畜牧兽医学报  2023, Vol. 54 Issue (5): 2114-2125. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2023.05.032    PDF    
siRNA-757干扰旋毛虫Ts-ODC基因对其抗酸能力的影响
薄禄琪1, 王雪莹1, 侯嘉茗1, 张力1, 张鉴慧1, 阮入琳1, 张博涵1, 王爽1, 宋铭忻1, 张子群2     
1. 东北农业大学动物源性人兽共患病黑龙江省重点实验室, 哈尔滨 150030;
2. 哈尔滨海关技术中心, 哈尔滨 150008
摘要:旨在探究旋毛虫肌幼虫体内是否存在鸟氨酸依赖型抗酸系统, 本研究根据GenBank中Ts-ODC全序列基因组设计三条特异性siRNA分子, 采用脂质体浸染转染的方法将其分别转染至旋毛虫肌幼虫体内, 使用qPCR、Western blot和间接免疫荧光试验, 筛选最佳干扰siRNA分子及最佳干扰条件; 并在pH 1.5、2.5、4.5和6.6的条件下将肌幼虫分别培养0.5、1和2 h, 从肌幼虫Ts-ODC基因转录水平、酶活性及存活率等方面分析Ts-ODC基因干扰对旋毛虫肌幼虫抗酸能力的影响; 将Ts-ODC基因被干扰的旋毛虫肌幼虫感染小鼠, 在7和42 d时分别收集成虫和肌幼虫, 分别计算其减虫率; 将子一代肌幼虫在pH 2.5的酸性条件下培养2 h, 计算其存活率, 对Ts-ODC基因干扰的遗传性进行分析。结果显示, Ts-ODC siRNA-757为最佳干扰分子, 转染12 h、浓度为2 μmol·L-1培养3 d时为最佳干扰条件; 各组pH 2.5培养2 h时Ts-ODC基因转录水平最高, pH 1.5培养2 h时虫体的存活率明显低于其他培养条件(P < 0.01), pH 4.5培养0.5 h时虫体体内酶活性最高; 转染Ts-ODC siRNA-757的肌幼虫接种小鼠后, 7 d时成虫和42 d时肌幼虫的减虫率分别为58.95%和65.91%;其子一代肌幼虫在pH 2.5的培养液内培养2 h时其存活率为49%。综上表明, 旋毛虫肌幼虫体内具有鸟氨酸依赖型抗酸系统, 本研究首次通过siRNA技术干扰旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因, 且证实干扰Ts-ODC基因可降低肌幼虫抗酸能力, 为后期旋毛虫病的防治提供新思路。
关键词旋毛虫    鸟氨酸脱羧酶    RNA干扰    抗酸系统    
Interference of Ts-ODC Gene of Trichinella spiralis by siRNA-757 Effect on Its Acid Resistance
BO Luqi1, WANG Xueying1, HOU Jiaming1, ZHANG Li1, ZHANG Jianhui1, RUAN Rulin1, ZHANG Bohan1, WANG Shuang1, SONG Mingxin1, ZHANG Ziqun2     
1. Heilongjiang Key Laboratory for Zoonosis, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;
2. Technology Center of Harbin Customs, Harbin 150008, China
Abstract: In order to explore the existence of ornithine-dependent anti-acid system in Trichinella spiralis(T. spiralis, Ts)muscle larvae, three specific siRNAs molecules were designed according to the complete genome sequence of Ts-ODC(Trichinella spiralis ornithine decarboxylase) in GenBank. Three siRNAs were transfected into T. spiralis muscle larvae by liposome transfection. The best interference siRNA molecules and the best interference conditions were determined by qPCR, Western blot and indirect immunofluorescence assays. The muscle larvae were cultured at pH 1.5, 2.5, 4.5 and 6.6 for 0.5, 1 and 2 h, respectively. The effects of Ts-ODC gene interference on the acid resistance of muscle larvae were evaluated from three aspects of the ODC transcription level, ornithine decarboxylase activity and larvae survival rate. Mice were infected with muscle larvae of T. spiralis after Ts-ODC gene interference. Adults and muscle larvae were collected at 7 d and 42 d, respectively, and the worm reduction rates were calculated. The first-generation muscle larvae were cultured under acidic conditions at pH 2.5 for 2 h, and the survival rate was calculated to analyze the heritability of Ts-ODC gene interference. The results showed that Ts-ODC siRNA-757 was the optimal interference molecule, and the best interference conditions were transfection for 12 h and 3 d culture at a concentration of 2 μmol·L-1; the highest transcription level of Ts-ODC gene was reached at pH 2.5 for 2 h, and the survival rate was significantly lower than other culture conditions at pH 1.5 for 2 h (P < 0.01). The ornithine decarboxylase activity was the highest at pH 4.5 for 0.5 h. After the mice were orally gavaged with muscle larvae transfected with Ts-ODC siRNA-757, the worm reduction rates were 58.95% and 65.91% at 7 d and 42 d, respectively. The survival rate of the first-generation muscle larvae was 49% when cultured in a pH 2.5 medium for 2 h. The above experiments concluded that T. spiralis muscle larvae has an ornithine-dependent acid-resistant system. In this study, the Ts-ODC gene of T. spiralis muscle larvae was interfered by siRNA technology for the first time, and it was confirmed that interfering with the Ts-ODC gene could reduce the acid resistance of muscle larvae, which provided a new idea for the prevention and treatment of Trichinellosis.
Key words: Trichinella spiralis    ornithine decarboxylase    RNA interference    anti-acid system    

