, YUAN Ye, LI Junmei, TIAN Lulu, DIAO Ziyang, LI Bin, CHEN Jialu, ZHOU Dong, JIN Yaping, WANG Aihua
布鲁氏菌(Brucella)是革兰阴性兼性胞内寄生菌，可感染人、畜和多种野生动物，引起重要的人兽共患传染病——布鲁氏菌病(brucellosis)，简称“布病”。该病广泛流行于世界各地，严重威胁人类健康，给畜牧业生产造成了巨大损失[1-2]。人类通常通过接触受感染动物及其分泌物，或进食受污染的肉类或奶制品而遭感染[3]。防控布病的有效策略是控制和根除布鲁氏菌在动物间的流行和传播，而检测、淘汰和疫苗免疫是布病防控的主要手段[4]。当前，用于布病检测的抗原主要是布鲁氏菌全菌或LPS，与大肠杆菌O: 157、肠道结肠炎耶尔森菌O: 9、沙门菌O: 30、霍乱弧菌O: 1和嗜麦芽窄食单胞菌等存在部分共同抗原，检测过程中易发生交叉反应，导致诊断的特异性降低[5-6]。因而，选择兼具特异性和保守性的检测抗原，建立具有高特异性、准确性和简单快速的检测方法，对于布鲁氏菌病的防控具有重要价值。
布鲁氏菌外膜蛋白16(outer membrane protein 16，OMP16)是一种肽聚糖相关脂蛋白，在布鲁氏菌各种间具有高度保守性，是维持其外膜完整性和体内外存活的关键，作为病原相关分子模式之一，在体内发挥活化树突状细胞、诱导Th1型免疫反应的作用，此外，OMP16可作为免疫自佐剂激活机体免疫反应[7-8]。OMP16具有良好的免疫原性，免疫小鼠后可激活机体产生高水平IgG，刺激TNF-γ、IL-1β等免疫相关细胞因子分泌，是一种重要的保护性抗原，有用作检测抗原的潜力[9]。
单克隆抗体以其高特异性和亲和力的特点，广泛用于疫病和毒素等检测技术。应用单克隆抗体建立的抗体竞争ELISA方法，通过与样品中待检抗体竞争性结合包被抗原的特定识别位点，可定性或定量反映样品检测结果，常用于动物疫病防控，霉菌毒素检测和激素定量检测等领域[10-11]。竞争ELISA特异性好、灵敏性高，有利于提高布病临床检测结果的准确性，减少因假阳性或假阴性造成的个体损失，可实现样本高通量快速检测，是世界动物卫生组织(OIE)和我国布鲁氏菌病检测标准的推荐方法[12-13]。本研究分别构建了携带His或GST标签OMP16的原核表达系统，经表达、纯化，获得重组OMP16(rOMP16)。通过小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选获得OMP16特异性杂交瘤细胞株。利用rOMP16和纯化单抗建立布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法，探索基于布鲁氏菌OMP16免疫血清学检测方法的可行性，以期为布鲁氏菌病的临床防控提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 实验动物、菌株和血清B. suis S2菌株、pET-32a-omp16和pGEX-4T-1载体、SP2/0细胞、小鼠B. suis S2阳性血清、羊布鲁氏菌阳性/阴性血清，本实验室保存。羊临床血清样本采自陕西省某规模化养殖场，本实验室保存。大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21(DE3)，购自北京天根生化科技有限公司；6×His标签抗体和GST抗体，购自Santa Cruz生物公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG(H+L)抗体购自康为世纪生物科技股份有限公司。6~8周龄SPF级雌性BLAB/c小鼠，购自成都达硕实验动物有限公司。
1.2 主要试剂His标签蛋白纯化试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；GST标签蛋白纯化试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；Protein L抗体纯化试剂盒购自常州天地人和生物科技有限公司；PEG 4000、TMB显色液、BSA、脱脂乳粉、明胶购自北京索莱宝科技有限公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；HAT、HT购自Thermo Fisher Scientific公司；秋水仙素购自Abmole公司；小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自Proteintech公司。
