2. 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州 730046
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, OIE/National Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China
口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)引起的猪、牛、羊等偶蹄动物易感的一种急性、热性、高度接触性传染病[1],被感染动物多以在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡性疹为主要临床特征,该病传播途径多、速度快,每次暴发均给当地的畜牧养殖业造成巨大经济损失[2]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的传染病,中国也将其列在一类动物传染病的首位[3]。口蹄疫病毒在全世界主要有7个血清型:O、A、亚洲1、C型及南非1、2、3型,疫苗免疫不能使各型之间交叉保护。现阶段中国主要针对O、A和亚洲1型口蹄疫病毒进行疫苗接种[4]。
1986年,Hambin等[5]以VNT和液相ELISA试验原理建立了用于检测FMDV抗体的液相阻断ELISA(liquid phase blocking ELISA, LPBE),由于在液相状态下,病毒抗原的中和表位完全处于自然状态,能与血清中的抗体进行充分的反应,因而LPBE具有更好的重复性和可靠性[6-7]。液相阻断ELISA检测口蹄疫病毒抗体是世界动物卫生组织(OIE)和国际贸易中指定的参考方法,也是中国用于口蹄疫病毒疫苗免疫效果评价及流行病学调查的推荐方法[8]。世界口蹄疫参考实验室(Pirbright Laboratory)及国内外口蹄疫参考实验室推荐的口蹄疫病毒液相阻断ELISA抗体检测试剂盒虽然具有灵敏、准确等优点,但均存在试验操作繁琐、用时长、不易保存等问题,极大地影响了操作人员的愉悦感,给产品的推广及使用都带来了不便,尤其是在缺乏专业技术人员的企业中的推广阻力较大,操作过程中容易出错,抗原保存不稳定导致试剂盒的保存稳定性差[9-10]。解决这些根本问题的关键是要对操作体系和反应过程进行理论和实践结合的创新。
为了在试验中节省时间,可以从提高反应的灵敏度开始。目前,研究人员在检测方法中已经使用了多种发光或荧光材料来提高灵敏度[11-15],但这些材料主要是光敏材料,并且操作过程需要避光才能完成,造成许多不便。链霉亲和素(streptavidin, SA)可以标记半抗原、抗原、抗体、辣根过氧化物酶(HRP)或发光材料[16],它可以结合四个生物素分子,使更多的HRP酶分子能够催化底物反应,从而改善免疫分析中的信号传递[17]。特别是在小分子检测方面,基于SA-生物素扩增系统的ELISA在分析真菌毒素和兽药残留方面表现出比传统ELISA更高的灵敏度和准确性[18]。新操作程序和试剂盒生产工艺的改进应提高试剂盒操作的便利性以及试剂盒保存的稳定性和检测性,以确保经典方法的原始灵敏度和特异性。
本研究利用SA和生物素的高亲和力,建立了更快捷的LPBE检测方法。如图 1所示,作者将SA标记抗体,使SA-HRP更易被捕获,整体提升了LPBE的灵敏度,进而减少了反应所需时间。结果表明,SA-LPBE在实现更快速检测的同时,还保持了传统LPBE的准确性。因此该项工作为口蹄疫的诊断与防控提供了快速简便的免疫学检测方法。
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图 1 SA-LPBE检测示意 Fig. 1 Schematic illustration of SA-LPBE for detection |
来源于牛的O型口蹄疫抗体阳性标准血清:使用口蹄疫灭活疫苗对牛进行免疫,首次免疫后第30天加强免疫一次,二免2周后采血以获得高免血清。经口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(兰州兽医研究所)测定为阳性。以此血清抗体效价结果为参照,依次确定各试剂的工作浓度。
