2. 农业微生物学国家重点实验室, 武汉 430070;
3. 华中农业大学动物疫病诊断中心, 武汉 430070
2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Wuhan 430070, China;
3. Huazhong Agricultural University Animal Disease Diagnostic Center, Wuhan 430070, China
我国受地理位置与气候类型影响导致夏季水灾频发,受水灾影响猪场中水样的细菌种类变得异常复杂,这为传染病的传播创造了有利的条件。为了解猪场中不同水样的细菌污染情况,我国学者开展了多项研究。郭又春等[1]和李建波等[2]通过检测猪饮用水中的细菌总数和大肠杆菌总数,来判定饮用水的污染程度。闫宏等[3]运用菌落计数法对宁夏某规模化养猪场的排污水进行分段评估,研究了排放过程中不同环节污水的细菌总数,但目前为止尚无针对水灾后养猪场水样中菌群组成及水源性致病菌的高通量研究。2021年7月20日,河南中北部地区突发特大暴雨,此次水灾涉及郑州、焦作、新乡、洛阳等多个地区,对受灾区域内的农牧产业造成了严重的影响。降水量大的区域甚至出现了猪场被洪水淹没的现象。洪水过后猪场的水体中存在的病原菌特点依然是业界迫切想了解的重点问题。本研究运用细菌16S rDNA高通量测序技术,以探究水灾过后猪场水样中的细菌种类及组成。
1 材料与方法 1.1 样品收集洪水发生后,本实验室采取实地采样和委托采样的方式在河南省周口、驻马店、焦作、开封等地区的26个规模化猪场收集了48份水样,包括19份猪场饮用水、22份猪场地面残留的积雨水和7份猪场废弃污水,以下简称饮水(drinking water,DW)、积雨水(rainwater,RW)、污水(wastewater,WW)。每份样品用灭菌后的50 mL离心管直接采集。
1.2 菌落计数参考《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)中的饮用水菌落计数方法对河南省各地区采集的水样进行菌落总数计数[4]。根据水样类别不同,饮水、积雨水和污水分别选择(101、102、103)、(103、104、105)和(105、106、107)的稀释倍数进行菌落计数。
1.3 16S rDNA V3-V4区高通量测序将采集的48份样品在超净工作台中用纱布过滤掉污水中的不溶沉淀,用0.22 μm滤器(Millex针式过滤器)过滤水样完成细菌富集,整个试验流程严格遵守无菌操作要求。因不同水样的含菌量有所不同,本研究以滤器无法过滤水体为过滤终点。随后将滤器拆卸取出滤膜,装入无菌的2.0 mL EP管中,送往北京擎科生物科技有限公司进行16S rDNA V3-V4区高通量测序,测序引物为38F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′,806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。本研究涉及的测序方法基于Illumina Novaseq测序平台,采用双末端测序结合构建小片段文库的方法进行测序。通过将测序所得的碱基序列(Reads)进行拼接、过滤、聚类和去除嵌合体后,对比Silva(Release132)数据库进行物种注释及丰度分析。OTU聚类使用USEARCH(version 10.0)软件在相似性97%的水平上对测序所得的序列进行聚类,根据不同的相似度水平,对所有序列进行OTU划分(OTU即分类操作单元,是在物种聚类中为了便于进行分析,每个OTU对应一种代表序列),默认以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTUs。
1.4 水样杀菌试验将同一地区收集的积雨水和污水样品进行等体积合样,选用现阶段规模化猪场常用的过硫酸氢钾复合物、片状氢氧化钠(有效含量99%)和氯制剂(有效氯浓度5%)作为消毒剂,开展积雨水和污水的杀菌试验。分别将10、50和100倍稀释后的消毒剂与等量积雨水和污水混合作用。消毒30 min后进行平板菌落计数,验证不同消毒剂的杀菌效果。同时设置不加消毒剂的水样为阳性对照,PBS为阴性对照。
2 结果 2.1 水样菌落计数结果菌落计数结果显示,饮水、积雨水和污水中的平均菌落数分别为1.55×105、1.88×108和3.70×109 CFU·mL-1,水灾过后污水中的细菌总数最多,其次为积雨水。饮水中的细菌总数最少,但严重超出国家饮用水标准中小于100 CFU·mL-1的规定。
2.2 高通量测序结果2.2.1 OTUs聚类及与CFU的相关性分析 本研究共获得1 359个OTUs。将不同水样中的OTU数目与所含细菌总数进行Spearman相关性分析,未发现污水和积雨水中的细菌总数与OTU数之间有显著相关性。但发现饮水中细菌总数与OTU呈负相关,即饮水中含有的细菌量越多,高通量测序检出的物种数越少,r值为-0.640 1,p值为0.006 8,具有强的负相关性,结果如图 1所示。其中饮水中OTU数在550~1 120个之间,菌落数在1 250~1 520 000 CFU·mL-1之间。
