2. 湖南农业大学动物医学院，长沙 410128;
3. 湖南农业大学园艺学院，长沙 410128
2. College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;
3. College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
大量研究表明，氧化应激与慢性疾病和衰老的发展过程密切相关；在养殖动物中，氧化应激可能与动物福利、日常生产与疾病的发生有关。不同的动物试验表明，富含氧化脂肪酸的日粮摄入会导致血浆和组织维生素E浓度的降低以及脂质过氧化产物的增加[1-2]。氧化应激还与炎症的发生直接相关，氧自由基的积累会激活炎症的关键调节因子NF-κB，影响炎症相关基因的转录。持续性的氧化应激会推进慢性炎症的进程，导致机体细胞和组织广泛损伤，与此有关的疾病被称为“自由基疾病”[3]。自由基疾病同样对养殖动物造成了巨大的影响，如猪的肺炎、肠炎和败血症，反刍动物的乳腺炎和肺炎，以及马的关节疾病等[4]。此外，炎症对养殖动物最直观的影响表现为生产性能降低，严重影响了动物福利和经济效益[5-6]。抗氧化剂的添加被认为是改善动物健康和生产性能的一种潜在的重要且廉价的替代治疗方法[7]。植物来源的各种次生代谢产物正日益受到关注，许多植物次生代谢产物已被证明对人类和啮齿动物模型的健康产生广泛的有益影响[8]，因此开发具有抗氧化功能的植物提取物添加剂很有必要。
蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.，T. mongolicum)，又名婆婆丁、黄花地丁等，是菊科蒲公英属的多年生植物，种类和资源丰富，广泛分布于中国东北、华北等大部分地理区域以及韩国、欧洲和北美地区[9]。蒲公英是一种高营养附加价值的功能植物，含有维生素B、维生素C、钾、钙、镁、磷、铁等多种维生素和矿物质，可食率达84%[9]。随着保健品行业的发展，蒲公英的花、叶和根已经成为制作茶、糖、饮料和其他功能性食品的重要来源。除此之外，蒲公英也是一种常用中药，始载于《唐本草》，具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋等功效，常用于感染引起的炎症以及胃、十二指肠溃疡的修复[10-12]。现代研究的大量证据也证实了蒲公英在体内外的许多生物学特性和分子机制，如抗菌、抗炎、抗氧化和胃保护作用[13-17]。蒲公英中富含次生代谢产物，如黄酮类、萜类和酚酸类化合物被认为是药理活性的物质基础[18-20]。同时，蒲公英作为可饲用天然植物被农业农村部收录于《饲料原料目录》中，可用作饲料原料和开发植物提取物饲料添加剂。已有大量研究表明，在日粮中添加蒲公英(提取物)可以改善养殖动物氧化应激并提高生产性能[21]，然而，蒲公英发挥抗氧化功能的物质基础和作用机制仍不完全明确。
天然植物中含有大量的活性化学成分，可以调节各种生物靶点，这些靶点可能参与不同的生物过程。然而，在大多数情况下不清楚是哪些成分在起作用。网络药理学是一种新兴的方法，用于改善和加速药物发现过程[22]。这种方法可以针对特定的疾病，结合生物学和化学，通过系统网络，推动疾病治疗靶标的发现和确定[23]。近年来，网络药理学已经逐渐被应用于饲料添加剂的开发指导中[24-25]。本研究拟通过网络药理学方法分析蒲公英发挥抗氧化功能的物质基础与潜在作用机制，为蒲公英提取物饲料添加剂的开发提供理论基础与方向。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂超纯水由实验室纯水系统PURELAB Pharma Compliance制备，美国ELGA LabWater；分析级乙醇和乙酸乙酯，国药集团化学试剂有限公司；ABTS快速法和FRAP法总抗氧化能力检测试剂盒，上海碧云天生物技术；Infinite ® E Plex全波长多功能微孔板检测仪，瑞士Tecan Trading AG；R-300旋转蒸发仪，瑞士BUCHI Labortechnik AG。
1.2 蒲公英活性成分筛选通过HERB本草组鉴数据库(http://herb.ac.cn/)收集蒲公英中的化学成分。使用中医药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)[26]以及SwissADME(http://www.swissadme.ch/)[27]对化合物进行筛选。由于氧化应激对肠道的重要影响，故不设置口服利用度条件，TCMSP设置类药性(Druglikeness，DL)≥0.18，SwissADME设置类药性满足任意3种评价模型(Lipinski、Ghose、Veber、Egan和Muegge)合格(Yes)且生物利用度评分(Bioavailability Score)≥0.55[28]。
1.3 亲脂性与水溶性计算使用SwissADME(http://www.swissadme.ch/index.php)[27]对筛选得到的化合物进行亲脂性(lipophilicity)和水溶性(water solubility)模拟计算。以水油分配系数(log Po/w)和溶解度(log S)为标准对化合物进行区分，判断标准如下：log Po/w＜3为亲水性，＞3为亲脂性[29]；log S：不可溶＜-10＜难溶＜-6＜中等可溶＜-4＜可溶＜-2＜极易溶＜0＜过高溶解性[30]。