1.3 omp16基因克隆与原核表达载体构建根据课题组前期对布鲁氏菌OMP16生物信息学预测结果和pGEX-4T-1载体酶切位点EcoRⅠ上下游同源臂序列，设计无信号肽和跨膜区omp16(Un-signal peptide and transmembrane region omp16，uomp16)上下游引物：uomp16-F, 5′-CCGCGTGGATCCCCGGAATTCAAGAAGAAC-CTTCCGAATAA-3′；uomp16-R，5′-CTCGAGTC-GACCCGGGAATTCCCGTCCGGCCCCGTTGAG-AA-3′，引物由西安擎科泽西生物科技有限公司合成。以布鲁氏菌B. suis S2菌株基因组为模板扩增目的基因，利用同源重组技术构建原核表达载体pGEX-4T-1-uomp16，经酶切、测序鉴定。载体利用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，经菌落PCR鉴定。
1.4 rOMP16的表达与纯化BL21-pGEX-4T-1-uomp16菌液接种到LBAmp+培养基中，37 ℃振荡培养，至细菌处于对数生长期(OD600 nm≈0.6)，加入终浓度0.5或1.0 mmol·L-1的诱导剂IPTG，22 ℃诱导培养8 h，离心收集菌体，低温超声裂解至澄清。裂解上清及沉淀利用SDS-PAGE凝胶电泳-考马斯亮蓝检测蛋白表达情况；同样方法将本实验室保存的pET-32a-omp16原核表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，诱导并检测蛋白表达情况。菌液表达后，收集菌体裂解上清，分别按照GST标签蛋白纯化试剂盒或His标签蛋白纯化试剂盒说明纯化目的蛋白。纯化蛋白置于PBS(pH 7.4)中透析，经PEG8000浓缩后使用BCA法检测其浓度。Western blot试验分析rOMP16免疫反应性。
1.5 OMP16单克隆抗体制备1.5.1 小鼠免疫与血清效价检测 将50 μg rHis-OMP16与等体积弗氏完全佐剂(FCA)或弗氏不完全佐剂(FIA)充分混合乳化，背部皮下多点注射免疫小鼠；FCA首免，以后每间隔2周FIA加强免疫1次，第3次免疫后7 d，采集小鼠血清。rGST-uOMP16作包被抗原，iELISA方法检测小鼠血清中OMP16抗体水平，符合要求后，细胞融合前3 d按照100 μg蛋白/只，经腹腔注射加强免疫。
1.5.2 基于rGST-uOMP16包被抗原的iELISA方法建立 利用方阵滴定法，将rGST-uOMP16按照2、1、0.5或0.25 μg·mL-1浓度稀释作包被抗原，免疫/对照小鼠血清按照10-4、5×10-4、10-5或5×10-5稀释倍数稀释作一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体按照1:3 000、1:5 000、1:8 000、1:10 000或1:12 000稀释倍数稀释作二抗，计算P/N值，建立小鼠OMP16抗体iELISA方法供后续杂交瘤细胞筛选使用。
1.5.3 OMP16特异性杂交瘤细胞株的建立与单抗性质分析 免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞在PEG4000作用下融合，利用细胞有限稀释法筛选可稳定分泌OMP16特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。收集杂交瘤细胞上清，按照单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明鉴定单抗亚型；秋水仙素阻抑法分析杂交瘤细胞染色体数目和核型；Western blot试验分析单抗交叉反应性。
1.6 OMP16抗体cELISA方法的建立1.6.1 小鼠腹水制备与纯化 腹水诱生法制备小鼠腹水，收集后利用饱和硫酸铵沉淀法粗提，随后按照Protein L抗体纯化试剂盒说明纯化单抗。
