副猪格拉瑟菌病俗称猪格氏病(Glässer’s病),该病由存在于正常猪群呼吸道的副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis)在其他病原感染或应激情况下所诱发,临床出现猪体发热同时伴有纤维素性和脓性浆膜炎、关节炎、心包炎、腹膜炎以及化脓性脑膜炎等临床症状,从而给全球的养猪产业带来巨大损失[1-2]。从1952年至今,共确定了15种标准血清型,但仍有20%的分离株未能进行血清分型[3-4],近年来,中国流行的优势血清型为4型和5型[5]。我国G. parasuis在猪群中的感染率达到27.8%[3]。由于抗生素的广泛使用,有报道发现临床分离的G. parasuis分离株对抗菌药物产生了广泛的耐药性,因此,接种副猪格拉瑟菌疫苗就成为防控猪格氏病的首要选择[6-7]。国内各猪场用于预防G. parasuis的疫苗仅对相应的血清型分离株保护作用强,缺乏对其他血清型G. parasuis的保护力。
亚单位疫苗是由特定的病原体蛋白或多肽与疫苗佐剂组成。有研究证明副猪格拉瑟菌的某些毒力因子可以作为重组亚单位疫苗的抗原成分,并能提供较高的保护力,这为副猪格拉瑟菌重组亚单位疫苗的研究提供有力依据[8]。在BALB/c小鼠模型中筛选的GbpA、LpxC、GmhA、outer membrane proteins和HxuCBA等抗原免疫后均能抵抗副猪格拉瑟菌感染,达到降低小鼠死亡率的作用[9-12]。
前期实验室利用标准5型副猪格拉瑟菌灭活苗免疫小鼠制备了2D1单抗,并对该单抗的靶向蛋白和细菌囊泡进行质谱分析,选择了CyaY、HPSNAG-1330、HPSNAG-0978、HPSNAG-0140、AfuA和Fe3+ABC-tbp共6个蛋白构建重组载体进行表达,Western blot结果也说明这6种重组蛋白可以与5型G. parasuis的阳性血清发生特异性反应。
基于此,本试验表达了6种重组蛋白作为候选抗原免疫BALB/c小鼠,根据特异性抗体水平、细胞因子水平、淋巴细胞增殖试验、临床病理变化等一系列试验综合评估6种蛋白对小鼠的免疫保护效果,为后期副猪格拉瑟菌重组亚单位疫苗的研制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 菌株、重组蛋白及实验动物Glaesserella parasuis 5型标准Nakasaki菌株;rHPSNAG-1330、rHPSNAG-0978、rHPSNAG-0140、rFe3+ABC-tbp、rAfuA和rCyaY共6种重组蛋白;6周龄雌性BALB/c小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物公司。
1.2 试剂cck-8、TMB显色液购自上海碧云天生物技术有限公司;HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-mouseIgG(H+L)购自BOSTER公司;IgG1和IgG2a购自南京天为生物有限公司;小鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司;E.Z.N.A. Total RNA KitⅠ购自OMEGA Bio-tek;HiScript Ⅲ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;SGExcel FastSYBR Master预混液购自生工生物工程有限公司;RPMI 1640购自江苏慧智生物科技有限公司;卡波姆971p粉末(配制成5 g·L-1浓度的水佐剂)由本实验室保存。
1.3 实验动物分组与免疫将63只6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成9组,每组7只,5只用于计算存活率,2只用于检测淋巴细胞增殖试验和细胞因子的表达。其中,亚单位疫苗组每种对应蛋白免疫50 μg·只-1,灭活苗组的Glaesserella parasuis Nakasaki菌株含量为2×1010CFU·mL-1,攻毒对照组注射0.01 mol·L-1 PBS,空白组既不免疫也不攻毒。每只小鼠背部皮下多点注射200 μL,抗原与卡波姆佐剂的比例为3:1,调节pH至7.2。一免后14 d进行二免,二免后14 d进行攻毒,攻毒剂量为1.26×109CFU,攻毒采取腹腔注射的方式。
