜孵育，PBS洗涤3次，5 min·次-1，加入FITC标记的二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，PBS洗涤后，用DAPI染色液染核4 min，用抗荧光淬灭剂封片后，在荧光显微镜下观察并拍照。
2 结果 2.1 牦牛LC3B基因克隆PCR扩增结果显示，目的条带单一且特异性良好，大小为519 bp，与预期产物大小一致(图 1A)。将纯化后的牦牛LC3B片段连接至PMD-19T载体后挑取单克隆进行菌液PCR验证(图 1B)，目的条带大小与普通PCR结果一致。后使用菌液进行测序，结果进一步提示所得序列为牦牛LC3B序列。测序结果已提交至GenBank，登录号为：OP572227。
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A. LC3B基因PCR扩增电泳：M. DNA相对分子质量标准，1~4. 牦牛LC3B基因扩增产物。B. 单克隆菌液PCR扩增电泳：1~6. 菌液PCR扩增产物 A. LC3B gene PCR amplification electrophoresis: M. DNA marker; 1-4. Yak LC3B gene amplification products. B. Single colony PCR amplification electrophoresis: 1-6. Bacteria liquid PCR amplification products 图 1 牦牛LC3B基因PCR扩增电泳与菌液PCR扩增电泳 Fig. 1 Yak LC3B gene PCR amplification electrophoresis and bacteria liquid PCR amplification electrophoresis |
2.2.1 牦牛LC3B基因开放阅读框分析和进化树构建 结果表明牦牛LC3B的开放阅读框全长378 bp，总共编码125个氨基酸。系统进化树结果显示(图 2)，牦牛LC3B基因与普通牛(Bos taurus)、野牦牛(Bos mutus)、印度牛(Bos indicus)亲缘性最高。
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图 2 牦牛LC3B基因的系统进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree of yak LC3B gene |
2.2.2 牦牛LC3B蛋白理化性质分析和高级结构预测 牦牛LC3B蛋白分子式为C659H1057N179O189S6，原子总数为2 090，理论等电点(PI)为8.71，不稳定指数60.93，是一种不稳定蛋白。LC3B蛋白预测分子量大小为14.7 ku，共编码19种氨基酸。牦牛LC3B基因编码的氨基酸中带正电的氨基酸总数为(Arg+Lys)19个，带负电的氨基酸总数为(Asp+Glu)17个，该蛋白带正电。
牦牛LC3B基因编码的蛋白中α-螺旋共有37个氨基酸，占总数的29.6%，延伸链结构有22个氨基酸，占17.6%；无规则卷曲结构有66个氨基酸，占52.8%。牦牛LC3B蛋白的二级及三级结构结果如图 3A、3B所示。
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A.牦牛LC3B蛋白二级结构预测；B.牦牛LC3B蛋白的三级结构；C.牦牛LC3B蛋白亲疏水性分析；D.牦牛LC3B蛋白跨膜结构域分析；E.牦牛LC3B蛋白磷酸化位点分析 A.Secondary structure prediction of yak LC3B protein; B.The tertiary structure protein of yak LC3B protein; C. Hydrophobicity analysis of yak LC3B protein; D. Analysis of transmembrane domains of yak LC3B protein; E. Phosphorylation sites analysis of LC3B protein in yak 图 3 牦牛LC3B蛋白生物学信息分析 Fig. 3 Bioinformatics analysis of yak LC3B protein |
