赖氨酸是玉米-豆粕型饲粮第一限制性氨基酸,也是产毛动物的第二限制性氨基酸。相关研究发现,赖氨酸参与体内蛋白质合成、促进生酮、脂类代谢[1]等生理作用,还与增强免疫、促进动物生长、提高母畜繁殖性能[2-4]等密切相关,其在畜禽实际生产中发挥着巨大作用。研究发现,赖氨酸与其他氨基酸互作可明显改善毛皮动物生产性能。一定比例赖氨酸与含硫氨基酸协同促进獭兔毛囊密度显著提高,当赖氨酸含量为0.8%、含硫氨基酸为0.64%时被毛发育最好[5],而赖氨酸与蛋氨酸相互作用对改善蓝狐毛皮质量效果显著[6]。单独赖氨酸缺乏会导致彩羽鸡毛色暗淡[7]。在兔生产中研究发现,赖氨酸对于采毛后安哥拉兔毛和体重恢复具有积极作用。毛囊的周期性发育经历生长期、退行期和静止期3个阶段,每个阶段的发育会受到各种信号通路的调控。已知的调控毛囊生长发育的信号通路和因子有Wnt/β-连环蛋白信号通路(Wnt/β-catenin),成纤维生长因子(FGF)信号通路,雷帕霉素靶蛋白信号通路(mTOR),胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ),角蛋白相关蛋白(Kap)以及转化生长因子(TGF)等。Wnt/β-catenin信号通路在毛囊细胞的分化中主要起促进毛干生长的作用,在小鼠上的研究发现,Wnt10b能够诱导毛囊周期性再生[8];FGF5在大鼠和小鼠中是唯一与毛长有关的基因[9];外源性IGF-Ⅰ能显著促进体外培养的毛囊的生长[10],TGF-β被认为是一种重要的毛囊退化期的启动因子;由此可见,赖氨酸在动物毛发生长方面发挥重要功能,但赖氨酸对毛用动物的产毛量及毛品质相关研究较少,对安哥拉兔毛品质和产毛量影响尚不清晰。本试验旨在通过安哥拉兔饲粮中添加不同水平的赖氨酸,探索其对产毛性能、毛囊发育及相关基因表达的影响,以确定安哥拉兔最适赖氨酸饲粮添加量,并探讨了赖氨酸影响毛囊发育的有关通路。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验选取10月龄已剪完毛的安哥拉兔160只,随机分为4组,每组40只,各组间初始体重和产毛量无显著差异(P>0.05)。其中对照组饲喂基础饲粮(赖氨酸含量为0.43%),根据先前研究结论[5],本试验组在饲粮中分别额外添加0.25%、0.35%、0.45%的赖氨酸。基础饲粮参照De Blas和Mateos[11]推荐的兔营养需要量配制,基础饲粮及营养成分见表 1。饲养期间各试验兔单笼饲养,自由采食,充足饮水,按程序免疫接种。试验预饲5 d,正式试验期65 d。
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表 1 基础饲粮组成和营养水平(风干基础) Table 1 Basic diet composition and nutritional value (air-dried basis) |
试验结束后每组随机选取8只试验兔采集兔毛样品和皮肤样品。分别采集肩部、背部及臀部兔毛样品用于兔毛品质的测定。采集背部2 cm×2 cm皮肤2份,一份置于多聚甲醛中固定,用于毛囊密度测定;另一份冷冻保存,用于毛囊发育相关基因的测定。
1.2.1 产毛量的测定 饲养试验开始前对所有试验兔剪毛处理,试验结束后再次剪毛,根据剪毛前后体重差值测定产毛量,并计算平均日采食量和料毛比,产毛率等指标。
平均日采食量(g·d-1) =饲养试验期间每只试验兔的总采食量/试验天数
料毛比=饲养试验期间每只试验兔的总采食量/饲养试验期间每只试验兔的产毛量
产毛率(%) =产毛量/体重
1.2.2 兔毛品质的测定 试验毛兔在剪毛前保定,用软尺测量其肩部毛丛长度并记录。采集不同安哥拉兔同一部位的肩部、背部、臀部3个部位兔毛样品。粗毛率及兔毛平均细度使用电子纤维细度检测仪测定,每份兔毛样品随机测试200根。兔毛平均伸长率及兔毛平均断裂强度使用南通宏达YG005 N+型电子单纤维强力拉伸仪,随机测量200根。
1.2.3 毛囊密度的测定 取出多聚甲醛中固定的样品,经过冲水、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋等处理后,进行HE染色并制作石蜡切片。详细步骤参考王童童[12]的方法。