1.4 小鼠血清中特异性抗体水平的检测二免后14 d收集小鼠血清,酶标板用0.01 mol·L-1碳酸盐缓冲液调整菌数至2×1010CFU·mL-1的菌液进行包被,每孔100 μL;每孔加入200 μL 50 mL·L-1脱脂乳封闭2 h,PBST洗涤3次;小鼠血清从第1个孔开始按1:100倍比稀释直至第12个孔,在37 ℃恒温箱中孵育1 h,PBST洗涤3次;以山羊抗小鼠(1:10 000)为二抗孵育45 min,PBST洗涤3次;避光条件下每孔加入100 μL TMB显色液,在37 ℃恒温箱中孵育10 min,加入50 μL 2 mol·L-1硫酸终止液,检测OD450 nm值。据上述方法,二抗为IgG1和IgG2a(1:10 000)检测二免后小鼠血清IgG1和IgG2a的水平。
1.5 小鼠脾淋巴细胞增殖试验二免后14 d,将小鼠处死后用眼科剪刀无菌分离脾,得到脾淋巴细胞,调整细胞数目为106·mL-1。试验组加入终浓度为10 μg·mL-1的蛋白,最终每孔体积100 μL,每组3个平行孔;阳性对照组和阴性对照组分别加入ConA(终浓度10 μg·mL-1)和无血清RPMI 1640培养液;背景组仅有RPMI 1640培养液无细胞。放置在50 mL·L-1 CO2、37 ℃恒温细胞培养箱中培养68 h,每孔加入cck-8溶液,继续孵育4 h,使用酶标仪测定450 nm处吸光值。计算刺激指数:刺激指数SI=(刺激孔OD值-背景OD值)/(阴性对照孔OD值-背景OD值)。
1.6 细胞因子水平的检测二免后14 d,利用小鼠外周血淋巴细胞分离液KIT分离外周血淋巴细胞,使用总RNA提取试剂盒提取外周血淋巴细胞总RNA,反转录成cDNA,利用SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒检测小鼠的细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-2,每组3个平行孔。
1.7 免疫攻毒后存活率利用Reed-Muench法确定BALB/c小鼠的半数致死量为6.32×108CFU。在免疫后14 d,将G. parasuis Nakasaki菌株摇至OD600 nm为0.8~1.2左右,将培养菌液在室温下8 000 r·min-1离心20 min,0.01 mol·L-1PBS洗涤3次后,用0.01 mol·L-1PBS将 G. parasuis菌液按照y = 43.94x-12.83(R2= 0.980,x代表OD600 nm值,y代表活菌数,其单位为108CFU)浓缩至所需要的活菌数含量,即2 LD50,立即对每只小鼠腹腔注射200 μL进行攻毒,攻毒后观察7 d,记录小鼠的发病与死亡情况,计算7 d内BALB/c小鼠的存活率。
1.8 病理组织切片的制备解剖所有攻毒组的小鼠,取出肺和脾,将部分组织块样品置于40 mL·L-1多聚甲醛中放置24 h,修整组织块重新固定于40 mL·L-1多聚甲醛中24 h,经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(5 μm)、展片(42 ℃)和烤片(37 ℃过夜)后,HE染色,利用中性树脂封片,显微镜下观察。
1.9 数据分析使用GraphPad Prism 5软件进行单因素方差分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著,P>0.05表示差异不显著。
2 结果 2.1 小鼠免疫后血清中特异性抗体水平检测免疫前小鼠的抗体与0.01 mol·L-1PBS的对照组数值无差异,判断为阴性,二免后的血清抗体水平显著高于空白组小鼠的水平(图 1A),这表明所有免疫组小鼠的机体均可以产生抗体。如图 1B、C所示,所有免疫组小鼠的机体均可以产生较高水平的IgG1和IgG2a,OD450 nmIgG2a/OD450 nmIgG1结果说明重组蛋白亚单位疫苗组与G. parasuis-5灭活苗组免疫反应相当。
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A.小鼠二免后血清抗体效价;B、C.小鼠二免后IgG2a OD450 nm与IgG1 OD450 nm检测及其比值。单因素方差分析,Dunnett多重比较检验,****. P < 0.000 1;ns. P>0.05 A. Serum antibody titers after secondary immunization of mice; B, C. Antibody levels of IgG2a and IgG1 their specific value after secondary immunization of mice. One-way ANOVA, Dunnett's multiple comparison test, ****. P < 0.000 1;ns. P > 0.05 图 1 小鼠二免14 d后血清抗体效价及IgG2a OD450 nm与IgG1 OD450 nm的比值 Fig. 1 Serum antibody titer and detection results of IgG2a OD450 nm and IgG1 OD450 nm of mice at 14 days post secondary immunization |