2.2.3 牦牛LC3B基因编码蛋白亲疏水性、跨膜结构域和磷酸化位点分析 牦牛LC3B蛋白为亲水性蛋白(图 3C)。疏水性最强的为第79位的苯丙氨酸(Phe)，其分值为1.556，亲水性最强的为第12位的苏氨酸(Thr)，其分值为-2.867；LC3B蛋白不含跨膜区域，是非跨膜蛋白(图 3D)。有4个丝氨酸(Ser)、3个苏氨酸(Thr)和1个酪氨酸(Tyr)的磷酸化位点大于阈值，有成为蛋白质激酶磷酸化位点的可能(图 3E)。
2.3 重组质粒的构建及重组蛋白表达对重组质粒用Bam HⅠ和PstⅠ进行双酶切验证，结果显示成功构建了pET32a-LC3B重组质粒(图 4A)。诱导蛋白表达结果如图 4B所示，上清液和包涵体中都有牦牛LC3B重组蛋白的表达，大小为34 ku，其中Trx标签蛋白大小约为20 ku。
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A. 重组质粒双酶切验证：M.DNA相对分子质量标准；1.双酶切产物；2.pET32a-LC3B重组质粒。B. 重组质粒诱导表达：M. 蛋白质量分子标准；1~4.全菌液诱导表达 A. Double enzyme digestion verification of recombinant plasmid: M.5000 DNA Marker; 1. Double digestion product; 2. pET32a-LC3B recombinant plasmid. B. Recombinant plasmid induced expression: M. Protein mass molecular standard; 1-4. Whole cell induced expression 图 4 重组质粒双酶切验证与诱导表达 Fig. 4 Verification and induced expression of recombinant plasmid by double digestion |
使用亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白，咪唑洗脱液洗脱镍柱中的蛋白，SDS-PAGE检测结果显示(图 5A)，大约在34 ku处出现较为单一的条带，表明纯化后的蛋白为牦牛LC3B重组蛋白，与预期结果一致。透析牦牛LC3B重组蛋白后经SDS-PAGE分析，获得3 mg纯化蛋白(图 5B)。
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A.上清诱导纯化蛋白SDS-PAGE：M. 蛋白质量分子标准；1. 300 mmol·L-1咪唑洗脱液一；2. 300 mmol·L-1咪唑洗脱液二；3. Beads样。B. 透析后蛋白SDS-PAGE：M. 蛋白质量分子标准；1. BSA上样；2. 透析后蛋白 A. The supernatant induced purified protein SDS-PAGE: M. Protein mass molecular standard; 1. 300 mmol·L-1 imidazole eluent one; 2. 300 mmol·L-1 imidazole eluent two; 3. Beads. B. Post-dialysis protein SDS-PAGE: M. Protein mass molecular standard; 1. BSA loading; 2. Protein after dialysis 图 5 牦牛LC3B重组蛋白纯化 Fig. 5 Purification of yak LC3B recombinant protein |
根据OD450 nm阳性血清/OD450 nm阴性血清＞2.1的最大稀释倍数为抗体效价，本试验制备的抗体效价为1∶640 000、1∶320 000(表 1，图 6A)。制备的血清(含Trx和His标签)能与牦牛LC3B蛋白发生特异性反应(图 6B)，并且能识别LC3B-Ⅰ(36 ku)和脂化的后的LC3B-Ⅱ(34 ku)蛋白，表明该蛋白多克隆抗体特异性良好，可用于后续试验。
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表 1 不同稀释度OD450 nm值 Table 1 OD450 nm values of different dilutions |