1.6.2 cELISA方法的建立及反应条件优化 利用方阵滴定法，使用碳酸盐包被液将rGST-uOMP16稀释至终浓度5、2.5、1.25、0.625、0.312 5或0.156 25 μg·mL-1，100 μL·孔-1，4 ℃过夜包被。PBST洗涤3次后，分别使用1%BSA、5%脱脂乳、10%脱脂乳或3%明胶，100 μL·孔-1，在37 ℃，1、1.5或2 h条件下封闭。洗涤后，将单抗分别按照1:40、1:80、1:100、1:160、1:200、1:320、1:400或1:800的稀释倍数稀释，血清按照1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:100、1:160或1:200的稀释倍数稀释，二者混匀后，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h。洗涤后，将酶标二抗分别按照1:3 000、1:5 000、1:8 000、1:12 000或1:15 000的稀释倍数稀释，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h。洗涤后，加入TMB显色液，100 μL·孔-1，37 ℃避光孵育30 min。2 mol·L-1 H2SO4终止液50 μL·孔-1，终止反应。经酶标仪在OD450 nm处读数后，计算P/N值确定最佳反应条件。
1.6.3 临界值的确定 利用所建立方法，检测28份羊布鲁氏菌阴性血清样本并计算其抑制率(PI%)，即PI%=(阴性血清OD450 nm-阳性血清OD450 nm)/阴性血清OD450 nm×100%，SPSS 26软件统计样本分布频数、计算PI的平均值(x)和标准差(s)，确定该方法的临界值。
1.6.4 符合率试验 自陕西省某规模化养殖场采集羊临床血清样本190份，分别使用试管凝集试验(SAT)和本研究建立方法检测，计算二者符合率。
2 结果 2.1 OMP16基因克隆与原核表达载体构建以布鲁氏菌基因组为模板，扩增了uomp16基因(图 1A)。载体酶切鉴定结果如图 1B所示，可见4 969 bp的表达载体和465 bp的目的条带，表明原核表达载体pGEX-4T-1-uomp16构建成功。菌落PCR鉴定结果如图 1C所示，465 bp处成功扩增到目的条带，表明rGST-uOMP16的大肠杆菌原核表达系统构建成功。
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A. uomp16基因克隆(M. DL1000 DNA相对分子质量标准；1. uomp16；2. Control)；B. EcoRⅠ酶切鉴定(M. DL10000 DNA相对分子质量标准; 1. pGEX-4T-1-uomp16; 2. pGEX-4T-1)；C. 菌落PCR鉴定(M. DL2000 DNA相对分子质量标准; 1. uomp16；2. Control) A. uomp16 gene amplification (M. DL1000 DNA marker; 1. uomp16;2. Control); B. EcoR I digestion identification (M. DL10000 DNA marker; 1. pGEX-4T-1-uomp16; 2. pGEX-4T-1); C. Colony PCR identification (M. DL2000 DNA marker; 1. uomp16;2. Control) 图 1 uomp16基因克隆和原核表达载体构建 Fig. 1 uomp16 gene clone and construction of prokaryotic expression vector |
2.2.1 rGST-uOMP16的纯化及鉴定 原核表达系统BL21-pGEX-4T-1-uomp16经表达、纯化后，结果如图 2A所示，在44 ku处出现明显条带，大小与预期相符，表明得到了较高纯度的rGST-uOMP16；透析、浓缩后测定其浓度为0.96 mg·mL-1。Western bolt鉴定结果显示，目的蛋白可与小鼠B. suis S2阳性血清(图 2B)或GST标签抗体反应(图 2C)，表明该蛋白具有良好的反应原性。