小鼠二免14 d后,无菌收集小鼠脾淋巴细胞,利用cck-8试剂盒检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况,如图 2所示,与未诱导相比,用重组蛋白分别刺激亚单位疫苗组小鼠和空白组小鼠的脾淋巴细胞时均无显著性差异;分别用重组蛋白刺激G. parasuis-5灭活苗组小鼠的脾淋巴细胞时,除rAfuA无显著性差异外,其余重组蛋白均有显著性差异(P < 0.05)。
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单因素方差分析,Dunnett多重比较检验;与uninduced组比较,****.P < 0.000 1;***.P < 0.001;**.P < 0.01;*.P < 0.05;ns.P>0.05 One-way ANOVA, Dunnett's multiple comparison test; Compare with the uninduced group, ****.P < 0.0001;***.P < 0.001;**.P < 0.01;*.P < 0.05;ns.P > 0.05 图 2 二免14 d后小鼠脾淋巴细胞增殖结果 Fig. 2 The results of proliferation of spleen lymphocytes in mice at 14 days after secondary immunity |
小鼠二免14 d后,眼球采血分离外周血单核淋巴细胞,提取RNA,利用SYBR Green实时荧光定量PCR检测小鼠IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ以及TNF-α的水平。如图 3所示,G. parasuis-5灭活苗组小鼠细胞因子的表达无明显差异(P>0.05);IL-2的上调说明HPSNAG-0140(P < 0.05)、HPSNAG-0978(P < 0.001)和AfuA组(P < 0.01)小鼠机体倾向于Th1型反应;IL-10的上调说明AfuA(P < 0.000 1)、HPSNAG-1330(P < 0.001)和CyaY(P < 0.000 1)组小鼠的Th1型反应被抑制;IL-6或TNF-α的上调说明HPSNAG-0978(P < 0.000 1)、HPSNAG-0140(P < 0.01)和Fe3+ABC-tbp(P < 0.05)组小鼠体内有较高的炎性反应。
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单因素方差分析,Dunnett多重比较检验;与灭活苗组(G.parasnis-5)比较,****.P < 0.000 1;***.P < 0.001;**.P < 0.01;*.P < 0.05;ns.P>0.05 One-way ANOVA, Dunnett's multiple comparison test; Compare with the G.parasuis-5 group, ****.P < 0.000 1;***.P < 0.001;**.P < 0.01;*.P < 0.05;ns.P > 0.05 图 3 二免14 d后小鼠细胞因子的检测结果 Fig. 3 Detection results of cytokines in mice at 14 days after secondary immunity |
非免疫攻毒组小鼠第2天全部死亡;G. parasuis-5灭活苗组小鼠在攻毒第7天后有2只小鼠存活(存活率为40%),存活小鼠在第3天恢复正常状态;AfuA组和HPSNAG-0978组的小鼠各存活1只(存活率为20%);CyaY组小鼠7 d后存活率为60%;HPSNAG-1330组小鼠的存活率与CyaY组相同,且HPSNAG-1330组和CyaY组存活的小鼠在攻毒后50 h左右恢复正常状态。在死后的部分小鼠肺中检测到副猪格拉瑟菌的存在(图 5)。
