表 1(Table 1)
图 1(Fig. 1)
基于简化基因组测序的永登七山羊遗传多样性分析
引用本文
马克岩, 韩金涛, 白雅琴, 李讨讨, 马友记. 基于简化基因组测序的永登七山羊遗传多样性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(5): 1939-1950.
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基于简化基因组测序的永登七山羊遗传多样性分析
1. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070;
2. 永登县动物疫病预防控制中心, 兰州 730300;
3. 甘肃省畜牧技术推广总站, 兰州 730030
2. 永登县动物疫病预防控制中心, 兰州 730300;
3. 甘肃省畜牧技术推广总站, 兰州 730030
摘要：旨在通过简化基因组测序(specific-locus amplified fragment sequencing, SLAF-seq)技术分析永登七山羊群体遗传多样性和群体结构, 为永登七山羊作为新发现资源申报提供支撑。本研究以甘肃省4个地方绵羊群体(每个群体随机选取10只成年健康母羊)作为研究对象, 利用SLAF技术检测全基因组范围内的单核苷酸多态性位点(SNPs)。通过perl编程计算观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、香浓维纳指数(SHI)和基因多样性指数(Nei)等5个遗传多样性指标; PopLDdecay软件分析每个品种连锁不平衡情况; elgensoft软件进行主成分分析(PCA); mega x软件构建4个绵羊品种的系统发育树; structure软件进行群体遗传结构分析; gcta软件进行亲缘关系分析。结果表明, 40只绵羊个体共检测到1 658 596个SNPs位点, 其中大部分SNPs位点位于基因间区域。永登七山羊群体Ho、He、PIC、SHI、Nei指标值分别为0.082、0.277、0.221、0.411和0.305, 且永登七山羊的连锁不平衡系数较高, 衰减速度较慢, 说明永登七山羊群体遗传多样性低; 永登七山羊与滩羊、兰州大尾羊和岷县黑裘皮羊之间的遗传分化系数(Fst)分别为0.090 6、0.098 0和0.104 5, 表明永登七山羊与其他3个品种之间分化程度较高; PCA显示, 群体间聚类模式差异明显, 可将永登七山羊与兰州大尾羊、滩羊和岷县黑裘皮羊区分开; 系统发育树结果表明, 兰州大尾羊独自聚为一大支, 永登七山羊和滩羊聚为另一大支, 亲缘关系较近, 随后永登七山羊逐渐分离出来独自聚为一小支; structure分析表明, K=2为最优分群数, 即4个群体来自两个原始祖先, 随着K值逐渐增加, 部分永登七山羊个体发生分离, 与其他品种遗传背景差异明显。亲缘关系热图显示, 每个亚群个体之间亲缘关系较低。结果提示, 永登七山羊与兰州大尾羊群体遗传多样性低, 永登七山羊与滩羊、兰州大尾羊和岷县黑裘皮羊之间分化明显, 这为进一步挖掘永登七山羊种质资源特性提供了理论数据。
关键词：永登七山羊 种质资源 遗传多样性 群体结构 简化基因组测序
Genetic Diversity Analysis of Yongdeng Qishan Sheep Based on Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing
1. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
2. Yongdeng Animal Disease Control Center, Lanzhou 730300, China;
3. Animal Husbandry Technology Extension Station of Gansu Province, Lanzhou 730030, China
2. Yongdeng Animal Disease Control Center, Lanzhou 730300, China;
3. Animal Husbandry Technology Extension Station of Gansu Province, Lanzhou 730030, China
Abstract: The aim of this study was to analyze the genetic diversity and population structure of Yongdeng Qishan sheep by specific-locus amplified fragment sequencing (SLAF-seq), and to provide support for the declaration of Yongdeng Qishan sheep as a newly discovered resource. Four local sheep populations (10 adult healthy ewes randomly selected from each population) in Gansu Province were taken as the research object. Single nucleotide polymorphisms(SNPs) within the whole genome were detected by SLAF technology. Five genetic diversity indexes, such as observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He), polymorphism information content (PIC), Shnnon Wiener index (SHI) and Nei diversity index (Nei), were calculated by Perl software. The linkage disequilibrium of each breed was analyzed by PopLDdecay software. elgensoft software was used for principal component analysis (PCA); mega x software was used to build phylogenetic trees of 4 sheep breeds; The structure software was used to analyze the genetic structure of the population; gcta software was used for kinship analysis. A total of 1 658 596 SNPs were detected in 40 sheep individuals, most of which were located in the intergenic region. The Ho, He, PIC, SHI, and Nei values of Yongdeng Qishan sheep were 0.082, 0.277, 0.221, 0.411, and 0.305, respectively. The higher linkage disequilibrium coefficient and slower decay rate in Yongdeng Qishan sheep indicate the low genetic diversity in the population of Yongdeng Qishan sheep. The genetic differentiation coefficients (Fst) between Yongdeng Qishan sheep and Tan sheep, Lanzhou fat tail sheep and Minxian black fur sheep were 0.090 6, 0.098 0 and 0.104 5, respectively, which indicated a high differentiation degree between Yongdeng Qi-shan sheep and the other 3 breeds. Principal component analysis showed obvious differences in clustering patterns among groups, which could distinguish Yongdeng Qishan sheep from Lanzhou fat tail sheep, Tan sheep and Minxian black fur sheep; The results of phylogenetic tree showed that Lanzhou fat tail sheep was clustered as one big branch alone, Yongdeng Qishan sheep and Tan sheep were clustered as another big branch, and the kinship was relatively close, subsequently Yongdeng Qishan sheep was gradually separated into one small branch alone. The structure analysis showed that K=2 was the optimal number of subpopulations, with 4 populations from two original ancestors. As the K value gradually increased, some QS individuals segregated and differed significantly from the genetic background of other breeds. The kinship heat map showed low kinship between individuals of each group. These results indicated that there was low genetic diversity in Yongdeng Qishan sheep and Lanzhou fat tail sheep, and that there was obvious differentiation between Yongdeng Qishan sheep and Tan sheep, Lanzhou fat tail sheep and Minxian black fur sheep. This provides theoretical data for further mining the characteristics of Yongdeng Qishan sheep germplasm resources.
Key words:
Yongdeng Qishan sheep germplasm resources genetic diversity population structure specific-locus amplified fragment sequencing
畜禽遗传资源作为生物多样性的重要组成部分，是国家重要战略性资源，具有不可再生性[1]。畜禽遗传资源的拥有量和研发利用能力已成为衡量一个国家畜牧业综合实力和可持续发展能力的重要指标之一。如今，畜禽种业面临激烈的国际竞争，世界各国正在积极抢占优质种源和产业科技的制高点。畜禽遗传资源的多样性是培育优良畜禽品种的物质基础，可以维持人类对未知需求的应变能力。加强畜禽遗传资源的保护与挖掘，对提升我国畜禽种业自主创新能力、核心种源自给率和种业市场竞争力等方面有重要的现实意义。
永登七山乡处于青藏高原与黄土高原的过渡地带，有着89万亩山坡草洼，饲养着8万多只绵羊。在2021年第三次全国畜禽遗传资源普查中，各级普查专员与老百姓均认为永登县七山乡祖祖辈辈饲养的永登七山羊善于爬山远牧、耐粗饲、抗病力强；公羊有角，母羊无角或短角，长脂尾；母羊每年仅能生产一次且产羔一只，与周围饲养的兰州大尾羊、滩羊、小尾寒羊等品种有明显区别，专家组一致认为“永登七山羊”符合新发现遗传资源鉴定条件。
目前大量研究通过微卫星标记[2-3]、血液蛋白基因座标记[4]、线粒体DNA标记[5-7]等方法对不同物种进行遗传多样性及群体遗传进化分析，但是这些标记只能覆盖少量基因组，得到有限的基因组数据。随着高通量测序技术的发展，基于酶切的简化基因组测序技术(SLAF-seq)为系统进化、种质资源评估和分子育种等提供了基础[8]，并与全基因组重测序[9-12]、SNP芯片[13-16]相比，测序成本大幅降低并且降低了基因组的复杂度，广泛应用于群体遗传分析、群体进化分析等研究领域[17-19]。刘宏祥等[20]通过SLAF技术分析了娄门鸭保种群的遗传多样性和群体结构，评估了其保种效果；马士龙等[21]研究了麦洼牦牛保种群的遗传多样性、群体结构和亲缘关系，为其遗传资源的保护与利用提供了理论依据；尤桂爽等[22]分析了6个地方鸡群体的遗传多样性和遗传结构；马丽娜等[23]基于SLAF测序分析了3个绵羊品种间的进化关系。目前，关于永登七山羊遗传多样性的研究鲜有报道，为此，通过SLAF技术分析永登七山羊、兰州大尾羊、滩羊和岷县黑裘皮羊群体遗传多样性及群体遗传结构，可为永登七山羊新种质资源的申报和利用提供数据支撑。
1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集本试验选择甘肃省4个地方绵羊品种共40只无亲缘关系绵羊作为研究对象，分别是永登七山羊(QS)、兰州大尾羊(LFT)、滩羊(TAN)和岷县黑裘皮羊(MBF)。所有样本颈静脉采血，用含抗凝剂的采血管收集，记录样品编号，24 h内带回实验室－80 ℃保存，具体采样信息见表 1。
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表 1 样品采集信息 Table 1 Collected sample information |
1.2.1 基因组DNA的提取与质量鉴定 按照Biomarker Blood/Cell/Tissue DNA Kit试剂盒说明提取基因组DNA。利用NanoDrop 2000检测DNA的纯度, 利用Qubit 2.0对DNA浓度进行精确定量。采用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。
1.2.2 简化基因组测序 所有样品委托北京百迈客生物科技有限公司进行简化基因组测序。选择绵羊oar_v4.0基因组为参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000298735.2/)进行酶切预测，最终确定使用Hpy166 II+EcoR V酶切，酶切片段长度在414~464 bp的序列定义为SLAF标签。对得到的酶切片段(SLAF标签)进行3′端加A处理、连接Dual-index测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后进行测序。
1.3 数据处理1.3.1 数据质控与基因组比对 测序获得的reads需要重新定位到参考基因组上，才可以进行后续变异分析。利用bwa[24]将测序reads比对到参考基因组上，并使用GATK[25]和samtools[26]两种方法开发SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集。
1.3.2 SNP变异鉴定 使用snpeff软件[27]用于注释变异，根据变异位点在参考基因组上的位置以及参考基因组上的基因位置信息，得到变异位点在基因组发生的区域以及变异产生的影响。
1.3.3 群体遗传多样性分析 利用perl编程计算观测杂合度(observed heterozygous，Ho)、期望杂合度(expected heterozygous，He)、基因多样性指数(nei diversity index，Nei)、多态信息含量(polymorphism information content, PIC)、香浓维纳指数(Shnnon Wiener index，SHI)5个群体遗传多样性指标。利用PopLDdecay(v3.41)软件，在同一条染色体上，计算一定距离范围内(1 000 kb)两两SNP间的连锁不平衡情况，连锁不平衡强度用r2表示。