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A. rGST-uOMP16的纯化；B. 小鼠阳性血清；C. GST标签抗体 A. Purification of rGST-uOMP16; B. Mouse positive serum; C. Anti-GST tag antibodies 图 2 rGST-uOMP16纯化及鉴定 Fig. 2 Purification and identification of rGST-uOMP16 |
2.2.2 rHis-OMP16的纯化及鉴定 原核表达系统BL21-pET-32a-omp16经IPTG诱导后，成功得到可溶性rHis-OMP16，其大小约37 ku，且纯化后得到较高纯度的rHis-OMP16(图 3A)；透析、浓缩后，测定其浓度为0.45 mg·mL-1。Western bolt鉴定结果显示目的蛋白可与小鼠B. suis S2阳性血清(图 3B)或His标签抗体反应(图 3C)，表明该蛋白具有良好的反应原性。
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A. rHis-OMP16的纯化；B. 小鼠阳性血清；C. His标签抗体 A. Purification of rHis-OMP16; B. Mouse positive serum; C. Anti-His tag antibodies 图 3 rHis-OMP16纯化及鉴定 Fig. 3 Purification and Identification of rHis-OMP16 |
2.2.3 小鼠血清抗体效价检测与iELISA方法的建立 免疫后小鼠血清抗体效价均达到1:106~1:107，达到预期免疫效果。以rGST-uOMP16作包被抗原建立了单抗筛选的iELISA方法：抗原包被浓度0.5 μg·mL-1、细胞上清100 μL·孔-1、酶标二抗1:5 000稀释，同时设置阳性血清(1:5×104)和阴性SP2/0细胞上清对照孔，其他条件与常规方法相同，当细胞上清OD450 nm /阴性对照OD450 nm≥ 2.1时，判为阳性。
2.2.4 OMP16单克隆抗体制备及鉴定 筛选到1株OMP16特异性杂交瘤细胞，命名为B7，经鉴定，该细胞核型稳定，染色体形态正常；抗原识别位点位于OMP16部分，与标签蛋白无交叉反应，所分泌抗体亚型为IgM-κ(图 4)。
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A. 杂交瘤细胞核型分析; B. 单克隆抗体亚型分析; C. 单克隆抗体交叉反应性分析 A. Hybridoma cell karyotype analysis; B. Monoclonal antibody subtype analysis; C. Monoclonal antibody cross-reactivity analysis 图 4 单克隆抗体鉴定 Fig. 4 Identification of monoclonal antibodies |
2.3.1 小鼠腹水制备与抗体纯化 制备并收集的小鼠腹水经粗提、纯化，得到了纯度较高的单克隆抗体，经透析、浓缩后，测定其浓度为2.4 mg·mL-1。
2.3.2 cELISA方法反应条件优化 经优化，确定cELISA方法最佳反应条件：最佳抗原包被浓度0.625 μg·mL-1，4 ℃包被过夜；最佳封闭液为3%明胶封闭液，37 ℃封闭2 h；最佳单抗稀释倍数1:200、最佳血清稀释倍数1:10，二者混匀后，37 ℃孵育1 h；最佳酶标二抗稀释倍数1:15 000，37 ℃孵育1 h；TMB显色液，37 ℃避光孵育30 min。
2.3.3 临界值的确定 按照上述cELISA方法，检测了28份羊布鲁氏菌阴性血清样本在OD450 nm处的吸光值并计算其PI值，结果如图 5所示，统计分析结果表明，样本PI值总体呈正态分布；计算该组样本的x(PI)为0.182，s为0.070，以x+2×s或x+3×s为阴阳临界值，确定该cELISA方法的阴性临界值(PI%)=32.2%，阳性临界值(PI%)=39.2%，即PI% < 32.2%时，判为阴性，>39.2%时，判为阳性，二者之间判为可疑。
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Number=28;x=0.182;s=0.070 图 5 羊布鲁氏菌阴性血清PI值频数分布 Fig. 5 Frequency distribution of PI value in Brucella goat negative serum |
