在反刍动物中，宿主和微生物的共生关系对动物的生长和健康都有着积极的影响。而胃肠道作为宿主与共生微生物直接接触场所，即共生微生物和宿主动物之间的功能介质，也是面积最大的机体与外界环境发生联系的器官，无论是腔外物质的摄入，还是腔内分泌的盐酸、消化酶和胆汁盐等物质，以及驻留在胃肠道中的巨大微生物群都会对其完整性造成威胁^[1-2]。但胃肠道具有极强的抗逆性，不仅能够为共生微生物提供适宜的生存环境，还能抵御有害物质对组织的破坏和侵入，这一切归功于胃肠道上皮屏障。而在动物胃肠道定殖着的大量微生物与胃肠道上皮屏障有着密切联系。胃肠道上皮屏障与胃肠道共生微生物相互作用参与宿主防御、能量代谢、免疫调节等过程，在维持动物生长和健康方面发挥关键作用^[3-7]。本文总结了胃肠道上皮结构与功能以及胃肠道微生物和胃肠道上皮屏障之间的相互作用关系。旨在为胃肠道微生物与胃肠道上皮屏障间关系的研究提供参考。

1 胃肠道上皮屏障 1.1 瘤胃上皮结构与功能

反刍动物的瘤胃上皮具有吸收、转运、能量代谢、pH调节以及免疫和屏障功能，是影响整个机体营养物质净利用的独特部位，也是内腔内容物的物理屏障^[8]。瘤胃上皮为复层扁平上皮，由4个细胞层组成，包括基底层、棘突层、颗粒层和角质层，各细胞层间通过紧密连接、黏着连接、间隙连接或桥粒相互连接^{[2, 9]}。基底层细胞紧邻基底膜是第一个细胞层，该层的细胞通过有丝分裂不断生成含有线粒体且功能完整的细胞，大量线粒体产生的ATP水解后释放的能量被跨膜蛋白Na⁺/K⁺-ATP酶利用，用于转运胞内外Na⁺和K⁺，以维持细胞膜内外的离子平衡^[10-11]。此外，这些线粒体含有大量的生酮酶，参与瘤胃的生酮途径，在瘤胃能量代谢方面发挥重要作用^[12]。棘突层和颗粒层是中间细胞层，两层间无明显区分^[13]。基底层的有丝分裂细胞迁移至棘突层和颗粒层发生分化，在颗粒层的上层细胞层形成具有多种转运蛋白的分泌膜，颗粒层还分布着数量众多的的紧密连接蛋白，这些紧密连接蛋白增加了瘤胃上皮的机械强度并维持整个瘤胃壁代谢产物(小分子物质和离子)浓度梯度的完整性，阻止炎性因子、毒素和微生物等侵入体内^{[12, 14]}。颗粒层细胞分化成无细胞器的角质化细胞，这些角质化细胞通过桥粒相互连接形成角质层^[13]。角质层直接与瘤胃内容物接触起到保护屏障作用。此外，瘤胃上皮的角质层上具有由多种黏蛋白构成的黏液层，黏液层不仅能够将众多的共生微生物与上皮细胞分隔，还能够与角质化细胞相互作用形成一个几乎不可渗透的分子和离子屏障用于调控胃黏膜的跨上皮扩散和离子主动运输^{[12, 15]}。

1.2 肠道上皮结构与功能

动物肠道上皮为单层柱状上皮，主要由吸收性肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞、潘氏细胞和M细胞组成^[16-18]。肠道上皮与其表面的内外黏液层和上皮间的免疫细胞组成复杂的肠道上皮屏障^{[16, 18]}。肠道上皮屏障是一个具有高度选择性的半透性屏障，具有吸收营养物质、维持内环境稳态和免疫感知等功能，同时限制有害物质和微生物经肠腔侵入组织、器官和血液中^[16]。

肠道黏液层由水(90%~95%)、电解质、脂质(1%~2%)和蛋白质(黏蛋白、防御蛋白、结构蛋白)等组成。其中杯状细胞分泌的黏蛋白2(mucin 2, MUC2)是肠道黏液层发挥功能的重要组成成分^[19-21]。内黏液层由锚定在肠上皮上的MUC2聚合组成。MUC2牢固地附着在上皮细胞上并与免疫球蛋白、防御素和溶菌酶一起协同作用将共生微生物群与宿主免疫细胞分开，从而防止彼此间不必要的冲突以维持共生关系^{[1, 22]}。通过蛋白酶meprin β对聚合的MUC2进行蛋白水解处理转化形成外黏液层，该层结构松散且具有孔隙，允许微生物的定殖，并为微生物提供黏附位点和营养物质^[23]。

