在精子的低温保存过程中，氧化应激是造成精子质量降低的关键因素^[6-7]。随着保存时间的延长，精子内活性氧(reactive oxygen species，ROS)持续累积^[8]，诱发氧化应激与质膜脂质过氧化^[9]，降低精子质膜完整性^[10]，致使精子中的线粒体损伤^[11]和ATP水平降低^[12]，进而导致精子活力下降。烟酸(nicotinic acid，NA)又称维生素B₃，具有强大的抗氧化能力^[13]。有研究表明其可在人肺微血管内皮细胞中降低LPS造成的ROS累积^[14]，具有降低脂质过氧化保护细胞膜的作用^[15]。NA也被应用于人^[16]、猪^[17]、马^[18]等物种的精液冷冻保存，可有效提高精子解冻复苏后的活力水平。但是，关于NA在绵羊精子低温保存过程中的效果以及其作用机理仍不清楚。

因此，本研究拟探讨绵羊精子低温保存条件下(4 ℃)，稀释液中添加不同浓度NA对精子活力、运动性能、质膜完整性的保护作用，并阐明精子中ROS水平、H₂O₂含量、抗氧化因子活性水平、线粒体功能以及ATP水平的变化规律，旨在为明确NA在绵羊精子低温保存过程中的保护效果及作用机理提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 精液的采集

选择膘情良好、无繁殖系统疾病的2~3岁健康德国肉用美利奴种公羊6只，每日提供标准全价精饲料0.7 kg，自由饮水。采用假阴道法采集公羊精液后，现场进行外观初评，选取乳白色、云雾状的精液，以配置好的低温稀释液稀释后，水浴缓慢降温至4 ℃，带回实验室检测精子活力，选取精子活力在90%以上的精子样本用于后续试验研究。

1.2 主要试剂

果糖购自上海源叶生物公司；葡萄糖购自天津恒兴试剂公司；烟酸购自上海九鼎化学公司；柠檬酸钠购自天津福辰化学公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、BSA购自美国Sigma公司；PBS购自美国CORNING公司；ATP生物发光法检测试剂盒购自瑞士Roche公司；其余检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所

1.3 精液稀释液配制

使用电子天平精确称取1.5 g柠檬酸钠、0.75 g果糖、0.75 g葡萄糖、5 000 IU青霉素、5 mg链霉素溶解于50 mL灭菌的超纯水中，作为基础稀释液。根据前期研究结果与相关文献报道^[19]，基础稀释液中添加10%BSA作为对照组，基础稀释液中分别添加5、10、20 mmol ·L^-1的NA作为处理组。将绵羊精子密度调整至5×10⁸个·mL^-1，在4 ℃条件下保存144 h，每间隔24 h摇动精液防止沉淀造成精子损伤。

1.4 精子质量检测

将待测样品取出，37 ℃水浴5 min，置于37 ℃温控板上，使用SCA全自动精子质量分析仪(Sperm Class Analyzer)，选择绵羊专用检测模块分析精子活力和运动性能。评价精子运动性能的指标包括：平均路径速度(VAP)、曲线速度(VCL)、线性速度(VSL)、直线度指数(STR)、线性度(LIN)、摆动指数(WOB)。

1.5 精子质膜完整性检测

使用电子天平精确称取0.49 g柠檬酸钠、0.9 g果糖，溶于100 mL超纯水配制为低渗溶液。将精子密度为1×10⁷个·mL^-1的待测精液以低渗溶液10倍稀释，置于37 ℃恒温水浴锅中。水浴30 min后，吸取5 μL稀释后精液置于400×光学显微镜下，随机选取清晰视野拍照。计算弯尾精子数与总精子数比例。每次计数300个以上精子，重复5次。

1.6 精子中ROS水平检测

将待测精液于37 ℃的CO₂培养箱中预热10 min后，加入1 μL DCFH-DA，孵育40 min，用1 mL预热后的PBS缓冲液冲洗，600×g离心5 min。重复3次后，加入20 μL PBS重悬，吸取10 μL精液样本于载玻片上，盖上盖玻片，荧光显微镜下随机选取清晰视野拍照，每次计数200个精子以上，重复3次。并使用ImageJ软件分析ROS绿色荧光强度。

1.7 精子H₂O₂含量和抗氧化因子活性水平检测

将精子密度为1×10⁷个·mL^-1的待测精液在4 ℃条件下保存72 h后，离心并收集沉淀，以PBS稀释后超声波破碎。利用过氧化氢(hydrogen peroxide，H₂O₂)测定试剂盒、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 测定试剂盒、过氧化氢酶(catalase，CAT)测定试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX) 检测试剂盒检测细胞中的H₂O₂含量以及抗氧化因子活性水平，具体操作步骤和判定标准参照说明书执行。