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图 4 攻毒7 d后小鼠的存活率曲线 Fig. 4 Survival curve of mice within 7 days after challenge |
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M. DL2000 DNA marker;1~6. CyaY组;7~12. HPSNAG-1330组;13~18. HPSNAG-0140组;19~24. HPSNAG-0978组;25~30. AfuA组;31~36. Fe3+ABC-tbp组;37~42. G. parasuis组;43~48.攻毒对照组;P. 阳性对照(450 bp);N. 阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-6. CyaY group; 7-12. HPSNAG-1330 group; 13-18. HPSNAG-0140 group; 19-24. HPSNAG-0978 group; 25-30. AfuA group; 31-36. Fe3+ABC-tbp group; 37-42. G. parasuis group; 43-48. Challenge group; P. Positive (450 bp); N. Negative 图 5 攻毒后部分死亡小鼠肺副猪格拉瑟菌的PCR鉴定 Fig. 5 PCR identification of G. parasuis in the lung of mice killed after challenge |
攻毒后, 对小鼠解剖取肺和脾制备病理切片在光学显微镜下观察发现, 非免疫攻毒组小鼠的肺泡结构被破坏,而免疫组肺泡结构较完整,但肺泡壁增厚;从脾病理切片可以观察到非免疫攻毒组小鼠红髓和白髓区域界限不明显,偶见淋巴细胞浸润(图 6)。
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A. 肺病理组织切片;B. 脾病理组织切片;a. CyaY组;b. HPSNAG-1330组;c.HPSNAG-0140组;d.HPSNAG-0978组;e. AfuA组;f. Fe3+ABC-tbp组;g. G. parasuis-5组;h. 空白组;i. 攻毒对照组 A. Pathological changes of lung; B. Pathological changes of spleen; a. CyaY group; b. HPSNAG-1330 group; c. HPSNAG-0140 group; d. HPSNAG-0978 group; e. AfuA group; f. Fe3+ABC-tbp group; g. G. parasuis-5 group; h. blank group; i. Challenge group 图 6 攻毒后不同组小鼠肺、脾的病理变化(HE, 200×) Fig. 6 Pathological changes of lung and spleen of mice in different groups after challenge (HE, 200×) |
随着猪格氏病的流行,新型疫苗的研制至关重要。重组蛋白亚单位疫苗安全性高、可大量生产且成本较低等优点一直备受关注。基于重组亚单位疫苗应用于新型冠状病毒、带状疱疹病毒和G. parasuis等病原体具有良好评估效果的基础上[11, 13-16],本试验通过原核表达的蛋白对小鼠进行免疫攻毒,选择免疫效果较好的重组蛋白,为后期的猪体免疫攻毒保护试验提供基础。
免疫蛋白质组学已成为一种筛选新型疫苗的方法。G. parasuis的膜蛋白和分泌蛋白的蛋白质组学分析已经有相关报道[11, 17-19]。在这项研究中,作者使用质谱技术从标准5型G. parasuis中发现了6个蛋白,即CyaY、AfuA、Fe3+ABC-tbp、HPSNAG-1330、HPSNAG-0140和HPSNAG-0978。尽管本研究所用的方法有局限性,但确实鉴定出了以前免疫蛋白质组学方法未鉴定出的G. parasuis蛋白,例如Fe3+ABC-tbp,并表明其中5种蛋白都能不同程度地保护小鼠免受G. parasuis感染而致死。