1.4 靶点预测与网络可视化通过SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)[31]对符合条件的化合物进行靶点预测。使用GeneCards ®: The Human Gene Database数据库(https://www.genecards.org/)[32]获得抗氧化(anti-oxidant)相关的靶点。将化合物预测靶点和抗氧化相关靶点作交集，然后通过Cytoscape 3.9.1绘制化合物-靶点-功能网络图。
1.5 蛋白质互相作用分析将交集靶点输入STRING数据库(version: 11.5，https://cn.string-db.org/)[33]，物种设置为智人(Homo Sapiens)，得到蛋白质-蛋白质互相作用(protein-protein interaction，PPI)网络，再导入Cytoscape 3.9.1中使用极大团中心度(maximal clique centrality，MCC)算法得到PPI网络中TOP 20的核心蛋白靶点。
1.6 基因富集分析将核心蛋白靶点导入DAVID数据库(version: 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)[34]，物种设置为Homo Sapiens，进行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析。
1.7 抗氧化活性测试1.7.1 供试品制备 蒲公英全草购自安徽亳州中药材市场，采用丁婷玉等[35]的方法分别用水、70%乙醇和乙酸乙酯对100 g蒲公英粉末(过1号筛)进行加热回流提取2次，合并滤液，减压冷冻干燥，粉碎后于-80 ℃保存备用。
1.7.2 ABTS自由基清除试验 将10 μL不同浓度的蒲公英提取物溶液(0.5~2.5 mg·mL-1，提取溶剂溶解)、20 μL过氧化氢酶工作液与170 μL ABTS工作液混合，在25 ℃下孵育6 min。在414 nm下记录吸光度的变化。ABTS自由基清除率以ABTS自由基抑制率表示，计算公式：
| $ \text {ABTS抑制率} \%=\frac{{\rm{A}}_{\text {对照 }}-\mathrm{A}_{\text {样品 }}}{\mathrm{A}_{\text {对照 }}} \times 100 $ |
其中，A对照和A样品分别指对照和样品的吸光度。
1.7.3 FRAP测定法 将5 μL不同浓度的蒲公英提取物溶液(0.5~2.5 mg·mL-1，提取溶剂溶解)与180 μL的FRAP工作液混合，在37 ℃下孵育30 min。在593 nm下测量吸光度。通过FRAP测量的抗氧化能力以每克样品中水溶性维生素E(Trolox)当量的毫克数(mg·g-1)表示。
2 结果 2.1 蒲公英活性成分筛选从HERB数据库中获取到67个化合物，通过类药性筛选，并剔除维生素及矿物质类营养物质，得到符合条件的化合物共28个(表 1)，主要包含酚酸类(绿原酸、对羟基苯甲酸、对羟基丙酸等)、黄酮类(槲皮素、芦丁)、萜类(羟基蓍含蓍素、蒲公英酸、蒲公英苦素等)和萜类天然色素(菊黄质、叶黄呋喃素)等。
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表 1 蒲公英的活性成分 Table 1 Active components of T. mongolicum |
通过SwissADME对28个化合物进行理化性质的预测分析，结果如表 2所示。log P＜3的化合物共有27个，仅PGY10(β-谷甾醇)显示出明显的亲脂性。log S＞-4的化合物共有26个，仅PGY10和PGY22的log S＜-4，但PGY22的log S为-4.01，接近判定界限，结合log P的结果认为蒲公英中的活性化合物绝大多数为水溶性。
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表 2 蒲公英活性成分的理化性质 Table 2 Physicochemical properties of the active components of T. mongolicum |
通过SwissTargetPrediction工具预测获得蒲公英活性化合物潜在靶点296个。从Genecards数据库中获得抗氧化相关靶点4 355个，以相关性评分(Relevance score)≥0.5为标准，通过筛选最终获得1 371个靶点。将预测得到的化合物靶点和抗氧化相关靶点作交集得到135个交集靶点(图 1)。通过Cytoscape 3.9.1绘制蒲公英抗氧化的化合物-靶点-功能网络图(图 2)。网络由151个节点(node)和400条(edge)边组成，其中，度值(degree)≥10的化合物节点有8个，最高的为PGY20(60)，依次为PGY13(45)、PGY23(37)、PGY9(29)、PGY8(22)、PGY16(18)、PGY19(15)和PGY10(13)。靶点中度值最大的为醛酮还原酶家族1成员B(Aldo-Keto Reductase Family 1 Member B，AKR1B1)，其次为细胞色素P450家族19亚家族A成员1(cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1，CYP19A1A)、前列腺素-内过氧化物合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)和蛋白激酶Cα(protein kinase C alpha，PRKCA)等。