1.8 精子线粒体功能检测

将待测精液于CO₂培养箱37 ℃预热10 min，加入1 μL RH123和1 μL PI后，孵育30 min，使用1 mL预热后的PBS缓冲液冲洗，600×g离心5 min。重复3次后，加入20 μL PBS重悬，使用荧光显微镜，随机选取清晰视野拍照。每次计数200个精子以上，重复3次。使用ImageJ软件分析RH123荧光强度，并统计荧光精子数。

1.9 精子ATP水平检测

利用BCA蛋白浓度检测试剂盒，测定待测精子样本蛋白浓度，并使用ATP生物发光法检测试剂盒测定精子ATP水平，具体操作步骤如下：以蒸馏水将ATP标准品稀释为10^-4~10^-9 mol ·L^-1的梯度浓度，加入100 μL的荧光素酶提取物后，使用单管发光仪测定发光值，并根据梯度荧光值绘制标准曲线。将待测精子样品(1×10⁶个·mL^-1)加入细胞裂解液于95 ℃金属浴煮沸2 min，冷却至室温后加入100 μL荧光素酶提取物，测定样品荧光值并带入标准曲线得到样本ATP水平检测值，与蛋白浓度结合分析计算出待测样品中每毫克蛋白ATP水平。

1.10 数据统计分析

利用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差(ANOVA)分析和Duncan’s多重比较。P < 0.05代表差异显著，P>0.05代表差异不显著。所有数据均表示为“平均值±标准误(Mean±SEM)”。

2 结果 2.1 不同浓度NA处理对精子活力的影响

本研究以绵羊精液稀释液中添加10%BSA作为对照组，以稀释液中添加5、10、20 mmol ·L^-1的NA作为处理组，在4 ℃条件下保存144 h，对各时间点的精子活力进行分析。结果表明(图 1)，在第72小时后10%BSA对照组精子活力低于20%，而添加NA处理组精子的存活时间可延长至120 h；不同浓度NA处理后的12~72 h时，精子活力均显著高于对照组(P < 0.05)，其中10 mmol ·L^-1NA处理组的精子活力在第48、72、96以及120小时均显著高于5和20 mmol ·L^-1 NA处理组(P < 0.05)，在第72小时仍可达到70%以上活力。

2.2 不同浓度NA处理对精子运动性能的影响

本研究对4 ℃条件下保存24~72 h时精子的运动参数进行分析。结果表明(表 1)，不同浓度NA处理后，24~72 h时精子的平均路径速度、曲线速度、线性速度指标，以及48~72 h时精子的直线度指数、线性度指标均显著高于10%BSA对照组(P < 0.05)。其中，10 mmol ·L^-1 NA处理组24~72 h时精子的线性速度指标，以及48~72 h时精子的平均路径速度、曲线速度、直线度指数、线性度均显著高于5和20 mmol ·L^-1 NA处理组(P < 0.05)。摆动指数在各组间均无显著差异(P>0.05)。

本研究对4 ℃条件下保存24~72 h时精子的运动轨迹进行分析。结果表明(表 2)，不同浓度NA处理后24~72 h时精子的快速前向运动率、中速前向运动率指标均显著高于10%BSA对照组(P < 0.05)；其中10 mmol ·L^-1 NA处理组，精子的快速前向运动率、中速前向运动率指标显著高于5和20 mmol ·L^-1 NA处理组(P < 0.05)。因此，综合运动参数和运动轨迹结果表明，添加10 mmol ·L^-1NA处理后可维持绵羊精子更好的运动性能。

2.3 不同浓度NA处理对精子质膜完整率的影响

本研究对4 ℃条件下保存24~72 h时精子的质膜完整率进行分析。结果表明(图 3)，不同浓度NA处理后24~72 h时精子的质膜完整率均显著高于10%BSA对照组(P < 0.05)；其中，48~72 h时10 mmol ·L^-1 NA处理组精子的质膜完整率显著高于5和20 mmol ·L^-1 NA处理组(P < 0.05)。

2.4 不同浓度NA处理对精子ROS水平的影响

本研究对4 ℃条件下保存24~72 h时精子的ROS水平进行分析。结果表明(图 4)，不同浓度NA处理后24~72 h时精子的ROS荧光强度均显著低于10%BSA对照组(P < 0.05)；其中，第72小时10 mmol ·L^-1 NA处理组精子的ROS荧光强度显著低于5和20 mmol ·L^-1 NA处理组(P < 0.05)。

2.5 不同浓度NA处理对精子中H₂O₂含量和抗氧化因子活性水平的影响

本研究对4 ℃条件下保存第72 h时精子H₂O₂含量和抗氧化因子活性水平进行分析。结果表明(图 5)，不同浓度NA处理组精子的H₂O₂含量均显著低于10%BSA对照组(P < 0.05)，抗氧化因子CAT、GSH-PX、T-SOD、T-AOC的活性水平均显著高于10%BSA对照组(P < 0.05)。因此，综合ROS水平、H₂O₂含量和抗氧化因子活性水平结果表明，添加NA处理后可维持绵羊精子更好的氧化/抗氧化平衡。