根据黏蛋白功能可将其分为凝胶形成黏蛋白和跨膜黏蛋白两类^[19]。肠道的凝胶形成黏蛋白主要为MUC2，这种凝胶状结构可有效阻止细菌和小分子物质经跨上皮扩散侵入宿主体循环^{[2, 24-25]}。跨膜黏蛋白包括MUC3、MUC12和MUC17等，主要用于构建和组成肠上皮细胞顶端膜表面的糖萼^[1]。肠细胞具有高度特化的顶端膜结构域，该膜结构域通过特殊的转运蛋白介导物质摄取和转运，而顶端膜的表面由微绒毛和糖萼组成^{[1, 26]}。因此，跨膜黏蛋白在肠细胞营养物质和离子摄取途径中发挥重要作用。

动物的肠上皮层是由紧密连接蛋白连接的多种上皮细胞构成，由于紧密连接作用肠上皮层形成了一个致密的肠屏障，在这里上皮细胞以及上皮间的免疫细胞(淋巴细胞、巨噬细胞、潘氏细胞、肥大细胞等)作为肠道的免疫屏障，通过分泌抗菌肽或细胞因子调控机体免疫反应使宿主能够通过受控机制吸收特定化合物或抗原，从而有效抵御病原微生物和有害物质的侵入^[26]。

1.3 紧密连接屏障

紧密连接是一种膜蛋白复合体，由不同的结构蛋白、功能蛋白和连接黏附分子(junctional adhesion molecule, JAM)组成^[27]。结构蛋白主要有闭合蛋白Occludin和Claudins，构成紧密连接的结构骨架，功能蛋白主要有外周膜蛋白Zos(zonula occludens, Zos)和连蛋白Zonulin，连接细胞骨架及跨膜蛋白^[28-29]。胃肠道上皮细胞构成管腔和黏膜组织之间的主要物理屏障，发挥强大的营养转运、代谢和屏障功能^[30]。而胃肠道上皮屏障的完整性依赖于各上皮细胞间的紧密连接^{[11, 31]}。

Occludin是组成紧密连接的主要跨膜蛋白之一，其为4分子交联体蛋白，具有4个跨膜结构域，能够和Occludin蛋白、Zos蛋白结合参与封闭细胞间隙，还能够调节细胞旁途径大分子的选择通透性，在维持紧密连接的结构和功能方面起重要作用^{[2, 28]}。Claudin蛋白结构与Occludin相似，为四聚体跨膜蛋白^[32]。Claudin蛋白参与了紧密连接上离子和小分子物质选择孔的构成，形成不同特异性和通透性的细胞旁离子通道^[33]。ZOs属于闭塞蛋白家族中的支架蛋白，是多结构域蛋白，它在大多数跨膜紧密连接蛋白和细胞骨架蛋白之间建立联系，对紧密连接的形成起关键作用^[34]。其中，ZO-1是连接Claudins、Occludin和细胞骨架蛋白的桥梁，对紧密连接的结构和功能起关键作用^[35-36]。

紧密连接参与不同类型胃肠道细胞间的相互作用，包括上皮细胞、免疫细胞和杯状细胞等，这些细胞与胃肠道上皮屏障的特定功能有关^[37]。此外，紧密连接还是决定消化道物质转运的首要因素。消化道物质转运经跨细胞或细胞旁途径，其中，细胞旁转运途径由紧密连接组成的连接复合物介导，紧密连接蛋白包围上皮细胞的顶端和侧膜，构建电荷和转运物质选择孔，由此对细胞间离子、小分子物质和溶质流动具有选择性^{[2, 35]}。在正常生理状态下，离子及小分子物质被允许通过紧密连接，微生物及其毒素则被隔绝在紧密连接外^[28]。紧密连接的形成和解离是一个动态过程，通过调节组织通透性，以响应胃肠道的化学成分变化、炎症反应和微生物组成^[38]。