旋毛虫(Trichinella spiralis)是一种可感染几乎所有哺乳动物的胞内寄生性线虫,分布于世界各地[1]。旋毛虫病不仅影响到人类身体健康,而且带来严重的食品安全等经济问题[2]。人类因食用生的或未煮熟的含有旋毛虫包囊的肉而感染[3],感染旋毛虫者主要表现为腹泻、水肿及心肌炎等[4]

现研究发现O157:H7肠出血性大肠埃希菌、单增李斯特菌和沙门菌等致病菌存在多种抗酸机制,多种机制间的相互作用构成了一个复杂的抗酸调节网络[5-6],其抗酸能力主要通过细胞质蛋白维持胞内中性环境来实现[7]。大肠埃希菌等致病菌至少存在六种与代谢相关的抗酸系统(acid resistant systems,ARs)[6-9],当致病菌暴露于非致死的酸性环境下,会诱导这些抗酸系统的相关基因表达[5, 10-11]。由旋毛虫生活史可知,含有旋毛虫感染性肌幼虫的包囊被食入后,包囊在宿主体内经酸性胃液(pH 2~3)分解,释放出肌幼虫进入小肠内繁殖[3, 12],并且肌幼虫寄生的肌肉仍为酸性环境(pH 5~7),这说明旋毛虫具有较强的抗酸能力。

本实验室前期研究证实,旋毛虫存在谷氨酸依赖型抗酸系统(AR2)和谷氨酰胺依赖型抗酸系统(AR4)[13-14]。AR2依赖于谷氨酸脱羧酶(GadA和GadB)的异构体和谷氨酸-γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)反转运体(GadC)共同发挥抗酸作用[13];AR4是依赖于谷氨酰胺酶(YbaS)和氨基酸反向转运蛋白(GadC)共同发挥作用的[14]。AR2和AR4均能调节细胞内pH,维持胞内pH的稳定性,在不同酸性条件下,干扰谷氨酸及谷氨酰胺基因的表达均会造成旋毛虫存活力和繁殖力的下降[13-14]。并且在体外模拟酸性环境下发现,将促进剂精氨酸和抑制剂雷帕霉素分别与旋毛虫共培养,会有旋毛虫鸟氨酸脱羧酶(Trichinella spiralis ornithine decarboxylase,Ts-ODC)基因转录水平升高和降低的现象[8],提示旋毛虫可能存在鸟氨酸脱羧酶依赖性抗酸系统(AR6)。为进一步探究旋毛虫AR6抗酸机制,本试验从分子与蛋白水平上,运用RNA干扰技术干扰旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因,通过qPCR、Western blot及酶活性测定等方法检测Ts-ODC对旋毛虫肌幼虫抗酸能力的影响,这为揭示旋毛虫致病机理、研究新型驱虫药物治疗靶点及新型疫苗提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物