口蹄疫抗体阴性血清:从未接触口蹄疫疫苗的临床健康猪和牛中各自分别采集15份血清,这些血清使用O-LPBE和A-LPBE测试,结果均为阴性,滴度<1∶4。
来源于不同动物的O型口蹄疫抗体阳性血清:采自由灭活疫苗免疫动物的血清共60份(牛20份,羊20份,猪20份),经O-LPBE测试结果为阳性。
30份田间牛血清,30份田间羊血清,30份田间猪血清,这些血清用于评估诊断性能并比较与O-LPBE的符合率。
1份亚洲1型口蹄疫灭活疫苗免疫牛的血清,1份A型口蹄疫灭活疫苗免疫牛的血清,这些血清用于与O-LPBE原来的操作方法作平行检测。
1.2 实验动物2.0 kg左右的健康新西兰大白兔和200 g左右的健康豚鼠,购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。
1.3 FMDV抗原浓缩及冻干将适量体积的口蹄疫病毒灭活疫苗(O/Mya98株)加入8%PEG6000、4%NaCl,4 ℃搅拌4 h后4~8 ℃静置过夜,500 mL离心管6 000 r·min-1离心60 min弃去上清,继续加入未离心抗原进行离心,抗原量大时重复以上操作,最后用pH7.6的0.01 mol·L-1 PBS悬浮离心管内的抗原沉淀,定容至原抗原体积的1/50, 加入对等体积预冷的三氯乙烯进行乳化并离心脱脂,吸取抗原层液体,加入5%海藻糖,0.01%Proclin300防腐剂,分装冻干,贴签,于4 ℃保存。
1.4 FMDV 146S抗原制备取适量浓缩冻干后的抗原液融于PBS中,45 000 r·min-1, 4 ℃超速离心1 h,将离心管底壁的沉淀用PBS重悬至2 mL,经蔗糖密度梯度(45%、35%、25%、15%)35 000 r·min-1离心2.5 h,按0.5 mL取样并合并同一级峰,并经260 nm紫外分光光度仪检测,收集含口蹄疫病毒完整病毒粒子146S抗原的吸收峰(第二峰)并合并。
1.5 抗口蹄疫病毒血清制备将纯化的146S抗原与等量的完全弗氏佐剂乳化后对新西兰大白兔和豚鼠进行免疫以分别制备抗口蹄疫病毒血清,兔的免疫方式为背部两侧皮下多点注射,每只60 μg。豚鼠采用腹股沟内皮下注射,每只30 μg,均于免疫后第30天采血并分离血清,分装后于-70 ℃冻存。
1.6 O型豚鼠抗口蹄疫病毒血清IgG纯化及生物素化标记免疫制备的O型豚鼠抗口蹄疫病毒血清使用Protein A亲和层析纯化,获得豚鼠血清IgG。将豚抗IgG用0.1 mol·L-1碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)稀释至1 mg·mL-1,每次标记量为1~2.5 mL,在透析袋内互作,将待生物素化的豚抗IgG加入透析袋(MW CO 8000)置于0.1 mol·L-1碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)充分透析;每毫克蛋白加入120 μL浓度为1 mg·mL-1的NHSB(N-羟基琥珀酰亚胺生物素)溶液(即用1 mL DMSO溶解1 mg NHSB),室温下搅拌2~4 h,加入9.6 μL 1 mol·L-1 NH4Cl (每25 μg NHSB加1 μL),在室温下搅拌10 min。用pH 7.2的0.01 mol·L-1缓冲体系除去游离的生物素,吸取袋内标记物,加入50%甘油,0.01%Proclin300, 分装,-70 ℃冻存。
1.7 建立SA-LPBE检测方法用兰州兽医研究所提供的商品化口蹄疫O型FMDV液相阻断ELISA检测试剂盒对兔抗口蹄疫病毒血清测定。同时设置O型FMDV阳性血清对照、A型及亚洲1型FMDV高免血清对照。