1.3.4 群体结构分析 使用ELGENSOFT[28]软件包中的smart PCA程序基于SNP数据，进行主成分分析，得到样品的聚类情况。使用MEGA X[29]软件，基于邻接法(neighbor-joining)，采用kimura 2-parameter模型，bootstrap重复1 000次，构建各样品的系统发育树。基于SNP，采用structure软件，分析研究材料的群体结构。针对研究群体，预先设定亚群数目(K值)为1~10进行聚类，并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数。使用R包pop helper生成每个K值的Q矩阵堆叠图(http://royfrancis.github.io/pophelper)。使用GCTA[30]软件对个体亲缘关系进行分析。
2 结果 2.1 基因组DNA检测收集的共40份血液提取DNA，质检合格，同时对基因组DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳(70 V，45 min)检测，条带清晰明亮(图 1)，可用于后续基因组测序。
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M. DNA相对分子质量标准；1~40. 基因组DN M.λ-Hind III digest DNA marker; 1-40. Genomic DNA 图 1 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1 The agarose gel electrophoresis of genomic DNA |
共获得287.53 Mb reads数据，测序深度17.63×，测序平均Q30为94.12%，平均GC含量为43.07%。与参考基因组比对, 比对效率≥70%(表 2), 数据质量达到后续分析要求。用bwa将测序reads比对到参考基因组上，并使用gatk和samtools两种方法开发SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集，共得到1 658 596个群体SNPs, 根据SNP在染色体上的分布，绘制SNP在染色体上的分布图(图 2)。
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表 2 测序后的reads在绵羊基因组中的比对情况 Table 2 Mapping quality of reads after sequencing to sheep genome |
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图 2 SNPs在染色体上的分布图 Fig. 2 Distribution of SNPs on chromosomes |
40个个体中共鉴定出1 658 596个SNPs，通过注释发现(图 3)，大部分SNPs位于基因间区域(56.78%)，其余SNPs位于内含子(36.72%)、CDS(0.82%)等区域。此外，位于CDS区域内的13 599个SNPs中，有6 329个是同义编码突变(46.54%)，6 940个是非同义编码突变(51.03%)。
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图 3 SNPs在基因组中的注释分布 Fig. 3 Annotation distribution of SNPs in the genome |
如表 3所示，4个群体的观测杂合度Ho均低于期望杂合度He，其中TAN群体观测杂合度最高，为0.104，QS和LFT观测杂合度最低，为0.082；同样，QS群体的多态信息含量PIC、香浓维纳指数、Nei多样性指数在4个群体中也是最低，分别为0.221、0.411和0.305。
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表 3 遗传多样性指标 Table 3 Genetic diversity indexes |
连锁不平衡(LD)分析(图 4)表明，4个群体的LD系数(r2)随位点间距离增加而下降。LD系数由高到低依次是LFT>QS>TAN>MBF；其衰减速度由快到慢依次是MBF>TAN>QS>LFT。
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图 4 连锁不平衡模式 Fig. 4 Linkage disequilibrium patterns |
计算4个群体之间所有成对的Fst值(表 4)。结果发现，所有群体之间，QS群和MBF群之间的分化程度最高(0.104 5)，QS与LFT和TAN群之间的分化系数分别为0.098 0和0.090 6，表明QS与其他3个群体分化程度较高。
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表 4 4个群体之间的两两Fst Table 4 Pairwise Fst among 4 populations |
2.6.1 主成分分析 基于不同群体的SNP差异程度聚类成不同亚群，其结果可以用于与其它聚类方法的结果相互验证。由图 5可知，PC1和PC2的贡献率分别为3.86%和3.43%。LFT群和TAN群中的个体紧密聚集在一起；QS和MBF群个体较为分散。根据PC1基本可将MBF群体(PC1＞0)与其他3个群体区分开，PC2可将QS群体(PC2＜0)与其它3个群体区分开，4个群体之间聚类模式存在明显差异。
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图 5 4个绵羊群体的主成分分析 Fig. 5 Principal component analysis of 4 sheep populations |