6~8周龄BALB/c小鼠,雌性,购自哈尔滨医科大学;本实验室所用旋毛虫为黑龙江猪旋毛虫株(T. spiralis,ISS533),由东北农业大学动物医学学院兽医寄生虫学教研室传代保存。

1.2 主要试剂

脂质体转染试剂(Lipofectin 2000)购自Invitrogen公司;Total RNA Extractor购自大连宝生物工程有限公司;ChamQ SYBR Qpcr Master Mix、逆转录试剂盒(HiScript Q Select RT SuperMix for Qpcr(+gDNA wiper))、TRIzol等购自诺唯赞生物科技股份有限公司;鸟氨酸脱羧酶(ODC)酶联免疫分析试剂盒购自北京诚林生物科技有限公司;RPMI-1640培养基(1×DMEM/HIGH GLUCOSE)购自美国Hyclone公司;其余试剂均为国产分析纯;所用Ts-ODC多抗血清为本实验室前期制备并保存。

1.3 Ts-ODC siRNA分子的设计与合成

根据NCBI已发表的Ts-ODC mRNA序列(Accession No.:XM-003373542.1),用RNAi设计平台(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/setOption.dodesignOption=shrna&p)设计出3条靶向沉默Ts-ODC的干扰序列及一个阴性对照序列(表 1),均由上海吉玛制药技术有限公司合成。

表 1 Ts-ODC的siRNA序列 Table 1 siRNA sequences for Ts-ODC
1.4 Ts-ODC siRNA分子的筛选

取感染旋毛虫42 d的小鼠剖杀,采用人工胃液消化法消化小鼠,应用改良的贝尔曼式法收集肌幼虫,使用含青霉素和链霉素双抗的生理盐水将肌幼虫清洗至无菌状态,分别设置siRNA干扰组、control siRNA阴性对照组、脂质体2000对照组和仅含有RPMI 1640培养基的空白对照组,每组设置3个平行孔。利用脂质体转染试剂Lipofectin 2000,采用浸泡法将siRNA分子转染至肌幼虫体内[13]。将siRNA分子与脂质体2000分别用RPMI 1640培养基稀释,使siRNA终浓度为2 μmol·L-1,室温孵育,然后分别将3 000条肌幼虫·孔-1加入含培养基的48孔培养板中,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱内转染12 h,而后更换新鲜培养基,连续培养3 d,采用上述浸泡法将Ts-ODC siRNA转染至肌幼虫体内;收集转染后的各组虫体,采用TRIzol法提取总RNA,反转录为cDNA,以GAPDH为内参基因,通过qPCR检测各组肌幼虫Ts-ODC mRNA基因转录水平,qPCR引物序列参照文献[8];提取各组虫体全蛋白,通过Western blot技术检测各组虫体Ts-ODC蛋白表达水平,其中以Ts-ODC多抗血清(1:2 000)为一抗,兔抗β-Actin(1:6 000)作为内参一抗,HRP标记的山羊抗兔IgG(1:10 000)作为二抗,通过上述方法筛选干扰效果最佳的siRNA分子。