使用PBS将兔抗血清稀释,以不同浓度(1∶50~ 1∶400)每孔50 μL加入96孔ELISA板中。封板膜封板,4 ℃过夜。使用PBST洗涤ELISA板5次并拍干待用。在U型孔底的载体反应板上,将FMD阴性(N)、阳性(P)血清使用PBST进行连续稀释(1∶2~1∶32),每孔60 μL,紧接着所有孔内加入60 μL不同稀释浓度(1∶50~1∶400)的O型口蹄疫病毒抗原,每块反应板均设置至少4孔病毒抗原对照,最终ELISA反应板内液体量均为120 μL ·孔-1,封板膜封板,震荡,37 ℃孵育90 min。将U型板中100 μL作用充分的抗原抗体混合物移置ELISA兔抗口蹄疫血清包被板上,37 ℃孵育10~60 min。使用PBST洗板5次并拍干,加入豚抗IgG-生物素抗体工作液,100 μL·孔-1,37 ℃孵育10~60 min。同上洗板并拍干,加入酶标链霉亲和素(HRP-SA)工作液,100 μL ·孔-1,37 ℃孵育10~60 min。同上洗板5次,拍干后加入TMB底物溶液,50 μL ·孔-1,37 ℃孵育15 min后再每孔加入50 μL的1.25% H2SO4终止反应,酶标仪450 nm波长下读取吸光值。
1.8 最佳反应时间的优化使用标准阳性血清、阴性血清确定最佳反应时间,其中,标准血清与商用试剂盒采用相同稀释度,n=5,对各反应条件下的标准阳性阻断率进行对比分析,取阻断率最大的稀释度为最佳反应条件。
阻断率=1-样品或标准阳性血清OD值/标准阴性血清OD值
1.9 SA-LPBE临界值的确定以病毒抗原的OD平均值的50%作为病毒抗原被阻断50%的临界值。将阴性、阳性对照血清和被检血清相应孔的OD值与临界值相比较,血清抗体效价即为该份血清稀释孔OD值略高于临界值与略低于临界值孔对应的抗体滴度的平均值。
用原LPBE试剂盒的方法确认了20份牛FMDV抗体阳性血清、45份牛FMDV抗体阴性血清、20份羊抗体阳性血清、20份猪FMDV抗体阳性血清和15份猪FMDV抗体阴性血清,使用本研究中开发的SA-LPBE测试了这些血清样品。当特异性和灵敏度的百分比通过接收器操作特征曲线(ROC)分析达到最大值时,确定临界值。
1.10 符合性分析O型FMDV灭活抗原免疫动物血清60份(牛20份、羊20份、猪20份),亚洲1型FMDV灭活免疫牛血清1份,A型FMDV灭活抗原免疫牛血清1份。它与LPBE试剂盒的原始操作方法并行进行测试。
1.11 重复性试验重复性试验包括批间重复试验和批内重复试验,以评估改进LPBE方法的重现性。使用不同批次包被的ELISA板做批间重复试验,同批次不同ELISA板做批内重复试验。并计算批间和批内的变异系数(CV)。
2 结果 2.1 豚鼠和兔抗口蹄疫病毒血清IgG纯化对纯化的抗FMDV多克隆血清进行SDS-PAGE分析。结果如图 2所示,纯化的多克隆血清主要有两条带,一条重链45 ku,一条轻链25 ku。图 2条带中1和3分别为兔和豚鼠未纯化的多克隆血清,2和4为对应纯化后的条带。
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M. 蛋白质相对分子质量标准;1. 兔抗血清;2. 纯化后的兔抗血清;3. 豚鼠抗血清;4. 纯化后的豚鼠抗血清 M. Protein marker; 1. Rabbit anti-FMDV serum; 2. The purified of the rabbit serum; 3. Guinea pig anti-FMDV serum; 4. The purified of the guinea pig serum 图 2 电泳分析多克隆血清IgG纯化结果 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified serum polyclonal IgG |
O型口蹄疫阳性血清抗体效价经液相阻断ELISA方法检测确定为720(512~1 024),作为SA-LPBE的阳性对照血清,其抗体效价同样控制在720(512~1 024),此时反应条件如表 1所示。优化各组分的浓度。在SA-LPBE中,兔抗146S血清的工作稀释度为1∶1 000,病毒抗原稀释度为1∶1 000,生物素标记豚鼠抗146S血清的稀释度为1∶1 000,HRP-SA稀释浓度为1∶1 000。
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表 1 SA-LPBE各反应时间阻断率统计表结果 Table 1 The statistics of standard positive serum PI of different reaction conditions |