2.6.2 系统发育树分析 根据群体的的遗传学数据推断出个体之间的亲缘关系的远近，构建距离矩阵，基于距离矩阵构建系统发育树。由4个群体的系统发育树(图 6)可明显看出，LFT群独自聚为一类，QS群和TAN群位于同一分支，随后QS群逐渐分离出来聚为一支。
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图 6 4个绵羊群体的系统发育树 Fig. 6 Phylogenetic tree of 4 sheep populations |
2.6.3 群体遗传结构分析 针对研究群体，预先设定亚群数目(K值)为2~10进行聚类，并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数。从图 7可以看出，K=2为最优分群数。从图 8可知，K=2时，MBF部分个体发生分离，K=3时，可分为3个亚群，QS部分个体分离出来；K=4时，TAN和LFT群遗传背景差异明显，K= 5~6时，呈现出更详细的品种遗传信息，但无论K为何值，始终有部分QS个体与TAN群没有发生明显分离。
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图 7 交叉验证错误率 Fig. 7 Cross validation error rate |
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图 8 群体结构 Fig. 8 Population structure |
2.6.4 亲缘关系分析 G矩阵分析结果表明(图 9)，所有个体分为4个亚群，分别为10个QS个体组成的亚群、10个TAN个体组成的亚群、10个LFT个体组成的亚群及MBF亚群，且每个亚群个体间亲缘关系较低。
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图 9 亲缘关系热图 Fig. 9 Heat map of kinship |
遗传多样性是物种在长期进化过程中对各种复杂环境适应的结果，是物种赖以生存和发展的基础[31]。研究种群的遗传结构和遗传分化可以更有效地保护和利用种质资源[32]。杂合度是度量群体遗传多样性的参数之一。品种杂合度越高，反映出品种的遗传信息也越多。本次研究结果发现，无论是观测杂合度还是期望杂合度，从高到低依次是TAN、MBF、LFT、QS，表明LFT与QS这两个群体遗传多样性较低。除QS外，其它3个群体之间的多样性与成述儒等[33]对甘肃6个地方绵羊品种的遗传多样性分析结果一致。由多态信息含量指标可知，4个群体的PIC范围为0.221~0.231，属于低度多态性(PIC＜0.25为低度多态性；0.25＜PIC＜0.5为中度多态性；PIC＞0.5为高度多态性)[34-35]，而本次研究中的PIC值与微卫星研究中的值相比较低，可能是不同方法所得到的标记之间的差异所导致。4个群体的香浓维纳指数和基因多样性指数结果同样表明兰州大尾羊和永登七山羊遗传多样性较低。连锁不平衡分析可用于评估群体遗传多样性[8]。从4个群体的连锁不平衡模式可知，兰州大尾羊和永登七山羊群体的连锁不平衡(LD)系数较高，衰减速度较快，认为这两个群体在驯化过程中受选择强度较高，遗传多样性较低。总之，群体多样性指标与连锁不平衡结果均表明，永登七山羊与兰州大尾羊群体遗传多样性低，原因可能是在长期的品种形成过程中，缺乏科学有效的育种方案，导致品种数量不断减少，加上群体内发生近交，导致群体遗传多样性较低。
本研究计算了群体遗传分化系数并基于测序数据进行了主成分、系统发育树及群体遗传结构分析，用于评估4个群体间的遗传关系和群体结构。群体分化系数Fst能够揭示群体间的分化程度[36-37]，本试验中，永登七山羊与岷县黑裘皮羊之间分化程度最高，兰州大尾羊、滩羊次之，且彼此间Fst值均＞0.05，表明永登七山羊与其他3个群体间存在中等程度的遗传分化[38]。主成分分析结果表示，群体之间聚类模式差异明显，根据PC1可将岷县黑裘皮羊与其他3个群体区分开，该结果支持传统的分类[39]，岷县黑裘皮羊属于藏系绵羊，而其他3个品种均属于蒙古羊；PC2可将永登七山羊与其他3个群体进行区分。此外，滩羊与兰州大尾羊群体之间部分个体相互聚集，群体间发生了基因交流，亲缘关系较近，这一结果与吕潇潇[40]的研究结果一致。系统发育树结果显示，4个群体中的个体独自聚集，群体间没有个体穿插。兰州大尾羊独自聚为一支，滩羊与永登七山羊聚为一支，表明这两个群体之间亲缘关系较近；之后永登七山羊逐渐分离出来，形成单独的分支。通过structure软件对4个群体的遗传结构进行研究，当K=2时，交叉验证错误率最低，说明本研究中的4个群体来自于2个原始的祖先。K=2时，岷县黑裘皮羊部分个体首先分离出来，K=3时，永登七山羊部分个体分离出来；K=4时，滩羊和兰州大尾羊遗传结构有明显差异；随着K值增加，呈现出更为复杂的遗传信息。但无论K为何值，始终有部分永登七山羊个体与滩羊没有发生分离，推测这两个群体起源可能相同，随着时间的推移，出现一定程度的分化，群体之间亲缘关系较近，该结果与遗传分化系数和系统发育树结果一致。亲缘关系热图显示，各群体个体之间亲缘关系较低。群体结构结果可以与PCA和系统发育树结果相互佐证，认为永登七山羊独立形成聚类，可单独作为新的绵羊遗传资源。
4 结论本研究通过计算不同遗传多样性指标分析甘肃省4个绵羊群体遗传多样性，结果表明，永登七山羊与兰州大尾羊遗传多样性较低；群体遗传分化系数和遗传结构结果表明，永登七山羊与兰州大尾羊、滩羊和岷县黑裘皮羊之间分化明显。结果为进一步挖掘永登七山羊种质资源特性提供了理论依据。
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(编辑 郭云雁)