2.6 不同浓度NA处理对精子线粒体功能的影响

本研究对4 ℃条件下保存第72 h时精子的线粒体功能进行分析。结果表明(图 6)，不同浓度NA处理组精子的线粒体膜电位与线粒体膜完整率均显著高于10%BSA对照组(P < 0.05)；其中，10 mmol ·L^-1NA处理组精子的线粒体膜电位与线粒体膜完整率均显著高于5和20 mmol ·L^-1 NA处理组(P < 0.05)。

2.7 不同浓度NA处理对精子ATP水平的影响

本研究对4 ℃条件下保存第72小时精子的ATP水平进行分析。结果表明(图 7)，不同浓度NA处理组精子的ATP水平均显著高于10%BSA对照组(P < 0.05)；其中，10 mmol ·L^-1 NA处理组精子的ATP水平均显著高于5和20 mmol ·L^-1 NA处理组(P < 0.05)。

3 讨论

绵羊精子在4 ℃条件下低温保存可有效延长保存时间^[20]，同时避免冻融过程中的损伤，有助于人工授精技术的实施。但是，长时间处于低温环境下会破坏精子质膜完整性^[4]，造成精子活力下降^[5]，降低输精后母畜受胎率^[21]。因此，稀释液中常添加卵黄、脱脂乳等作为保护剂保护精子质膜，但动物源保护成分存在多种风险且保存结果难以一致化^[22-23]，目前多以BSA、大豆卵磷脂等成分替代^[24]。根据相关文献与前期试验证明，精液低温保存过程中添加10%BSA可有效保护精子质膜并减少低温损伤^[25]，维持精子活力^[26]。

有研究表明，低温环境下精子中ROS持续累积诱发氧化应激，是造成精子质膜损伤的关键因素^[9]。NA作为一种抗氧化物，可以降低细胞内ROS水平，且具有保护细胞膜的作用^[27]。因此，本研究探讨绵羊精子4 ℃保存条件下，在稀释液中添加不同浓度NA对保存效果的影响，发现添加NA可将绵羊精子低温保存时间延长至120 h，而且10 mmol ·L^-1 NA处理组在第72小时的精子活力仍可以达到70%以上；精子质膜的完整性相对10%BSA对照组提高20%以上，运动性能更好。但是，当本研究尝试将10%BSA和NA联合使用时(结果未展示)，精子会发生快速死亡，推测可能由于BSA和NA的结合有关^[28]。因此，本研究以10%BSA作为对照，进一步明确NA在精子低温保存过程中的作用机理。

虽然处于正常生理范围内的ROS水平对细胞内部信号转导具有一定的作用，但是过高水平的ROS则会诱发细胞内氧化应激。在低温保存状态下，精子内ROS水平会伴随着保存时间的延长而持续累积^[5]，过高水平的ROS破坏线粒体呼吸链中的电子传递，影响线粒体膜完整性，造成线粒体损伤^[10]，损害精子中ATP的生成^[11]，导致精子运动性能下降^[29]，降低精子质量^[30]，最终造成输精后受胎率降低^[31]。本研究结果表明，绵羊精子低温保存72 h时，与10%BSA对照组相比，稀释液中添加NA后精子的ROS水平显著降低，线粒体功能、ATP水平、运动性能均显著改善，整体上与精子活力指标展现出的趋势相一致。

精子中H₂O₂含量是评价氧化应激的重要指标^[32]，它通过对质膜的过氧化对精子造成严重损伤^[33]。T-AOC水平可反映精子的总抗氧化能力，CAT、T-SOD和GSH-Px的活性反映精子内抗氧化酶对氧化应激的抵抗作用，抗氧化因子活性水平的降低则表示精子脂质过氧化增加，精子质膜发生损伤^[34]。本研究发现，当绵羊精子在低温下保存72 h时，与10%BSA对照组相比，添加了不同浓度NA处理后，精子的H₂O₂含量降低，CAT、GSH-PX、T-SOD活性与T-AOC水平升高，同时还提高了精子的质膜完整性。由此可见，在精子的低温保存过程中，添加NA能够有效降低氧化损伤，保护精子质膜，延长精子的保存时间。

4 结论

综上所述，在4 ℃保存条件下，以不同浓度NA作为保护剂添加在绵羊精液低温稀释液中，可有效提高精子的活力、运动性能、质膜完整性和抗氧化能力，并改善精子线粒体功能和ATP生成，达到提升精子低温保存效果的目的。其中相较于5、20 mmol ·L^-1 NA处理组，10 mmol ·L^-1 NA对精子的活力、运动性能、质膜完整性的提高最为明显，精子ROS水平更低，且更加显著的改善精子线粒体功能和ATP生成，对精子低温保存的提升效果最好。