伪狂犬病(pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。PRV属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，病毒粒子呈球形，直径为180~300 nm，基因组为线性双链DNA，全长大约143 kb，其中，编码的gB、gC、gD、gE及TK等蛋白共同决定病毒毒力。

自2011年以后，PRV发生了变异，导致免疫过Bartha-K61疫苗的猪场仍暴发了伪狂犬病，给养猪业造成了严重的经济损失。近几年，有研究对我国部分地区PRV感染情况进行流行病学调查，对主要糖蛋白(gB、gC、gD和gE)进行遗传进化分析，结果显示大多数阳性样本为国内变异株^[1]。同时还有研究发现，部分变异株是由国内野毒株与国外流行株(疫苗株)发生重组而产生的^[2-3]。因此，需持续监测PRV变异株分子流行病学情况，并针对性地制定有效的防控措施。

本试验从广东省佛山市某个已免疫过Bartha-K61疫苗的发病猪场的血液样本中分离到1株PRV变异株，命名为GDFS2020，并对家兔的致病性进行研究，旨在为PRV病原学研究及分子流行病学研究提供参考数据。

1 材料与方法 1.1 病料、细胞及实验动物

1份疑似PRV感染的病猪血液样本来自广东省佛山市某发病猪场；PRV FS2015株和PK-15细胞均为本实验室保存；6只新西兰白兔购自广东省医学实验动物中心。

1.2 主要试剂

4%多聚甲醛固定液购自Biosharp公司；Alexa Fluor-488羊抗兔IgG购自碧云天生物技术有限公司；兔抗PRV多克隆抗体由本实验室制备并保存。

1.3 病毒的间接免疫荧光(IFA)

取经空斑纯化后的病毒悬液(1×10³ TCID₅₀·mL^-1) 接种PK-15细胞，进行IFA试验，具体步骤详见参考文献[4]，本试验中一抗为PRV多克隆抗体，稀释倍数为1 ∶100；二抗为Alexa Fluor-488羊抗兔IgG，稀释倍数为1 ∶500。

1.4 病毒的电镜观察

将病毒接种PK-15细胞，当出现CPE现象后，弃掉上清液，加入电镜固定液，用细胞刮轻轻刮下细胞收集到离心管内，3 000 r·min^-1离心5 min，弃上清后，再加入新的电镜固定液，于4 ℃保存；或反复冻融PK-15细胞2次，5 000 r·min^-1离心15 min，取上清液，运用病毒浓缩试剂盒(碧云天，C2901S)浓缩病毒，于4 ℃保存送至赛维尔生物科技有限公司进行电镜观察。

1.5 病毒生长曲线的测定

取第6代病毒悬液，接种PK-15细胞后12、24、36、48、60和72 h分别收集细胞上清液，根据Reed-Muench法计算每个时间点上清液的病毒滴度(TCID₅₀)，测定病毒的生长曲线。

1.6 分离株主要毒力基因序列分析

利用DNASTAR中的Megalign等软件将获得的序列与GenBank已登录的PRV gB、gC、gD、gE和TK基因编码氨基酸序列进行同源性及分子特征分析；并利用MEGA X软件，采用Neighbor-Joining(NJ)法构建gB、gC、gD、gE和TK基因遗传进化树，分析PRV分离株的遗传进化关系。

1.7 家兔感染试验

取1×10² TCID₅₀·mL^-1的病毒悬液，经皮下注射接种3只新西兰白兔，另外3只皮下接种DMEM培养基作为阴性对照组。每天观察家兔临床症状，组织器官病变情况，并将家兔病变组织用4%多聚甲醛固定后，由赛维尔生物科技有限公司制作病理切片并观察组织病变情况。