1.5 干扰条件的优化与效果鉴定

根据“1.4”方法中筛选出的最佳干扰分子siRNA-757,将其终浓度分别设置为1、2和3 μmol·L-1,培养时间分别设置为0、1、3、5、7 d,来筛选出其最佳转染浓度及培养时间。使用上述筛选结果,分别设置siRNA-757处理组、control siRNA阴性对照组、脂质体2000对照组及空白对照组,培养方法同“1.4”方法所述,试验后收集各组虫体。通过qPCR和Western blot试验确定siRNA-757分子对肌幼虫Ts-ODC基因转录及蛋白表达的影响。将上述各组旋毛虫肌幼虫各取200条置于1.5 mL离心管内使用4%多聚甲醛固定,以Ts-ODC多抗血清(1:500)作为一抗,FITC标记的山羊抗兔IgG(1:2 000)作为二抗,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测siRNA-757分子对Ts-ODC蛋白表达水平的影响。

1.6 干扰旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因对其在酸性环境下抗酸能力的影响

1.6.1 旋毛虫肌幼虫的收集   将虫体分为siRNA-757干扰组、control siRNA对照组、脂质体2000对照组和空白对照组,按“1.4”方法所述将Ts-ODC siRNA-757分子转染至肌幼虫体内后,分别将虫体加入1 mL pH为1.5、2.5、4.5和6.6的培养基内,于37 ℃、5% CO2培养箱内分别培养0.5、1和2 h后,收集各组虫体,进行后续试验。

1.6.2 干扰旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因对其在酸性环境下基因转录水平的影响   收集“1.6.1”方法中各组肌幼虫,按“1.4”方法所述qPCR技术分析不同酸环境对旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因转录水平的影响。

1.6.3 干扰旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因对其在酸性环境下Ts-ODC酶活性的影响   收集“1.6.1”方法中各组肌幼虫,加入1 mL无氨水进行冰浴研磨,4 ℃,8 000 g离心10 min,吸取上清液作为待测样品,按照北京诚林生物科技有限公司鸟氨酸脱羧酶(ODC)酶联免疫分析试剂盒说明书进行操作,检测各组虫体Ts-ODC酶活性。

1.6.4 干扰旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因对其在酸性环境下存活率的影响   收集“1.6.1”方法中各组虫体(为F0代),在显微镜下观察各组虫体存活状态,计算存活率,分析Ts-ODC基因被干扰后酸性环境对肌幼虫存活能力的影响。虫体存活状态判定标准:虫体不呈卷曲状态,运动性较差,高倍镜下可见虫体内部结构断裂或无法辨认,在酒精灯火焰上热刺激不运动即为死亡虫体;相反则为活虫;存活率=(总虫数-死亡数)/总虫数×100%。

1.7 体内试验分组及处理

将18只2月龄左右的健康BALB/c小鼠随机分为3组,分别设置siRNA-757干扰攻虫组、control siRNA干扰攻虫组和空白未干扰攻虫组小鼠,按300条·只-1剂量感染各组小鼠,在感染7和42 d时分别随机处死各组3只小鼠,收集小肠和肌肉进行后续试验。

按照动物饲养标准饲养实验动物,并且其处死符合动物伦理学标准。

1.8 干扰Ts-ODC基因后旋毛虫成虫和肌幼虫减虫率

各组小鼠感染7 d后剖杀并取出小肠,纵向剖开并清洗干净内容物,剪成3~4 cm的片段,放入含生理盐水的平皿内,37 ℃恒温箱中培养4 h,收集液体内的成虫,统计成虫数,计算成虫减虫率,42 d时采用改良贝尔曼式法收集各组F1代肌幼虫,计算肌幼虫减虫率,虫体减虫率=(空白对照组虫体数-siRNA组虫体数)/空白对照组虫体数×100%。

1.9 Ts-ODC基因干扰的遗传性分析

使用改良贝尔曼式法收集“1.7”方法中各组F1代肌幼虫,置于37 ℃、5% CO2的培养箱内稳定培养12 h后,使用1 mL pH为2.5的培养基培养2 h,收集各组虫体,计算虫体存活率,检测F1代肌幼虫Ts-ODC基因干扰的遗传性。