2 瘤胃微生物群和瘤胃上皮屏障相互作用 2.1 瘤胃微生物群和瘤胃上皮屏障相互作用对瘤胃生长发育的影响

幼畜出生时即暴露于复杂的外界环境和母体微生物群落中，这些微生物开始在幼畜胃肠道大量定殖，显示出具有母体特征的初始微生物群落，而这些在幼畜出生后便存在于胃肠道的初始微生物是动物共生微生物建立的开始^[39]。共生微生物的建立是基于宿主和微生物之间的双向调节作用，宿主为微生物的定殖提供场所、适宜的温度、厌氧环境和发酵底物。而瘤胃共生微生物和宿主之间的相互作用影响瘤胃的生长发育、pH稳态、免疫调节和代谢等生物学功能^[8]。

幼龄反刍动物瘤胃处于快速生长和功能建立过程，在此期间瘤胃内的微生物对瘤胃的生长和功能都起到积极的作用。在羔羊瘤胃中乳酸菌、拟杆菌、放线杆菌、瘤胃梭菌、克雷伯氏菌和丙酸杆菌属与调节瘤胃上皮发育、细胞黏附和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferative activated receptor, PPAR)信号通路的宿主模块的表达呈正相关^[40]。在犊牛瘤胃中，普雷沃氏菌属、拟杆菌属和瘤胃球菌属组成的瘤胃细菌簇与瘤胃上皮调节锌离子结合过程的宿主基因和miRNA具有相关性^[41]。此外，幼龄反刍动物饲粮结构的不同，也会通过改变瘤胃微生物的组成和丰度，继而影响瘤胃的发育。Lin等^[42]研究发现，饲粮中补充发酵剂的羔羊瘤胃中产乙酸的光冈菌属(Mitsuokella spp.)、产乳酸的Shapea spp.、利用乳酸的巨球型菌属(Megasphaera spp.)和内毛菌属(Entodinium spp.)富集，瘤胃上皮细胞生长模块相关的基因表达显著上调，而这种上调与微生物产生的乙酸和丁酸浓度的增加有关。短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)的生产和吸收刺激瘤胃上皮代谢，这可能是启动瘤胃上皮发育的关键^[43-44]。因此，瘤胃中不同微生物群结构和组成能够直接或通过影响SCFAs的浓度间接在不同程度上影响瘤胃上皮发育和功能。

2.2 瘤胃微生物群和瘤胃上皮屏障相互作用对瘤胃pH稳态的影响

微生物和宿主之间的相互作用影响瘤胃的pH稳态。正常情况下，瘤胃的pH保持在相对恒定的状态，通常为6~7，反刍动物唾液含有高浓度的缓冲盐呈弱碱性有助于缓冲瘤胃酸度以维持相对恒定的pH，进入瘤胃的唾液能够被瘤胃上皮吸收，此过程中产生的氨提供进一步的缓冲，从而为瘤胃中的微生物生长提供适宜环境^[45]。而当瘤胃处于酸碱失衡状态，瘤胃上皮的结构和功能以及微生物群组成均会发生紊乱。研究发现，亚急性酸中毒的反刍动物瘤胃上皮结构和微生物群组成会遭到破坏，与健康的反刍动物相比，亚急性酸中毒的反刍动物瘤胃内部分微生物的丰度发生改变，并且这些差异微生物与瘤胃上皮参与pH调节、组织重塑、细胞信号传导和形态发生相关的部分基因的表达呈相关性，而通过调节瘤胃微生物群能有效缓解动物的亚急性酸中毒症状^[46-48]。瘤胃上皮转录组及其相关微生物群的显著变化与动物的酸中毒有关^[46]。酸碱失衡会对瘤胃环境条件产生不利影响，从而影响瘤胃内微生物。因此，瘤胃微生物群物种丰度的变化有望作为微生物群物种的生物标志物来判断亚急性酸中毒动物瘤胃上皮损伤。

2.3 瘤胃微生物群和瘤胃上皮屏障相互作用对瘤胃免疫功能的影响

在免疫调节方面，瘤胃微生物可以与瘤胃上皮直接相互作用，从而影响瘤胃上皮免疫系统的发育和功能^[41-42]。微生物对宿主免疫功能的影响归因于微生物相关分子模式(microbial associated molecular patterns, MAMPs)的存在。MAMPs是微生物不可或缺的高度保守的分子结构，能够与宿主的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)作用被宿主先天免疫系统识别。PRRs识别共生微生物能够刺激上皮细胞增殖、并诱导各种免疫因子的表达，从而提高宿主对感染的抵抗力，维持微生物与宿主免疫系统之间的平衡关系^[49]。在动物研究上常见的MAMPs包括来自革兰阴性菌外膜的脂多糖和来自革兰阳性及革兰阴性菌细胞壁的肽聚糖，这两种物质通常可作为动物先天免疫的诱导剂，用于刺激与免疫活性相关基因的表达^[50]。瘤胃微生物群也可以产生脂多糖和其他MAMPs，并与上皮组织相互作用，诱导免疫反应发生^[51]。