2 结果 2.1 病毒的分离鉴定及生长曲线的测定

将GDFS2020株运用IFA和电镜试验进行鉴定，结果显示，接种GDFS2020株的PK-15细胞可见明显的绿色荧光，而阴性对照无荧光，并以FS2015株作为阳性对照(图 1A)。电镜结果显示，靠近核膜的细胞核内及胞质中有多个直径约80 nm的不成熟病毒粒子(图 1B)。负染后电镜下观察，可见成熟病毒粒子直径约170 nm，呈球形，有囊膜，表面有放射状排列的纤突(图 1C)。生长曲线结果显示，在感染48 h后，TCID₅₀达到最高(10^7.25 TCID₅₀·mL^-1)(图 1D)。

2.2 PRV GDFS2020株gB、gC、gD、gE及TK全基因分子特征分析

对GDFS2020株的gE、TK、gB、gC及gD基因氨基酸序列分别与欧美株、国内经典株及国内变异株进行同源性分析。结果显示，该毒株主要毒力基因与国内变异株同源性最高。并且gE氨基酸序列在aa48和aa496各有一个天冬氨酸的插入；gB氨基酸序列在aa75―77连续缺失SPG，aa94插入了G；gC氨基酸序列在aa63―69有连续7个氨基酸插入(AAASTPA)。这些分子特征与国内变异株分子变异特征相似，但仍与国内变异株存在个别氨基酸位点的差异。比如该毒株gE氨基酸序列V¹²³A；TK氨基酸序列的V¹⁵¹A和V²⁷⁶D；gB氨基酸序列F⁴⁶⁴S、V⁷⁵⁷E；gC氨基酸序列H¹⁰³R、A³³⁶V；gD氨基酸序列R²⁷⁶G等。进化树结果也显示，这5个毒力基因编码氨基酸序列均与国内变异株亲缘关系最近，位于同一分支(图 2)。

2.3 PRV GDFS2020株对家兔致病性分析

感染GDFS2020株的家兔出现精神萎靡，食欲不振，啃咬接种处等临床症状(图 3A)，并在感染3~4 d后全部死亡。剖检接种组家兔各组织器官，结果显示，肝边缘有梗死，心、脾、肾和脑组织有充血出血等现象(图 3B Ⅰ~Ⅴ)，对照组家兔组织器官未见明显病变(图 3B ⅰ~ⅴ)。组织病理切片结果显示，肝细胞肿胀变性，淋巴细胞增多；肾小管上皮细胞肿胀崩解脱落，间质局灶性出血；脑部的神经元变性萎缩，核略微皱缩，空隙增多变大，染色变深轻微水肿；心肌纤维肿胀透明变性，心肌纤维断裂；脾白髓红髓间隙红细胞增多，淋巴细胞减少(图 3C Ⅰ~Ⅴ)；对照组组织切片未见明显病变(图 3C ⅰ~ⅴ)。以上结果表明，GDFS2020株对家兔具有较强致病性，并能致其死亡。

3 讨论

目前，研究表明PRV变异株主要毒力基因存在部分氨基酸位点突变、缺失或插入，这可能是导致PRV毒力及抗原性发生改变的原因，从而导致Bartha-K61疫苗对变异株的保护率降低^[5-6]。本研究分离的GDFS2020株gE、gB及gC编码氨基酸序列的分子特征与国内变异株相似^[7]，表明该毒株为国内变异株。但该毒株gE、gB、gC和gD基因编码氨基酸序列上有多个位点发生了突变，然而这些氨基酸位点的突变是否影响GDFS2020株的毒力及抗原性等问题有待进一步研究。

家兔作为PRV易感动物常被用于评价PRV的致病性和毒力。因此，本研究运用家兔评价GDFS2020株的致病性。结果显示，该毒株感染家兔1 d后出现明显的临床症状；感染3~4 d后接种组家兔全部死亡，剖检后发现肝边缘有梗死，肾、心、脾和脑组织有充血出血等现象，这与前期报道的强毒株对家兔的致病性相一致^[8]，表明GDFS2020株对家兔具有较强致病性。本研究数据为丰富广东省PRV分子流行病学特征及新流行毒株的疫苗研发提供参考数据。

4 结论

本试验成功分离了1株PRV变异株(GDFS2020)，对家兔具有较强致病性。