1.10 统计学分析

采用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量,Primer 5.0和Oligo软件用于引物设计及评估,所有数据统计学分析应用SPSS 23.0和Graphpad Prism 7.0软件进行处理,两组样本之间比较使用独立样本t检验;试验数据均值比较采用单因素方差分析;*.P < 0.05表示差异显著;**.P < 0.01表示差异极显著。

2 结果 2.1 Ts-ODC siRNA分子的筛选

将终浓度均为2 μmol·L-1 siRNA-136、siRNA-757、siRNA-1106及control siRNA分子分别通过浸泡转染的方式作用于肌幼虫,利用qPCR检测siRNA的干扰效果,结果显示,siRNA-136、siRNA-757和siRNA-1106组相对于空白对照组肌幼虫基因转录水平分别降低36.6%、48%和40%,其中siRNA-757组与空白对照组相比差异极显著(P < 0.01),control siRNA组与脂质体2000组的基因表达与空白对照组相比均无明显差异(P>0.05)(图 1A);Western blot结果显示,与空白对照组虫体相比,siRNA-136、siRNA-757和siRNA-1106组的蛋白表达量分别降低0%、64.3%和32%,control siRNA对照组和脂质体2000的蛋白表达与空白对照组虫体相比无差异(P>0.05)(图 1B),说明control siRNA与脂质体2000对肌幼虫Ts-ODC基因转录及蛋白表达无影响,siRNA-757分子对Ts-ODC基因干扰效果最明显,后续试验均选择siRNA-757分子。

A. 实时荧光定量PCR检测不同siRNA处理后旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因转录水平的变化;B. Western blot检测siRNA处理后旋毛虫肌幼虫Ts-ODC蛋白表达水平变化。*.P < 0.05,**.P < 0.01 A. Detection of Ts-ODC gene transcription in Trichinella spiralis muscle larve treated with different siRNAs by RT-qPCR; B. Expression of Ts-ODC protein in Trichinella spiralis muscle larvae trated with siRNA detected by Western blot.*.P < 0.05, **.P < 0.01 图 1 siRNA分子的筛选 Fig. 1 Screening siRNA molecules
2.2 干扰条件的优化及鉴定

将筛选出的siRNA-757分子分别采用不同浓度及不同培养时间通过浸泡法导入肌幼虫体内,通过qPCR及Western blot方法检测Ts-ODC基因转录及蛋白表达水平(图略),结果显示,siRNA-757终浓度为2 μmol·L-1转染12 h后37 ℃、5% CO2的培养箱内培养3 d为最佳干扰条件。采用筛选出的最佳干扰条件对肌幼虫Ts-ODC基因进行干扰后收集虫体进行试验,在最佳干扰条件下,相对于空白对照组,qPCR结果显示,siRNA-757组肌幼虫Ts-ODC基因转录水平降低88%,差异极显著(P < 0.01)(图 2A);Western blot结果显示,siRNA-757组肌幼虫Ts-ODC蛋白表达水平降低75.2%,差异极显著(P < 0.01)(图 2B);间接免疫荧光试验结果显示,未干扰组虫体在体表及生殖原基处均有荧光信号,即有大量Ts-ODC蛋白表达,siRNA-757组几乎无绿色荧光,干扰组和未干扰组对比差异明显(图 2C);在基因转录水平及蛋白表达水平均表明优化的试验条件可用,且效果显著。

A. 基因水平的检测;B. 蛋白水平的检测;C. IFA检测。*.P < 0.05,**.P < 0.01 A. Detection at the gene level; B. Detection at the protein level; C. Indirect immunofluorescence detection.*.P < 0.05, **.P < 0.01 图 2 siRNA-757转染肌幼虫后Ts-ODC沉默效果的检测 Fig. 2 Sliencing of muscle larva Ts-ODC by siRNA-757 transfection
2.3 酸性环境下干扰肌幼虫Ts-ODC基因对其基因转录水平的影响