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图 1 蒲公英中化合物预测靶点与抗氧化功能靶点的韦恩图 Fig. 1 Venn diagram of compound predicted targets and antioxidant functional targets in T. mongolicum |
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蓝色菱形节点代表蒲公英；绿色圆形节点代表化合物；橙色正方形节点代表抗氧化功能；紫色八边形节点代表交集靶点 Blue diamond nodes represent T. mongolicum; green round nodes represent compounds; orange square nodes represent antioxidant functions; purple octagonal nodes represent intersection targets 图 2 蒲公英抗氧化的化合物-靶点-功能网络图 Fig. 2 Compound-target-function network diagram of the antioxidant function of T. mongolicum |
将交集靶点导入STRING数据库得到PPI网络，该网络由133个节点和1 472条边组成，每个节点平均与22.135个节点相连接。使用cytoHubba程序中的MCC算法[36]计算得到PPI网络中Top20的核心蛋白靶点，如图 3和表 3所示。排名依次为JUN原癌基因，AP-1转录因子亚单位(jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit，JUN)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、SRC原癌基因，非受体酪氨酸激酶(SRC proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase，SRC)、热休克蛋白90α家族A类成员1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1)以及基质金属肽酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)等。
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图 3 蒲公英抗氧化功能的PPI网络 Fig. 3 PPI network with T. mongolicum performing antioxidant function |
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表 3 基于MCC算法PPI网络中排名前20的节点 Table 3 Top 20 nodes in the PPI network based on MCC algorithm |
使用DAVID数据库对PPI网络中的核心靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，共富集得到294个GO条目和120条KEGG通路。对GO功能富集的结果进行筛选(P＜0.05)并进行可视化，图 4展示了GO数据库下3大类的前10个条目。生物过程(biological process，BP)涉及了细胞迁移的正向调节、细胞对活性氧的反应和一氧化氮生物合成过程的正向调节等；细胞定位(cellular component，CC)显示了基因产物所处的环境主要在陷窝、纤维胶凝蛋白-1富集颗粒腔和线粒体等位置；以及可能行使一氧化氮合酶调节活性、蛋白酪氨酸激酶活性和跨膜受体酪氨酸激酶活性等分子功能(molecular function，MF)。KEGG通路分析共富集到了120条信号通路，图 5显示了P＜0.05的前20条信号通路，包含了3条环境信息处理(血管内皮生长因子信号通路、TNF信号通路和MAPK信号通路)、1条细胞过程(局灶性黏连)、4条生物体系统(雌激素信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路和催乳素信号通路)和12条人类疾病(内分泌抵抗、癌症通路和脂质与动脉粥样硬化等)。同时，使用Cytoscape 3.9.1构建了化合物-靶点-通路的可视化网络(图 6)。