2.4 瘤胃微生物群和瘤胃上皮屏障相互作用对瘤胃代谢的影响

在代谢方面，微生物和宿主之间的相互作用在反刍动物代谢中起重要作用。动物瘤胃上皮组织中45%以上的关键基因参与代谢过程，且这些基因的表达与微生物发酵产生的SCFAs有关^{[41, 52]}。据统计，宿主每日所需能量的70%由瘤胃微生物提供。因此，在反刍动物中，关于最大化瘤胃微生物发酵、减少甲烷排放的方法被广泛研究，旨在提高宿主的能量利用效率。

通过微生物基因和物种能够准确预测动物的能量利用效率表型，高能量利用效率动物的特定微生物群代谢途径富集使得能量向动物高效输送，同时降低甲烷向大气排放^[53]。高能量利用效率动物产生甲烷较低的原因可能有以下两个方面：1)产甲烷菌和甲烷生成途径相关微生物的相对丰度较低，如在低甲烷产量动物瘤胃中产甲烷菌和大量产氢气的细菌相对丰度较低^[54]；2)低甲烷产量动物瘤胃的特定微生物发酵更高效。在低甲烷产量动物瘤胃中，乳酸生产菌Sharpea azabuensis.和乳酸利用菌Megasphaera spp.具有较高的丰度，其发酵途径也更高效。低甲烷产量动物瘤胃微生物快速发酵产生乳酸，乳酸进一步由乳酸利用菌转化为丁酸，此过程产生的氢和甲烷相较于高甲烷产量动物瘤胃微生物发酵途径产生的氢和甲烷数量明显降低，据预测，低甲烷产量动物瘤胃产生的甲烷将减少约24%^{[53, 55]}。此外，微生物发酵产物丁酸不仅能够作为上皮细胞的能量底物被瘤胃上皮吸收，还能够促进瘤胃的生长以及瘤胃上皮SCFAs摄取和代谢相关基因的表达^[56]。而在高能量利用效率动物中，瘤胃上皮吸收丁酸的速率随着丁酸浓度的增加而增加，通过在整个瘤胃上皮中增加丁酸的吸收来平衡高能量利用效率动物丁酸的大量产生，并以此达成瘤胃中丁酸的产生和吸收平衡^[55]。研究发现，在产高蛋白牛奶的奶牛中，普雷沃氏菌属在瘤胃中丰度更高，其中多糖乳杆菌(P. multisaccharivorax)、P. histicola、P. maculosa、P. buccae 和P. albensis与支链氨基酸生物合成途径呈强正相关，在产高蛋白牛奶的奶牛瘤胃中，微生物的小分子代谢物如氨基酸、羧酸和SCFAs的水平更高，这使得不同奶牛瘤胃上皮吸收和运输的代谢产物存在差异^{[55, 57]}。以上研究证明，不同瘤胃微生物发酵途径的差异可能导致代谢产物生产的差异，最终影响宿主能量利用效率。

3 肠道微生物群与宿主上皮屏障相互作用 3.1 肠道微生物和肠道黏液层相互作用

肠道黏液层发挥功能主要依赖于杯状细胞分泌的黏蛋白，黏蛋白是高度O-糖基化修饰的糖蛋白，约80%的黏蛋白生物量是黏蛋白型O-聚糖^[58]。肠道上皮O-聚糖可以通过为细菌黏附素提供配体，利用其黏附作用引导微生物定殖。在肠道中的一些具有黏液溶解活性的微生物可以利用O-聚糖作为能量底物，并将其分解成单糖供其他微生物利用。如在动物肠道外黏液层定殖的嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila, A. muciniphila)能够分解肠道黏蛋白并产生SCFAs^[59]。A.muciniphila产生的SCFAs被霍氏真杆菌、厌氧棒状杆菌和普拉梭菌等益生菌作为能量底物利用以用于自身生长^[59]。此外，A.muciniphila还通过刺激杯状细胞的增殖来增加黏蛋白的产生，从而加强肠道屏障^[60]。Wang等^[61]对山羊肠道微生物研究发现，在山羊空肠中的优势菌是瘤胃球菌、梭状芽孢杆菌和丁酸菌，通过PICRUSt评估推测微生物群的基因功能，发现与聚糖代谢和氨基酸代谢相关的基因主要在空肠样品中富集。