2.3.4 符合率试验 分别使用试管凝集试验和上述cELISA方法检测了190份羊临床血清样本，结果如表 1所示，试管凝集试验(SAT)检出28份阳性血清，162份阴性血清，cELISA方法检出37份阳性血清(27份为SAT阳性，10份为SAT阴性)，153份阴性血清，二者检测结果的总体符合率为90.53%，表明该cELISA方法与试管凝集试验具有良好的一致性。
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表 1 cELISA符合率试验结果 Table 1 The results of cELISA coincidence test |
布鲁氏菌OMP16位于菌体外膜，在布鲁氏菌各种间具有高度保守性，是布鲁氏菌重要的保护性抗原[14-15]。Alizadeh等[16]的研究表明，重组OMP16免疫小鼠后可诱导机体高水平分泌以IgG1/IgG2a亚型为主的IgG抗体，有用作布病血清学检测的潜力。课题组前期已构建大肠杆菌BL21-pET-32a-omp16表达系统，诱导后表达可溶性的rHis-OMP16[17]。研究表明，在单抗制备过程中，使用单一蛋白免疫或筛选杂交瘤细胞，易受标签蛋白干扰，出现假阳性现象，而使用2种不同标签蛋白可有效避免该现象出现，提高筛选效率[18-19]。课题组前期构建的BL21-pGEX-4T-1-omp16表达系统，诱导后目的蛋白主要以包涵体形式存在，无法满足后续试验。熊流新等[20]的研究表明，截去B. melitensis ATCC 23456菌株OMP16信号肽和跨膜区序列后，可实现OMP16的高水平可溶性表达，且免疫原性与全长表达无显著差异。因此，本研究根据前期对OMP16的生物信息学分析结果克隆无信号肽和跨膜区uomp16基因，构建了BL21-pGEX-4T-1-uomp16原核表达系统，获得了高水平可溶性表达的rGST-uOMP16。结果表明，以布鲁氏菌rHis-OMP16作为免疫抗原免疫小鼠，rGST-uOMP16作检测抗原筛选阳性杂交瘤细胞降低了筛选过程中假阳性现象出现，排除了标签蛋白干扰，提高了筛选效率。
当前，布鲁氏菌病检测技术主要有病原学检测、免疫血清学检测和分子生物学检测，其中，虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和PCR技术等是世界动物卫生组织(OIE)和我国布鲁氏菌病检测标准的推荐方法[21-22]。考虑到成本及操作便利性，虎红平板凝集试验和试管凝集试验仍是规模化养殖场常用检测手段，但该方法存在假阳性高、主观性强和无法鉴别诊断的缺陷[23-24]。分子生物学检测技术发展迅速、结果可靠，可作为布病检测的有效补充，但受限于试验场地、操作和检测成本等问题，不利于临床大规模使用[25-26]。ELISA方法较RBPT和SAT方法特异性、敏感性高，有利于提高布病临床检测的准确性，减少因假阳性或假阴性造成的损失；与PCR方法相比，可实现高通量、规模化检测，适合布病的临床防控和流行病学调查[27-28]。
在布病检测中，cELISA可检测包括IgG型和IgM型在内的多种抗体，敏感性较好，常用作样本初检，iELISA受限于酶标二抗的选择，主要检测单一类型抗体，特异性较好，故用作于阳性/可疑样本的确诊[29-30]。田路路等[31]的研究表明，以OMP16作为包被抗原建立的羊布鲁氏菌抗体iELISA方法显示出较高的敏感性，与RBPT检测结果一致性良好。当前，尚无布鲁氏菌OMP16单克隆抗体制备与其cELISA方法建立的报道，本研究利用所筛选的OMP16特异性单克隆抗体初步建立了布鲁氏菌OMP16抗体cELISA方法，临床血清样本检测结果表现出较高的应用价值，后期可通过增加血清样本数量和背景，优化反应条件，对该方法进一步完善和开发，以作为当前布鲁氏菌病免疫血清学检测方法的有效补充。
4 结论本研究表达、纯化了带有GST或His标签的rOMP16，筛选到1株核型稳定的布鲁氏菌OMP16特异性杂交瘤细胞株，获得IgM-κ型单克隆抗体，初步建立了布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法，有望为布鲁氏菌病的临床防控提供技术支持。
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(编辑 白永平)