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图 1 饮水OTU与菌落数相关性分析图 Fig. 1 Correlation analysis chart of drinking water OTU and bacterial counts |
2.2.2 稀释曲线 稀释曲线横轴为样本测序产生的序列数,纵轴为序列数所对应的OTU数,每条曲线代表一个样本,曲线达到平缓则可判定为该样本的测序数据量充足。本研究中所有水样的稀释曲线如图 2所示,新OTU的发现数伴随测序样品序列数的增多而逐渐增加,曲线缓慢上升最终趋于平缓,表明本试验各样品的测序量充足。
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图 2 各样品稀释曲线 Fig. 2 Rarefaction Curve of each samples |
2.2.3 门水平菌群结构分析 门(phylum)水平上相对丰度前10的菌门分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、uncultured_bacterium_k_bacteria、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Epsilonbacteraeota、酸杆菌门(Acidobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria),共占据了总丰度的97.85%,相对丰度占比分别为61.06%、11.84%、6.95%、5.78%、4.51%、3.25%、2.14%、1.25%、0.54%、0.53%,如图 3所示。组间方差分析显示,饮水中放线菌门、绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度显著大于积雨水组和污水组,而拟杆菌门的相对丰度显著小于其他组。污水中Epsilonbacteraeota的相对丰度显著大于其他组。
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图 3 门分类水平上饮水组(DW)、积雨水组(RW)和污水组(WW)物种相对丰度柱状图 Fig. 3 The barplot of relative abundance of species in drinking water (DW), rainwater (RW) and wastewater (WW) at phylum level |
2.2.4 属水平菌群结构 如图 4所示,所有水样在属(genus)水平上丰度占比前10的菌属分别是不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)、黄杆菌属(Flarobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、uncultured_bacterium_k_Bacteria、丛毛单胞菌属(Comamonas)、Limnohabitans、普雷沃菌属(Prevotella),共占据了总丰度的38.15%,10个菌属的相对丰度占比分别为8.49%、5.75%、4.10%、3.66%、3.59%、3.58%、3.25%、2.02%、1.86%、1.86%。除此之外,本研究在饮水、积雨水和污水中均检测到了其他致病菌相关菌属,包括丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)、弓形杆菌属(Arcobacter)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、弧菌属(Vibrio)、嗜血杆菌属(Haemophilus)和黄杆菌属(Flavobacterium)。
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图 4 属分类水平上饮水组(DW)、积雨水组(RW)和污水组(WW)物种相对丰度柱状图 Fig. 4 The barplot of relative abundance of species in drinking water (DW), rainwater (RW) and wastewater (WW) at genus level |
2.2.5 LEfSe组间差异性分析 LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)分析能够在不同组间寻找具有统计学差异的生物标志物。图 5为LDA值分布柱状图(P < 0.05,LDA>4)。从门水平到种水平,共有34个物种分类具有组间显著差异,包括4门6纲8目6科6属4种。