将各组肌幼虫分别在pH 1.5、2.5、4.5和6.6的培养基内培养0.5、1和2 h后,经qPCR检测各组肌幼虫Ts-ODC基因转录水平,结果显示,siRNA-757组与空白对照组基因转录水平趋势相同;同一pH条件下,随培养时间的延长,Ts-ODC基因转录水平逐渐升高,siRNA-757组基因转录水平均显著低于空白对照组(P < 0.05);相同培养时间内,pH 2.5的酸性条件下,Ts-ODC基因的转录水平最高,差异极显著(P < 0.001),pH 2.5~6.6范围内Ts-ODC基因转录水平呈下降趋势,但转录水平仍然较高,control siRNA组、脂质体2000对照组和空白对照组虫体之间无明显差异(P>0.05)(图 3)。

*.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001 图 3 酸性条件对siRNA-757处理后肌幼虫Ts-ODC相对表达量的影响 Fig. 3 The relative expression of Ts-ODC mRNA in muscle larvae after siRNA-757 treatment
2.4 酸性环境下干扰肌幼虫Ts-ODC基因对其酶活性的影响

将各组肌幼虫分别在pH 1.5、2.5、4.5和6.6的培养基内培养0.5、1和2 h后,吸取各组虫体研磨上清液作为待测样品,用酶标仪在450 nm波长下测定各组吸光度(OD值),通过吸光度计算各组Ts-ODC酶活性浓度,结果显示,空白对照组肌幼虫酶活性趋势与siRNA-757组相同,培养液酸性相同时,siRNA-757组酶活性低于空白对照组虫体,siRNA-757的干扰降低了Ts-ODC的酶活性;同一pH时,随时间的延长,酶活性逐渐降低;pH4.5时酶活性最高,pH1.5~4.5时酶活性呈逐渐上升趋势;control siRNA组、脂质体2000对照组和空白对照组虫体之间无明显差异(P>0.05);培养液pH为1.5时酶活性相对低,可能是过于酸的环境影响了肌幼虫体内的Ts-ODC脱羧活性,使其应激能力降低;由此可知,Ts-ODC基因干扰会影响Ts-ODC酶活性,酸性条件下该酶活性升高,弱酸环境时酶活性较高(图 4)。

*.P < 0.05, **.P < 0.01 图 4 酸性条件下siRNA-757处理后肌幼虫Ts-ODC酶活性 Fig. 4 Ts-ODC activity of muscle larvae after siRNA-757 treatment under acidic conditions
2.5 酸性环境下干扰Ts-ODC基因对肌幼虫存活率的影响

将各组肌幼虫分别在pH 1.5、2.5、4.5和6.6的培养基内培养0.5、1和2 h后,收集F0代各组旋毛虫肌幼虫计算存活率,结果显示,pH 1.5、2.5和4.5时,①siRNA-757组旋毛虫肌幼虫存活率在0.5 h时为34%、42%、64%,1 h时为33%、36%、59%,2 h时为27%、33%、46%;②空白对照组旋毛虫肌幼虫存活率在0.5 h时为55%、65%、82%,1 h时为49%、59%、73%,2 h时为46%、53%、66%。control siRNA组与脂质体2000组虫体与空白对照组相比均无明显差异(P>0.05)。相同培养时间内,培养液酸性越大肌幼虫存活率越低,同一酸性环境内,培养时间越长,肌幼虫存活率越低;pH 6.6的培养液肌幼虫存活率高于其他各pH的培养液(图 5),上述结果表明,Ts-ODC基因干扰会降低旋毛虫肌幼虫在酸性环境中的生存能力。

*.P < 0.05, **.P < 0.01 图 5 肌幼虫在不同pH、时间内存活率 Fig. 5 Survival rate of muscle larvae in different pH and time
2.6 减虫率分析