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A.不同稀释度的OD450 nm值；B.免疫后血清特异性验证：1.卵巢；2.输卵管；3.子宫 A.OD450 nm values of different dilutions; B.Verification of serum specificity after immunization: 1.Ovary; 2.Oviduct; 3.Uterus 图 6 多克隆抗体效价及特异性检测 Fig. 6 Polyclonal antibody titer and specificity detection |
2.6.1 Western blot检测LC3B在牦牛睾丸、卵巢、输卵管和子宫中的表达 牦牛LC3B纯化抗体能与牦牛蛋白发生特异性反应，并且能够识别LC3B蛋白，包括LC3B-I(16 ku)和脂化后的LC3B-II(14 ku)，与预测的牦牛LC3B蛋白大小一致(图 7)。
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1. 睾丸；2. 卵巢；3. 输卵管；4. 子宫 1. Testis; 2. Ovary; 3. Oviduct; 4. Uterus 图 7 Western blot检测LC3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达 Fig. 7 Expression of LC3B protein in yak reproductive organs detected by Western blot |
2.6.2 免疫组织化学和免疫荧光染色检测LC3B蛋白在牦牛生殖器官中的分布 LC3B蛋白在牦牛睾丸、卵巢、输卵管、子宫均有阳性表达。在睾丸中，主要表达于精子细胞(SP)、间质细胞(IC)、支持细胞(SC)；在卵巢中，主要表达于黄体细胞(CL)、颗粒层(SG)和卵泡膜(TF)；在输卵管中，主要表达于黏膜上皮(EM)；在子宫中，主要表达于子宫腺(UG)和子宫内膜(EN)(图 8)。免疫荧光显示，LC3B蛋白主要表达于牦牛输卵管上皮细胞的细胞核周和细胞质中(图 9)。
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a、b、c. 睾丸；d、e、f. 卵巢；g、h、i. 输卵管；j、k、l. 子宫。a、b、d、e、g、h、j、k为阳性表达；c、i、l为阴性对照。SP. 精子细胞; SC. 支持细胞; IC. 间质细胞; ST. 生精小管; SG. 颗粒层；TF. 卵泡膜；CL. 黄体细胞；EM. 黏膜上皮；UG. 子宫腺；EN. 子宫内膜 a, b, c. Testis; d, e, f. Ovary; j, h, i. Fallopian tube; j, k, l. Uterus. a, b, d, e, g, h, j, k are positive expression; c, i, l are negative control. SP. Sperm cells; SC. Sertoli cells; IC. Interstitial cells; ST. Seminiferous tubules; SG. Granular layer; TF. Theca follicle; CL. Luteal cell; EM. Epithelium mucosae; UG. Uterine glands; EN. Endometrium 图 8 LC3B蛋白在牦牛生殖器官中的分布 Fig. 8 Distribution of LC3B protein in yak reproductive organs |
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图 9 LC3B蛋白在牦牛输卵管上皮细胞中的分布 Fig. 9 Distribution of LC3B protein in oviduct epithelial cells of yak |