其中,CyaY、AfuA和Fe3+ABC-tbp蛋白可以承载或转运铁离子,在细菌感染过程中发挥作用,CyaY为共济失调样蛋白,有研究证明用CyaY重组蛋白免疫豚鼠,可以对G. parasuis攻毒的豚鼠提供较高的保护作用[20];Li等[17]利用表达的AfuA重组蛋白免疫BALB/c小鼠发现它可以为小鼠提供80%的保护率;Fe(3+) ABC transporter substrate-binding protein(Fe3+ABC-tbp)可以与灭活的5型G. parasuis获得的2D1单抗发生特异性反应,用该单抗免疫小鼠后可以抵抗标准5型G. parasuis,由此推测Fe3+ABC-tbp可能具有免疫原性[21]。HPSNAG-1330(outer membrane lipoprotein,OmlA)和HPSNAG-0140(outer membrane protein P2, OmpP2)均为外膜蛋白,有报道证明用OmlA构建的重组蛋白免疫仔猪可以降低1型胸膜肺炎放线杆菌气溶胶攻毒仔猪的死亡率[22-23];HPSNAG-0140具有孔蛋白活性,它是G. parasuis的毒力因子之一,具有黏附猪肺泡巨噬细胞阻止其吞噬的作用[24]。目前,HPSNAG-0978(periplasmic solute binding family protein)蛋白的功能尚不清楚。
有研究表明,IgG的亚型和Th免疫应答的类型对于某些疾病的保护性免疫是重要的[25]。IgG1亚类的产生代表辅助性Th2免疫反应,而IgG2a是Th1免疫反应的标志。在这项研究中,作者发现G. parasuis的6个重组蛋白与灭活苗可以诱导IgG1和IgG2a两个亚类的产生,OD450 nm IgG2a/OD450 nm IgG1结果说明重组蛋白亚单位疫苗组与灭活苗组免疫反应相当,对Th1/ Th2的平衡发挥一定的作用。经过两次免疫后,小鼠血清效价能达到1:6 400,这说明重组蛋白亚单位疫苗组与灭活苗组均能够诱导机体产生体液免疫反应。
脾是抗原进入机体激活先天和适应性免疫反应的器官,含有大量的B、T淋巴细胞和巨噬细胞,脾淋巴细胞增殖的能力反映了脾淋巴细胞的数目和免疫反应的情况[26]。本试验中重组蛋白亚单位疫苗组淋巴细胞OD450 nm值虽然升高,但与未诱导相比差异并不显著,而在灭活苗组中,除AfuA外,其他重组蛋白与未诱导相比差异显著,这恰与OD450 nm IgG2a/OD450 nm IgG1结果相似,在OD450 nm IgG2a/OD450 nm IgG1的结果中,灭活苗组的Th2型上调,而AfuA的Th1/Th2的比值接近1。
细胞因子在抵抗病原体感染方面发挥重要作用[27]。为了进一步验证免疫反应的类型,检测了细胞因子的水平。IL-2和IFN-γ由Th1细胞分泌,IL-10由Th2细胞分泌,而IL-6、TNF-α的表达反映炎性反应的高低[28-33]。从细胞因子的表达水平结果分析发现,HPSNAG-0978、HPSNAG-0140和AfuA可以刺激小鼠机体IL-2显著上调, 但IFN-γ变化不显著,这说明HPSNAG-0978、HPSNAG-0140和AfuA可以诱导小鼠机体Th1型免疫应答,而CyaY、HPSNAG-1330和AfuA的IL-10显著上调,这说明CyaY、HPSNAG-1330和AfuA可以诱导小鼠机体Th2型免疫应答,HPSNAG-0140、HPSNAG-0978和Fe3+ABC-tbp的IL-6或TNF-α显著上调,这说明HPSNAG-0140、HPSNAG-0978和Fe3+ABC-tbp可以刺激小鼠产生较高的炎性反应,这可能也是导致这三组小鼠存活率低的原因。以上的结果说明CyaY、HPSNAG-1330更倾向于诱导机体产生体液免疫反应,而AfuA的IL-2和IL-10显著上调,说明AfuA更有利于平衡Th1/ Th2反应,这与OD450 nm IgG2a/OD450 nm IgG1显示的结果一致,虽然OD450 nm IgG2a/OD450 nm IgG1的结果差异不显著,但最后的存活率显示AfuA组存活率仅为20%。分析原因,可能是因为疫苗的保护效果受到多种因素的影响,抗原的剂量、抗原与佐剂的比例和佐剂的类型可能对免疫效果有一定的影响,后期的试验可以通过优化条件以期达到更好的保护效果。
4 结论本试验在小鼠模型中筛选的CyaY和HPSNAG-1330在抵抗副猪格拉瑟菌Nakasaki菌株时可以提供较高的保护作用,这为后期实验室筛选副猪格拉瑟菌复合重组蛋白亚单位疫苗提供新的参考。
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(编辑 白永平)