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柱状图中展示了LDA Score大于4.0的物种,柱状图的长度代表差异物种的影响大小 Species with LDA Score greater than 4.0 are displayed in the bar graph, and the length of the bar graph represents the impact size of the different species 图 5 LEfSe分析柱状图 Fig. 5 The histogram of LEfSe analysis |
门水平上,绿弯菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria)在饮水(drinking water, DW)中的相对丰度显著高于其他组;拟杆菌门(Bacteroidetes)在积雨水(rainwater, RW)中的相对丰度显著高于其他组;Epsilonbacteraeota在污水(wastewater, WW)中的相对丰度显著高于其他组。属水平上,Aquabacterium在DW组中显著高于其他组;黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、Hydrogenophaga在RW组中的相对丰度显著高于其他组,其中黄杆菌属和气单胞菌属为致病菌相关菌属;弓形杆菌属(Arcobacter)、从毛单胞菌属(Comamonas)在WW组中的相对丰度显著高于其他组,其中弓形杆菌属为致病菌相关菌属。种水平上,DW组中不存在显著性差异的物种;豚鼠气单胞菌Aeromonas caviae和uncultured_bacterium_g_Hydrogenophaga是RW组中显著高于其他组的菌种,豚鼠气单胞菌为人的致病菌;嗜低温弓形杆菌(Arcobacter cryaerophilus)和脱氮从毛单胞菌(Comamonas denitrificans)是WW组中丰度显著的菌种。
2.2.6 种水平致病菌分析 使用GraphPad Prism 9.0软件,采用F检验在种分类水平上,对至少1种水样中相对丰度占比大于1%的8种致病菌进行组间方差分析,具体结果见图 6。饮水组、积雨水组和污水组中的嗜低温弓形杆菌(Arcobacter cryaerophilus)的丰度分别为0.30%、0.32%、5.01%,在所有水样中都有检出,污水组中A. cryaerophilus的相对丰度远大于积雨水组和饮水组,P<0.001,差异极显著。猪链球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、豚鼠气单胞菌、阴沟肠杆菌、酪黄肠球菌和恶臭假单胞菌在饮水中的相对丰度和检出率分别为(1.42%,89.47%)、(1.60%,100%)、(1.85%,100%)、(1.36%,100%)、(6.52%,100%)、(0.15%,63.16%)和(1.84%,100%),在积雨水中的相对丰度和检出率分别为(0.07%,95.45%)、(1.37%,100%)、(0.19%,95.45%)、(4.99%,100%)、(2.49%,100%)、(1.40%,90.91%)和(0.83%,100%),在污水中的相对丰度和检出率分别为(0.57%,100%)、(1.13%,100%)、(0.32%,100%)、(0.37%,100%)、(2.19%,100%)、(0.10%,100%)和(0.47%,100%)。
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***代表P<0.001 *** means P < 0.001 图 6 不同组别中致病菌的方差分析柱状图 Fig. 6 ANOVA histogram of pathogenic bacteria in different groups |
积雨水和污水的杀菌试验结果显示,氯制剂的杀菌效果优于过硫酸氢钾,远优于氢氧化钠。100倍稀释的氯制剂,即水样的有效氯终浓度达到250 mg·L-1时作用30 min,可有效杀灭积雨水中的细菌。50倍稀释的氯制剂,即有效氯的终浓度达到500 mg·L-1时作用30 min可杀灭污水中99.99%以上的细菌。而10倍稀释的氯制剂,即有效氯的终浓度达到2 500 mg·L-1时,作用30 min可灭杀污水中全部的细菌,具体数据见表 1。
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表 1 不同杀菌试验后的活菌数 Table 1 The number of viable bacteria after different bactericidal tests CFU·mL-1 |