依照商业LPBE工艺方法,使用标准阳性血清、阴性血清计算阻断率将各反应时间优化,阻断率越大,为最佳反应时间。如表 1所示,移板后反应时间选取30 min,抗血清反应时间选取30 min, HRP反应时间选取10 min,优化后的SA-LPBE工艺方法路线如图 1和图 3所示,反应时间明显缩短。此反应条件下,测定的FMDV A型和亚洲1型高免阳性血清抗体滴度均不超过64, 4孔病毒抗原OD值为1.0~2.0。
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图 3 SA-LPBE操作方法流程图 Fig. 3 SA-LPBE operation method flowchart |
使用SA-LPBE共测试分析了191份牛(30份阳性血清,101份阴性血清)、羊(22份阳性血清,38份阴性血清)血清样品。结果如图 4a所示,当临界值为96时,特异性值和敏感性值分别为97.84%和100%,当临界值为192时,特异性值和敏感性值分别为100%和96.15%,ROC曲线下面积为0.999(标准差=0.000 49,95%,0.998 6~1.000 5),因此结合实际情况,判断优化后的牛羊血清抗体效价≥128时,为抗体阳性,与原商用试剂盒相同。
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a. 牛、羊SA-LPBE样本(0.阴性血清样本, n = 139;1.阳性血清样本, n = 52), ROC曲线上的每个点代表一个敏感性-特异性对;b.猪样本(0.阴性血清样本,n=90;1.阳性血清样本,n=61); AUC.曲线下的面积 a. Cattle and sheep samples in SA-LPBE (0. Negative serum samples, n = 139; 1. Positive serum samples, n = 52), each point on the ROC curve represents a sensitivity-specificity pair; b. Swine samples (0.Negative serum samples, n=90; 1.Positive serum samples, n=61); AUC. Area under the curve 图 4 采用交互点图和ROC分析确定SA-LPBE的临界值 Fig. 4 Interactive dot diagram and ROC analysis for the determination of the cutoff value of SA-LPBE |
使用SA-LPBE共测试分析了猪61份阳性血清样本,90份阴性血清样本,结果如图 4b显示,当临界值为64时,特异性值和敏感性值均为100%,故猪血清抗体效价≥64时,判断为阳性,与商用试剂盒结果相同。
2.5 符合性试验使用92份血清评估SA-LPBE与原方法的一致性,结果如表 2所示,在60份免疫过灭活疫苗的猪、牛、羊血清中,只有一份牛血清样本与原方法结果不一致。在标准阴性血清中,只有一份牛阴性血清与原方法不一致。其余样本均符合。在田间的90份样品中,有5份样品与原LPBE方法结果不同,整体符合率为92.3%。并且使用SA-LPBE与原方法对免疫后动物血清阻断值作图比较,差异较小,详见图 5。
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表 2 SA-LPBE与原LPBE方法符合率分析 Table 2 Complicity rate analysis of SA-LPBE and the original LPBE method |
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图 5 SA-LPBE与原方法LPBE对免疫后动物血清符合率评价 Fig. 5 Evaluation of the serum compliance rate of SA-LPBE and the original method LPBE for post-immune animals |