经生物学统计,相比于空白未干扰攻虫组小鼠,siRNA-757干扰攻虫组小鼠肠道中成虫及子一代肌幼虫数量明显降低,感染肌幼虫7 d后,其成虫减虫率为58.95%,感染肌幼虫42 d后,其肌幼虫减虫率为65.91%,说明Ts-ODC基因被干扰后肌幼虫抗酸能力降低,繁殖力降低,空白未干扰攻虫组小鼠与control siRNA干扰攻虫组小鼠无明显差异(表 2)。

表 2 siRNA-757处理肌幼虫在小鼠中获得的成虫减虫率及肌幼虫减虫率 Table 2 Reduction rates of worm adult and muscle larvae induced by siRNA-757 treatment of muscle larvae in mice
2.7 Ts-ODC基因干扰遗传性分析

设置siRNA-757干扰攻虫组、control siRNA干扰攻虫组和空白未干扰攻虫组小鼠,42 d后收集F1代肌幼虫,在pH 2.5的培养基内培养2 h后,检测siRNA-757干扰攻虫组F1代肌幼虫存活率为59.67%,与siRNA-757组F0代(33%)相比差异明显,与空白虫体组F0(53%)代及F1代(58.67%)相比均无明显差异,说明siRNA的干扰效果无法有效遗传给下一代(表 3)。

表 3 酸处理后F1代肌幼虫存活率 Table 3 Survival rate of F1 muscle larvae after acid treatment
3 讨论

现研究发现,大肠埃希菌等致病菌的鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶和谷氨酸脱羧酶等脱羧酶共同构成一个非常强大的酸应激响应系统,使细菌在低至pH2.0的酸性环境下仍可存活[5, 15-16],因此食源性致病菌可抵抗胃液的酸性环境引起宿主疾病的发生。旋毛虫作为一种食源性寄生虫,其肌幼虫被宿主食入后需要在pH2~3的胃液内停留2 h左右继而进入肠道内变为成虫[17],导致宿主感染旋毛虫病,其发育过程说明旋毛虫具有较强的抗酸能力[18-19]。细菌在pH2.0~2.5的酸性培养基内培养2 h后存活率大于10%则认为细菌具有抗酸性[17],张妍[20]和孟诗[14]等发现,旋毛虫中存在谷氨酸依赖型抗酸系统和谷氨酰胺依赖型抗酸系统,杨啸等[8]发现在旋毛虫耐受胃酸环境时Ts-ODC基因转录及蛋白表达水平均有显著提高。上述内容均提示旋毛虫中可能存在与大肠埃希菌等致病菌类似的抗酸机制。本研究通过siRNA技术干扰Ts-ODC基因后,将肌幼虫置于不同pH的培养液内培养不同时间,qPCR技术检测各组Ts-ODC基因转录水平,结果显示,RNA干扰组Ts-ODC基因转录水平显著低于未干扰组,随培养液酸性增大,各组Ts-ODC基因转录水平逐渐升高,在pH2.5时Ts-ODC基因的转录水平显著高于pH4.5和pH6.6时的转录水平,随培养时间的延长,Ts-ODC基因转录水平也逐渐升高,研究结果表明,RNA干扰可抑制Ts-ODC基因转录水平,酸性环境能显著诱导Ts-ODC基因转录水平提高,旋毛虫肌幼虫体内存在AR6抗酸系统。