本研究发现,水灾过后猪场饮水中的细菌总数与OTU数呈负相关,这表明当饮水中的菌落数越多时OTU数越少。与污水和积雨水相比,饮用水中的营养物质、悬浮物相对较少且浑浊度更低,不利于污水中大多数细菌的生长和繁殖,在一定程度上起到了选择的作用,继而使饮水中的细菌群落具有一定的稳定性[5]。El-Chakhtoura等[6]分别以分钟、小时、天为时间间隔探究饮用水中细菌群落的动态变化情况,发现丰度较高的物种随着时间推移具有相对稳定性。我国有研究报道,饮用水中的优势物种可以利用微量可降解的有机物进行生长[7]。基于此,推测饮用水受到一定量的污染时,菌群丰度会出现暂时性地增高,在低营养环境持续的筛选作用下,菌群结构逐渐恢复,但引入的有机物给水中的优势菌群提供生长所需的营养物质,从而使饮水中的细菌总数与OTU数呈负相关。因此在评估水灾发生后猪场饮用水的污染程度时,可选用高通量测序技术对细菌计数结果进行补充,从而得出更准确的结论。
3.2 水样中差异菌群3种水样的组间方差和LEfSe分析结果显示,放线菌门和绿弯菌门在饮水中的丰度显著大于其他组别,这2个菌门广泛存在于洁净水域中,是河流、地下水中的优势菌门,Epsilonbacteraeota广泛存在于各种污水中,是污水中的优势菌门,这与Milakovic'等[5]的研究结果相一致。属水平上,弓形杆菌属是Epsilonbacteraeota菌门下的分支,广泛存在于不同的污水环境中。黄杆菌属多见于阴冷潮湿的环境中,可导致人呼吸道感染,严重可致人死亡[8]。差异分析表明,水灾过后猪场中积雨水和污水的病原菌污染现象严重,含有丰度占比显著大于饮水的致病菌。
3.3 水样中病原菌的公共卫生意义基于高通量测序技术,本研究在采集的水样中检测到了多种水源性致病菌相关菌属,包括弓形杆菌属、黄杆菌属、梭菌属和弧菌属等[9-10]。同时检测到多种致病菌,其中嗜低温弓形杆菌是食源性和水源性人畜共患病原菌,与人和动物的腹泻、菌血症密切相关[11],广泛存在于河流、湖泊和污水中[12]。污水是弓形杆菌属细菌生长的良好载体,同时含菌量极高[13]。Milakovi Ac'1等[5]发现,制药厂废水中弓形杆菌属细菌的丰度与耐药基因的拷贝量显著相关,证明了该菌与抗生素耐药基因和整合子的传递有关,此外高密度的细菌会促进质粒介导的耐药基因进行水平转移[14]。种种现象表明,污水中的弓形杆菌可能在传递耐药性上发挥重要作用。临床上,嗜低温弓形杆菌与母猪流产、繁殖障碍和猪群腹泻有关,可经垂直传播由母猪感染仔猪,并且可以通过水体媒介进入宿主肠道,引发一系列的肠道疾病[15-17]。鲍曼不动杆菌、豚鼠气单胞菌、大肠杆菌和猪链球菌为典型的人畜共患病原菌。鲍曼不动杆菌是医院中造成感染的重要致病菌,我国学者发现,该菌也可造成仔猪严重的腹泻,且与母猪流产的发生有紧密的联系,相关猪源鲍曼不动杆菌的小鼠感染试验显示,该菌对小鼠有明显的致病性[18-19]。豚鼠气单胞菌广泛存在于各种水环境中,可引起人伤口、尿路和肝胆道感染,严重时可继发败血症,危及生命安全[20],该菌在猪群中亦有报道,陈枝华[21]发现该菌与大肠杆菌混合感染引发仔猪腹泻,韩桂英等[22]报道了该菌通过猪肉制品传播扩散,引发41人食物中毒的案例。大肠杆菌可引起猪的腹泻和水肿病等相关病症,同时该菌也是饮用水标准检验方法的判定菌种。猪链球菌的高毒力毒株可引起猪和人类的脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎和感染性休克等症状,死亡率很高[23]。阴沟肠杆菌,恶臭假单胞菌和酪黄肠球菌均为条件性致病菌,在人的免疫力低下时可造成菌血症和不同种类的局部感染,有研究在猪粪中发现了含有耐药质粒的阴沟肠杆菌、酪黄肠球菌,并且动物源肠杆菌和肠球菌的抗生素耐药基因具有通过食物链向消费者转移的风险[24-26]。这都说明了水灾后猪场存在严峻的公共卫生隐患,开展水体和环境消毒对保护人和动物健康安全至关重要。
3.4 杀菌试验本研究针对采集的洪水样本(养殖场的积雨水和污水)开展消毒剂杀菌试验,发现氯制剂在进行水样消毒时效果显著。对污染情况较低的积雨水而言,其所含菌落平均数为1.88×108 CFU·mL-1,选用含氯消毒剂,使污染水体有效氯浓度达到0.025%时可满足消毒需求;对污染情况较重的猪场污水而言,其所含菌量的平均值达到了3.70×109 CFU·mL-1,当污染水体效氯浓度达到0.05%时可杀灭污水中99.99%以上的细菌;若水体污染过于严重,使水体中有效氯浓度达到0.25%,即可杀灭全部细菌。
4 结论水灾后所有被检猪场的饮用水均出现含菌量超标现象,且在不同种类的水样中检测到多种人畜共患的致病菌,这对猪场内人和动物的健康安全造成了极大的安全隐患;氯制剂对污染的水体具有良好的杀菌效果,这为猪场防控可能出现的细菌性疾病提供技术支撑。
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(编辑 范子娟)