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图 4 GO功能富集分析 Fig. 4 GO functional enrichment analysis |
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图 5 KEGG通路富集分析 Fig. 5 KEGG pathway enrichment analysis |
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粉色菱形节点代表蒲公英；绿色圆形节点代表化合物；黄色正方形节点代表靶点；蓝色八边形节点代表信号通路 Pink diamond nodes represent T. mongolicum; green round nodes represent compounds; yellow square nodes represent targets; blue octagonal nodes represent signaling pathways 图 6 蒲公英抗氧化的化合物-靶点-通路网络图 Fig. 6 Compound-target-pathway network diagram of the antioxidant function of T. mongolicum |
2.6.1 ABTS的清除率 如图 7所示，蒲公英3种溶剂提取物对ABTS抑制率与提取物浓度成正比，浓度越大抑制能力越强。其中，水提物的抑制效果最强，浓度为2.5 mg·mL-1时，ABTS的抑制率达到了76.49%。在0.5~2.5 mg·mL-1浓度，抑制能力由强到弱依次为水提物、70%乙醇提取物和乙酸乙酯提取物。
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图 7 蒲公英不同溶剂提取物的ABTS抑制率 Fig. 7 ABTS inhibition rates of different solvent extracts of T. mongolicum |
2.6.2 铁离子还原能力 FeSO4标准曲线为Y=0.311 3X-0.001 8，R2=0.999 9。如图 8所示，3种溶剂提取物的还原能力均随着提取物浓度的增加而增强。在测试范围内，当样品的浓度达到2.5 mg·mL-1时，还原能力的强弱：水提取物>70%乙醇提取物>乙酸乙酯提取物，与ABTS法的结果保持一致。
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图 8 蒲公英不同溶剂提取物的还原能力 Fig. 8 Reducing power of different solvent extracts of T. mongolicum |
在世界范围内的禁抗背景下，功能性饲料添加剂的开发越来越受到关注。蒲公英作为一种药食同源的功能植物，现代药理研究表明蒲公英具有良好的抗氧化活性，但物质基础与作用机制尚未明确。本研究采用网络药理学方法分析了蒲公英抗氧化功能的物质基础和多层次作用机制。
3.1 蒲公英关键活性成分筛选得到的28种化合物可能是蒲公英潜在的活性成分，其中，槲皮素、羟基蓍含蓍素、蒲公英酸、4-羟基苯乙酸甲酯、对羟基苯丙酸、Arsanin、Artecalin和β-谷甾醇可能是关键成分。槲皮素广泛分布于水果和天然植物中，具有广泛的药理活性，其强大的抗氧化活性已得到证实，包括对谷胱甘肽、酶活性、信号转导途径和活性氧(ROS)的影响[37]。羟基蓍含蓍素在研究中主要显示为抗炎和抗过敏活性[38-39]。β-谷甾醇是一种植物来源的营养素，干扰多种细胞信号通路，包括细胞凋亡、增殖、存活、血管生成，具有抗炎、保肝、抗氧化，心脏保护和抗糖尿病等药理作用[40]。4-羟基苯乙酸甲酯和对羟基苯丙酸属于小分子酚类衍生物，由于酚羟基结构的还原性，这类物质往往具有抗氧化作用和促进健康的潜力[41]。Arsanin和Artecalin是两种具有明显苦味的倍半萜内酯类物质，未有明确的活性报道，但这类物质常具有抗菌、抗炎和抗肿瘤等作用，并且轻微的苦味可以提高动物采食量和健胃作用[42-43]。
3.2 蒲公英活性成分作用靶点在135个共同靶点中，经MCC算法得到20个PPI网络中的核心靶点，包含VEGFA、SRC、HSP90AA1、MMP9和PTGS2等。研究表明MCC算法在预测PPI网络中核心蛋白的精度方面具有更好的性能，可以在筛选关键靶点中起到关键性的作用[36]。VEGFA是一种肝素结合蛋白，可以诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，对于生理和病理性的血管生成是必不可少的关键因素，Wu等[44]研究表明，HIF-1α/VEGFA/VEGFR1信号通路的激活可以驱动内源性抗氧化剂超氧化物歧化酶2(SOD2)的表达，从而改善氧化还原的平衡状态。SRC是一种非受体蛋白酪氨酸激酶，参与调控包括免疫反应、细胞黏附和细胞凋亡等各种生物活性的信号通路，SRC的激活可以促进磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)的进行，而PPP被认为是抗氧化和保护性反应的关键过程之一[45-46]。