1.2.4 基因表达的测定 将超低温冰箱中保存待检测样品取出后。使用TRIzol法提取组织中的总RNA,然后再将其反转录为cDNA,再进行实时荧光定量的测定毛囊发育相关基因的表达量。具体方法参照Roche反转录试剂盒以及诺唯赞荧光定量试剂盒说明书进行。相关引物序列参考Yue等[13]。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因,检测Wnt10b、β-catenin、TGF-β1、TGF-β2、BMP2、BMP4、Kap3.1、Kap6.1、mTOR和p70s6k,使用2-ΔΔCt法进行计算,最终得出目的基因的表达量。
1.3 数据统计分析本试验的所有数据均采用Excel进行数据预处理,数据采用IBM SPSS satistics 21统计软件Tukey算法进行数据差异性分析。P<0.05时差异显著,P>0.05时无显著差异。
2 结果 2.1 饲粮添加赖氨酸对安哥拉兔产毛性能的影响饲粮中添加赖氨酸对安哥拉兔的产毛量、产毛率、料毛比具有显著影响(P<0.05)。随着赖氨酸添加量增加,产毛量、产毛率先增加后下降,而料毛比先下降后升高,在赖氨酸添加水平为0.25%时达到最高值。饲粮中添加赖氨酸对安哥拉兔的平均日采食量无显著影响(P>0.05)
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表 2 饲粮添加赖氨酸对安哥拉兔产毛性能的影响 Table 2 Effects of dietary Lys level on hair production of Angora rabbits |
饲粮中添加赖氨酸对安哥拉兔兔毛的粗毛率和纤维细度具有显著影响(P<0.05),随着赖氨酸添加量增加,粗毛率和纤维细度不断增加。饲粮中添加赖氨酸对断裂强度、伸长率、毛丛长度无显著影响(P>0.05)。
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表 3 饲粮中添加赖氨酸对安哥拉兔毛品质的影响 Table 3 Effects of dietary Lys level on the hair quality of Angora rabbits |
日粮中添加赖氨酸对安哥拉兔的总毛囊密度、初级毛囊密度、次级毛囊密度和初次比均有显著影响(P<0.05)。随着赖氨酸添加量增加,总毛囊密度与次级毛囊密度先升高后下降,在添加量为0.25%时达到最高值;而初级毛囊密度和初次比则不断升高。
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表 4 饲粮中添加赖氨酸对安哥拉兔毛囊密度的影响 Table 4 Effects of dietary Lys level on hair follicle density in Angora rabbits |
日粮中添加赖氨酸对安哥拉兔的Wnt10b、β-catenin、TGF-β1、Kap6.1、mTOR、p70s6k具有显著影响(P<0.05)。其中Wnt10b、β-catenin、Kap6.1在皮肤中的表达量先升高后下降。TGF-β1在皮肤中的表达量先下降后升高。mTOR、p70s6k在皮肤中的表达量不断下降。对TGF-β2、BMP2、BMP4、Kap3.1无显著性影响(P>0.05)。
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表 5 饲粮中添加赖氨酸对安哥拉兔毛囊发育相关基因表达的影响 Table 5 Effects of dietary Lys level on gene expression related to hair follicles developments in Angora rabbits |
赖氨酸是安哥拉兔生长发育必需氨基酸之一,并且也是毛皮动物的第二限制性氨基酸,无法自身合成,只可通过饲粮获取,相关研究认为,赖氨酸对机体蛋白转化以及采毛后机体恢复具有重要作用,但过量赖氨酸会对安哥拉兔生产性能产生严重影响。总结前人研究发现,日粮中添加赖氨酸能够提高生长肉兔的生产性能[14],赖氨酸及蛋氨酸互作可明显影响水貂皮张延展度和毛皮质量[15]。本研究发现,当日粮中赖氨酸水平达到0.7%(即额外添加0.25%)时安哥拉兔平均产毛量、产毛率最高,料毛比最低,而日粮更高浓度的赖氨酸产生的作用减弱,这说明适量赖氨酸对产毛性能的提高才能发挥重要作用,过量赖氨酸对安哥拉兔产毛性能的促进作用不明显。