大肠埃希菌含有两种ODC,组成型SpeC和酸诱导型SpeF[5],ODC主要通过抵抗外界酸环境维持细菌等的正常生长来参与环境应激[5],鸟氨酸在ODC的作用下脱羧产生大量腐胺,腐胺在亚精胺合成酶的作用下转化为亚精胺,最终生成精胺,在此过程中大量消耗质子,从而抵抗外界酸环境[8, 21-23]。SpeF能催化鸟氨酸脱羧反应启动多胺合成途径,是多胺生物合成过程中第一个限速酶[24-25],其表达量和生物活性与多胺的生成相关,对细胞增殖和凋亡的调控起重要作用[26]。在本研究中发现酸性环境能显著诱导Ts-ODC基因转录水平提高,由此猜测旋毛虫肌幼虫内存在酸诱导型SpeF,并且可通过抗酸来发挥环境应激作用,相关内容研究较少,后续可进一步进行试验验证。在旋毛虫肌幼虫抗酸能力的检测中,将Ts-ODC基因干扰后的旋毛虫肌幼虫置于不同pH的培养液中培养不同时间,siRNA-757干扰组的旋毛虫肌幼虫的存活率明显低于未干扰组,且随酸性增大或培养时间延长,虫体存活率均有显著降低,由此可知,干扰Ts-ODC基因导致肌幼虫抗酸能力下降,但pH2.5培养2 h时siRNA-757干扰组肌幼虫存活率仍然可达27%,说明肌幼虫仍有一定的抗酸能力,猜测是肌幼虫体内存在多种抗酸系统共同作用,酸性环境下激发了谷氨酸依赖型等其余抗酸系统发挥作用,且siRNA并不能达到对基因100%干扰的效果[27]

在不同酸性培养液中检测酶活性的试验中发现,pH4.5时Ts-ODC酶活性高于其余pH值的培养液,且Ts-ODC基因干扰的肌幼虫Ts-ODC酶活性低于未干扰组,说明酸性条件下Ts-ODC酶活性升高且siRNA干扰肌幼虫Ts-ODC基因会使Ts-ODC酶活性降低。由以上试验结果可见,随着培养液酸性的增大,Ts-ODC的酶活性也随之降低,影响了鸟氨酸脱羧消耗质子最终生成腐胺的过程,使肌幼虫调节体内外pH值的能力下降,从而使虫体存活率降低;Ts-ODC酶活性的降低也会影响多胺的生成[28-29],一方面影响肌幼虫的细胞增殖调控[26, 30],另一方面会影响虫体抗氧化损伤的能力[31-32]。将小鼠分别感染siRNA-757干扰虫体和空白未干扰虫体发现其肌幼虫和成虫减虫率分别为58.95%和65.91%,进一步证明Ts-ODC基因的干扰降低了虫体对胃酸的抵抗能力及繁殖力;在试验前期通过间接免疫荧光试验对Ts-ODC酶定位时发现该酶主要位于肌幼虫全身表皮及生殖原基内,说明Ts-ODC主要位于肌幼虫体表发挥抗酸作用,在肌幼虫接触到抗酸环境时能直接发挥保护虫体的功能。分别收集Ts-ODC基因干扰组和未干扰组小鼠子一代肌幼虫,将其置于pH2.5的培养液内培养2 h,siRNA-757干扰虫体组F1代肌幼虫存活率为59.67%,与siRNA-757组F0代相比差异明显,与空白虫体组F1代相比无明显差异,说明siRNA的干扰效果无法有效遗传给下一代,与相关文献内siRNA为瞬时转染的结论相一致[33],后期试验可采用慢病毒等方式进行Ts-ODC基因的敲除,便于进一步深入探索旋毛虫肌幼虫AR6抗酸系统。

本研究首次通过siRNA干扰旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因并证实Ts-ODC为旋毛虫的重要抗酸基因,Ts-ODC基因干扰会降低肌幼虫的抗酸能力,该研究结果为揭示旋毛虫致病机理、研究新型驱虫药物治疗靶点及新型疫苗提供理论依据。

4 结论

通过基因和蛋白水平检测,成功从3个Ts-ODC siRNA分子中筛选出干扰效果最佳的siRNA-757;通过检测酸刺激前后的肌幼虫Ts-ODC基因转录水平、酶活性及存活率变化发现,Ts-ODC是旋毛虫肌幼虫重要的抗酸基因,Ts-ODC基因干扰能够降低肌幼虫的抗酸能力;siRNA介导肌幼虫Ts-ODC基因干扰降低了其对胃液的耐受能力,但无遗传效应;本研究可为旋毛虫病的防治提供新思路。

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(编辑   白永平)