各检测6种血清样本,如表 3所示,SA-LPBE批内变异系数均<5%,批间变异系数均<10%,表明所建立的方法重复性良好。
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表 3 SA-LPBE批内、批间重复性测试 Table 3 Intra-, inter-batch reproducibility test of SA-LPBE |
OIE推荐的FMDV检测方法包括病毒分离、核酸检测、补体结合试验和间接夹心ELISA。病毒分离是检测口蹄疫病毒的金标准。但病毒分离耗时长、难度大、需要实验室专业人员操作,且分离效果取决于样本质量,因此其应用受到限制。补体结合试验可以作为病原体的检测方法。这是最早用于病毒血清型鉴定的方法。然而,该方法仅适用于检测水泡上皮和新鲜的水泡样本;对样本的质量要求相对较高[9]。核酸检测方法发展得多种多样,如RT-PCR、RT-LAMP、RPA等[9]。该技术具有高灵敏度和快速性,但对操作人员,操作环境要求较高,易污染[19-21]。ELISA是1972年用于定量和定性分析的方法,是放射免疫分析技术的改进版本[22-23]。ELISA是检测口蹄疫病毒最常用的方法之一[9]。最初,人们使用ELISA方法来鉴定病毒血清型。后来利用该技术进行抗原表位的分析和突变株分离[5, 24-25]。LPBE是国际公认的标准化诊断方法。该方法可用于检测FMDV感染,并可用于检测动物免疫状态和疫苗耐药性的评估。由于LPBE测定抗体是直接用最自然的146 S时的抗原构象,因此其重现性更好,结果更准确,但这种方法耗时长,限制了其在检测中的应用[26]。
生物素与SA的结合是自然界已知的最有效的非共价相互作用之一[27]。生物素-SA复合物能够抵抗恶劣环境,如有机溶剂、蛋白水解酶以及极端温度和pH[28]。因此,该系统可广泛应用于分子生物学和生物纳米技术。在免疫检测系统中,链霉亲和素通常直接固定在传感器芯片、磁珠、电极等上。然而,这些方法通常需要高质量的材料和仪器。SA与生物素的结合在某些ELISA检测应用中表现出潜力。Yang等[29]开发了一种新的竞争性夹心免疫分析方法,使用改良的生物素-链霉亲和素系统与多聚赖氨酸耦合,灵敏准确地检测组胺。Yan等[30]通过使用生物素化纳米体Nb26和链霉亲和素共轭聚合过氧化辣根(SA-PolyHRP),开发了一种生物素-链霉亲和力放大ELISA,用于灵敏快速检测谷物中的黄曲霉毒素B1(AFB1)。
为了快速、经济、准确地检测FMDV,作者选择用生物素修饰一级抗体(图 1)。它在LPBE检测方法中发挥了优势。SA的高结合性能,使原来与IgG结合反应时间为1 h缩短为10 min,并且使移板反应时间和抗血清反应时间缩短为原来的一半,从而大大减少了LPBE的操作时间,经过田间采集血清及标准血清的测试,该方法有较高的符合率。并且生物素标记抗体标记原料稳定、检测背景值低,使其具有较高的经济实用优点,并且还解决了猪血清中检测容易发生的倒置现象,避免了对试验结果抗体效价的误判。
本研究的SA-LPBE试剂盒率先突破了LPBE试剂盒的原理。克服LPBE原始方法的高昂成本,且易导致人员测试失败的缺点。保持经典技术固有的敏感性和特异性,提高产品的稳定性,使FMDV LPBE试剂盒的操作和生产过程更加完善。
本研究的创造性方案解决了FMDV LPBE抗体检测试剂盒的操作步骤多、稳定性差、易腐蚀以及猪血样本清洗等问题。建立的SA-ELISA方法使试剂盒操作方便、省时、易于生产,保持了灵敏度、特异性,并简化了经典工艺的使用周期,从而提高了产品质量,提高了经济效益,降低了成本和试剂盒操作员的工作负担,增加了使用者的乐趣,这有利于扩展FMDV SA-ELISA试剂盒推广应用。
4 结论基于生物素标记抗体技术和HRP-SA,建立了一种新的快速检测口蹄疫病毒抗体的ELISA方法(SA-ELISA)。该方法适用于FMDV免疫抗体监测、疫苗免疫效果评估、流行病学调查和免疫指导的持续技术支持。
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(编辑 白永平)