兔毛制品中,细软兔毛精纺加工后柔软光洁,亲肤性极佳,而纤维直径较粗的毛纤维对提高纺织品面料强度及抗风性上发挥重要作用。李志琼等[16]研究发现,饲粮中适宜浓度赖氨酸饲喂下雄性雉鸡羽毛鲜艳,而低水平赖氨酸组雄性雉鸡羽毛暗淡,个别出现飞羽白化现象。本试验发现赖氨酸对安哥拉兔纤维细度有显著影响,单独添加赖氨酸对安哥拉兔毛品质发挥积极作用,在本试验看来,添加赖氨酸后产毛量的提升可能是由于粗毛率的提升。
皮肤毛囊密度与最终个体产毛量及毛品质有直接关联性,总毛囊密度增多,亚器官层面反应安哥拉兔产毛水平提高。初级毛囊密度增多会引起兔毛中粗毛增加,而次级毛囊密度则与兔毛纤维细度有相关性。窦全林和陈刚[17]报道,氨基酸供给量对次级羊毛生长具有重要作用。本试验研究发现,饲粮中额外添加0.25%赖氨酸,总毛囊密度和次级毛囊密度达到最高,这与产毛量数据相对应。随着赖氨酸浓度不断增加,初级毛囊密度不断增加。暗示高剂量赖氨酸浓度能够促进初级毛囊发育,而次级毛囊在低浓度赖氨酸是发育加快,当满足机体需求时,次级毛囊的发育对赖氨酸浓度增加不再响应。
毛囊发育各个阶段不断受各种分子信号调控,以此来促进或抑制毛囊某阶段的缩短或延长。Wnt10b是Wnt蛋白家族中对毛囊发育有影响的因子,其含量增加可促进毛囊再次进入生长期[18]。Wnt蛋白与β-catenin蛋白同其他细胞信号分子共同调控毛囊相关细胞增殖分化并干预皮肤相关器官的生长[19]。本试验发现,当日粮中赖氨酸水平达到0.7%(即额外添加0.25%)时,Wnt10b与β-catenin基因表达量达到最高,说明赖氨酸可能调控Wnt10b/β-catenin信号通路影响皮肤毛囊发育,进而影响产毛。除了促进发育因子外,还有一部分抑制因子调控毛囊发育。刘公言等[20]提出,TGF-β1能够控制小鼠毛囊从生长期向衰退期的转变,高TGF-β1表达影响减少毛囊数量。Foitzik等[21]研究表明,通过注射TGF-β2重组蛋白可使毛囊提前进入生长期。BMP2、BMP4也能抑制毛囊再生,二者是毛囊发育抑制因子。本试验发现,当日粮中赖氨酸水平达到0.8%(即额外添加0.35%)时,TGF-β1基因表达量最低。说明适量赖氨酸可能通过抑制毛囊发育的抑制因子TGF-β1基因表达,促进毛囊发育。在哺乳动物中,角蛋白和角蛋白相关蛋白占毛纤维总重的65%~95%,是组成毛纤维的骨架。张亚妮等[22]研究认为,Kap6.1与羊毛细度有明显正相关性,该基因可作为筛选高产绒性状的筛选基因。不同哺乳动物间,Kap6.1基因同源性较高,为检测安哥拉兔产绒毛特性,可将Kap6.1作为观测基因。本试验发现,饲粮添加0.35%赖氨酸时,皮肤中Kap6.1基因表达量最高。说明适量赖氨酸可能调节该基因转录,进而影响毛囊密度。mTOR1型复合体促进蛋白质生成。其可通过磷酸化的方式激活该信号通路重要信号枢纽p70s6k。p70s6k具有激活真核翻译起始因子(eIF4B),激活核糖体内多肽翻译的功能[23]。并且p70s6k是磷酸化s6核糖体亚基,激活核糖体的直接信号分子[24],其功能均与蛋白质转录有直接关系。本试验发现,饲粮添加赖氨酸时,皮肤中mTOR和p70s6k基因表达量降低,这与先前的研究结果不一致。Liu等[25]发现:家兔日粮中缺乏赖氨酸可显著降低骨骼肌中mTOR和p70s6k基因和蛋白表达,这说明兔不同组织中mTOR/p70s6k通路对赖氨酸的相应不同,赖氨酸对mTOR/p70s6k通路的调节具有组织特异性。
4 结论饲粮中添加赖氨酸可明显改善安哥拉兔生产性能。当饲粮中额外添加0.25%赖氨酸即总赖氨酸浓度为0.7%时,安哥拉兔产毛性能达到最优。饲粮中添加赖氨酸能促进长毛兔皮肤毛囊发育,Wnt10b/β-catenin、TGF-β和Kap信号通路可能参与此调节过程。
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(编辑 范子娟)