本试验通过基因克隆，获得了大小为519 bp的牦牛LC3B基因，该序列已提交至GenBank，登录号为：OP572227。对牦牛LC3B基因序列在线比对后发现，与普通牛、印度牛、野牦牛的LC3B基因序列高度一致，体现了LC3B基因的高度保守性，这与Baeken等[20]的研究结果一致。在前人的研究中提出, LC3B蛋白可发生脂化，表现为LC3B-Ⅰ和脂化后的LC3B-Ⅱ两种形式[21]。本研究通过理化性质分析后发现, 牦牛LC3B共编码125个氨基酸，牦牛LC3B蛋白是非跨膜性的不稳定蛋白，提示牦牛LC3B蛋白也可发生脂化。该蛋白有4个丝氨酸、3个苏氨酸和1个酪氨酸成为磷酸化位点的可能。Nieto-Torres等[22]认为，LC3B蛋白发生磷酸化对自噬体与细胞核周围的溶酶体结合有重要意义。
本试验成功构建了pET-32a-LC3B重组质粒，经原核诱导表达后进行动物免疫，获得了免疫原性良好的抗牦牛LC3B血清，经纯化后制得了牦牛LC3B多克隆抗体。PET-32a载体广泛应用于自噬相关蛋白表达，是较为稳定的原核表达载体[23-24]。但因pET-32a标签蛋白分子量小，不利于小分子蛋白的诱导表达，因此，添加了Trx和His标签，以优化诱导表达条件。硫氧还蛋白(Trx)增强蛋白的可溶性表达，减少蛋白的浪费。牦牛LC3B重组蛋白的成功制备和高水平的表达是成功制备牦牛LC3B多克隆抗体的关键。对该蛋白进行纯化后，制得牦牛LC3B多克隆抗体效价达到1∶320 000和1∶640 000，而余振兴等[25]制备的紫贻贝LC3B抗体效价仅为1∶256 00，表明本研究所制备的兔抗牦牛LC3B多克隆抗体具有较高的灵敏性。通过Western blot检测，本试验制备的牦牛LC3B多克隆抗体能正常识别LC3B蛋白，并且能够识别LC3B-Ⅰ和脂化后的LC3B-Ⅱ，证明本试验成功制备了特异性较好的牦牛LC3B蛋白抗体。
将本试验制备的纯化抗体应用于LC3B蛋白的表达定位检测。Western blot结果显示, LC3B在牦牛睾丸、卵巢、输卵管和子宫中均有表达，并且能够检测到LC3B-Ⅰ和脂化后的LC3B-Ⅱ蛋白。目前，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值常用来评估自噬[26]。因此，本研究结果提示所制备的兔抗牦牛LC3B多克隆抗体可用于牦牛自噬流的评估。免疫组织化学结果显示，LC3B蛋白在牦牛睾丸的精子细胞和支持细胞中表达。睾丸支持细胞在生殖细胞的存活和精子的生成中起着重要作用，与性腺的发育也有着紧密的联系[27]。Yin等[28]已证实, 自噬可抑制精母细胞凋亡，进而促进精子生成，说明牦牛LC3B蛋白也可能参与精子的生成过程。LC3B蛋白在山羊卵巢黄体类固醇生成细胞中表达[29]，Ullah等[30]检测LC3B蛋白表达，发现增强自噬可改变黄体类固醇细胞的亚细胞结构，有助于黄体功能的维持。本研究发现, LC3B蛋白在牦牛黄体细胞中表达，提示该蛋白可能参与牦牛孕酮的产生，与牦牛维持妊娠和调节发情和排卵有关。研究发现，促卵泡素(FSH)在促进卵泡发育的同时，伴有自噬的发生，在有腔卵泡中检测到LC3蛋白[31]。牦牛LC3B蛋白在颗粒细胞和卵泡膜中表达，说明LC3B蛋白参与牦牛卵泡的生长和发育。这与Zheng等[32]的报道一致。输卵管和子宫作为受精、早期胚胎的发育和妊娠的场所，在动物繁殖过程中起着重要作用。Su等[15]通过检测子宫内膜上LC3蛋白的表达，发现子宫内膜发生的自噬影响胚胎的着床。本研究发现, 在牦牛输卵管上皮黏膜和子宫内膜中检测到了LC3B蛋白的表达，表明LC3B蛋白在卵子的输送过程、胚胎着床和妊娠中发挥着作用。总之，本研究所制备的牦牛LC3B多克隆抗体能识别牦牛LC3B蛋白，抗体特异性良好，可用于以牦牛为模型的分子试验；免疫组化和免疫荧光结果显示, LC3B在牦牛生殖器官中的表达部位与其他动物一致，提示LC3B蛋白在牦牛繁殖活动中发挥着重要作用，同时也进一步加深了对自噬在牦牛生殖生理中作用的理解。
4 结论本研究成功克隆了牦牛LC3B基因(GenBank登录号：OP572227)，构建了重组质粒pET-32a-LC3B，成功制备了特异性良好的牦牛LC3B多克隆抗体，该抗体可特异性识别牦牛LC3B蛋白。牦牛LC3B蛋白在睾丸、卵巢、输卵管和子宫中均有表达，且主要表达于细胞核周和细胞质中。研究结果提示，所制备的牦牛LC3B抗体可用于以牦牛为模型的分子试验，且发现LC3B蛋白参与牦牛生殖生理过程，为进一步研究牦牛LC3B蛋白和细胞自噬提供了基础资料。
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(编辑 孟培)