HSP90AA1是一种应激诱导的分子伴侣蛋白，会根据各种生理条件改变转录因子的稳态水平，常被认为是细胞应激的标志物之一[47-48]。MMP9常在一些炎性疾病过程中表达，如肠炎、关节炎等[49-50]，在细胞外基质的局部蛋白水解和白细胞迁移中起重要作用[51-52]。研究表明，抑制MMP9/RAGE可以逆转早期氧化应激对机体的不良影响[53]，在另一项皮肤模型研究也显示，降低MMP9的表达，可以降低皮肤的炎性水肿和提高抗氧化能力延缓皮肤衰老[54]。PTGS2是前列腺素生物合成中的关键酶，前列腺素是花生四烯酸氧化脂质，在炎症中有着特殊的意义和作用，应激可以导致细胞内氧化损伤的积累，进而诱导炎症的产生，因此氧化应激和炎症被认为是密切相关的病理生理过程[55-56]。
3.3 蒲公英抗氧化潜在机制在基因富集分析中富集到了内分泌抵抗、乙型肝炎、脂质与动脉硬化、膀胱癌、糖尿病并发症等多条疾病相关通路，说明多种疾病可能共享抗氧化的作用机制。关键的信号途径有血管内皮生长因子通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、雌激素信号通路、松弛素信号通路和催乳素信号通路。生理或病理性的血管生成是由组织对氧气和营养物质的需求引发的，导致缺氧/再氧合循环，进而促进ROS的形成，氧化应激诱导的血管生成的主要机制涉及血管内皮生长因子信号传导[57]。MAPK级联反应参与各种细胞功能，包括细胞增殖、分化和迁移，反应中的多类型激酶(MAPKKs和MAPKKKs)的多级激活增加了MAPK信号的复杂性和多样性，是多种氧化应激诱导相关炎症的上游信号[58-59]。TNF作为一种关键的细胞因子，可以诱导广泛的细胞内信号通路，包括细胞凋亡、炎症和免疫等，通常由NF-κB和MAPK信号通路传导激活。IL-17在保护宿主免受细胞外病原体侵害方面以及急性和慢性炎症反应中均起关键作用，IL-17与受体结合后可激活NF-κB、MAPK信号通路，进一步诱导抗菌肽、细胞因子和趋化因子的表达，Th17/IL-17轴效应可以引起氧化应激的增加以及炎症小体和半胱天冬酶的活化导致细胞凋亡[60-62]。雌激素或雄激素缺乏会降低骨骼对氧化应激的防御能力，氧化应激产生的ROS极大地影响了破骨细胞、成骨细胞和骨细胞的生成和存活，也与糖尿病对骨骼形成的不良反应有关，大量研究证据形成了以衰老和氧化应激为核心，雌激素变化会加剧退化性骨质疏松症的新范式[63-64]。松弛素肽家族在结构上均与胰岛素有关，并在中枢神经、心血管系统和生殖系统中起着广泛的作用[65]，研究表明，松弛素对顺铂诱导的氧化应激胁迫的睾丸功能和精子提供保护作用[66]，以及减弱暴露于缺氧-再氧合条件下的心肌细胞的氧化应激[67]。催乳素的大量释放产生的氧化应激已被确定为心和生殖毒性的驱动因素，降低催乳素的水平可以改善抗氧化状态，减轻氧化应激的影响[68-70]。
3.4 蒲公英组分抗氧化能力计算机模拟计算的亲脂性与水溶性结果显示，蒲公英中抗氧化功能的分子大多为水溶性，这与体外抗氧化测试的结果一致。蒲公英不同提取组分的抗氧化活性的差异主要取决于抗氧化活性成分对提取溶剂的亲和性和溶解能力。
据文献报道，水提组分中主要成分通常含有多糖、多酚和黄酮类等物质，其中，多糖主要通过Nrf2/ARE途径来调节下游抗氧化酶的表达，抗氧化酶进一步阻断自由基链反应，从而减少自由基的产生。此外，多糖还可通过抑制iNOS mRNA的表达和减少NO的产生，显著提高抗氧化能力并减少氧化应激损伤[71-72]。多酚类物质由于其独特的多羟基化学结构，可以干扰氧化机制的不同阶段，并在膳食健康等方面发挥了重要作用[73-74]。黄酮类物质表现出了多样的生物活性，包括抗过敏、抗病毒、抗炎和血管舒张作用[75]。然而，大多数兴趣都集中在类黄酮物质的抗氧化活性上，大量的体外研究显示了其减少和清除自由基的能力[76]。大多数被机体摄取吸收的类黄酮会被广泛降解为酚酸，其中，一些种类的酚酸仍具有清除自由基的能力。被吸收的类黄酮及其代谢物均可在体内表现出抗氧化活性，表现为血浆抗氧化能力增强，以及对红细胞膜和低密度脂蛋白中的维生素E和多不饱和脂肪酸的保留作用[77-78]。从饲料添加剂开发的角度，低成本是产品开发的前提，蒲公英抗氧化功能成分主要集中在水提物中，这一结果表明了蒲公英具有优异的低成本开发优势。
4 结论蒲公英通过槲皮素、羟基蓍含蓍素、蒲公英酸、4-羟基苯乙酸甲酯、对羟基苯丙酸、Arsanin、Artecalin和β-谷甾醇等关键活性成分，作用于VEGFA、SRC、HSP90AA1、MMP9和PTGS2等核心靶点，激活血管内皮生长因子通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路和雌激素信号通路等信号转导途径调控氧化应激平衡，发挥抗氧化功能。体外抗氧化试验结果证明了蒲公英的水溶性成分具有更强的抗氧化性能，为开发功能性蒲公英提取物饲料添加剂提供了理论依据。
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(编辑 白永平)