黏液层分为外黏液层和内黏液层，外黏液层是宿主共生微生物黏附定殖的场所，在此处肠道微生物群利用宿主分泌的黏液糖蛋白作为营养来源用于生长和代谢，且由于外黏液层的黏附作用能够有效防止微生物随肠蠕动被带走^[62-63]。而内黏液层含有免疫细胞分泌的抗菌肽和分泌型免疫球蛋白，能够直接作用于微生物，阻止微生物向内层侵入^[63]。

由于肠道是一个连续且形态结构复杂的管状结构器官，肠腔内的物理化学条件和微生物的可利用底物会随肠段的变化而改变，因而肠道微生物的多样性和物种丰度分布具有显著的空间特异性^[64]。根据各肠段理化条件以及微生物群组成的相似性和微生物主要功能可将肠道分为两个部分，小肠(十二指肠、空肠和回肠)和大肠(盲肠和结肠)^[65]。在小肠中的黏液层是不连续的，但小肠富含免疫细胞和潘氏细胞，潘氏细胞产生的防御素、抗菌肽和溶菌酶与其他免疫细胞产生的免疫因子形成化学屏障，使肠道微生物与肠道上皮细胞分离^[66]。与小肠相比，在大肠的杯状细胞数量更多，但没有潘氏细胞。因此，大肠具有丰度更高的微生物多样性，且由于大量分泌的黏液层的存在，微生物能很好的与上皮层分离。

动物肠道黏液层的组成和功能受肠道微生物的影响。在绵羊肠道中，双歧杆菌、瘤胃球菌和肠球菌的丰度与黏蛋白的基因表达呈正相关^[67]。研究发现，无菌大鼠和传统饲养大鼠肠道黏液层厚度和组成有明显差异，通过对大鼠结肠组织化学分析发现，无菌大鼠结肠黏液层较薄甚至局部不存在，且与传统饲养大鼠相比黏液层结构相对疏松^[68]。此外，相较于传统饲养小鼠，无菌小鼠结肠MUC2蛋白的相对丰度较低，黏液层可穿透性更强^[69-70]。形成以上结果的原因可能是MUC2表达需要复杂微生物群的刺激，或者需要微生物物种之间的潜在代谢相互作用来产生MUC2诱导信号，但无菌小鼠肠道不具备复杂的微生物环境^[71]。有研究进一步将传统饲养小鼠肠道微生物移植到无菌小鼠体内，发现无菌小鼠肠道黏液层组成发生改变，且与提供微生物的小鼠肠道黏液层相似^[69]。此外，肠道微生物的代谢产物SCFAs也能通过增加杯状细胞数量促进黏蛋白的分泌，增强肠道的屏障功能^[72-73]。综合以上结果认为，肠道微生物群对黏液层的组成和功能起关键作用。

3.2 肠道微生物群和上皮层相互作用

肠道微生物及其代谢产物在维持肠道上皮完整性方面起重要作用。宿主和肠道微生物群互惠共存，肠道微生物通过竞争黏膜定殖位点、分泌有机酸和抗菌肽等物质抑制病原菌定殖，并通过调控紧密连接蛋白的表达影响紧密连接重塑^{[16, 74]}。

紧密连接的作用是将上皮细胞连接在一起，通过调节上皮通透性影响肠道上皮屏障完整性。细菌-上皮细胞相互作用通过调节紧密连接蛋白表达和组装在调节上皮通透性方面起着至关重要的作用^[16]。吴兆海^[75]对被动免疫失败犊牛进行粪菌移植，发现粪菌移植通过提高被动免疫失败犊牛空肠和结肠紧密连接蛋白(Occludin、Claudin)表达水平，从而改善被动免疫失败犊牛肠道上皮紧密结构。

丁酸是微生物发酵产生的重要代谢产物，在维持宿主肠道健康方面发挥重要作用。丁酸主要通过调节上皮紧密连接蛋白和黏膜基因的表达来调控上皮屏障的完整性^{[73, 76]}。此外，丁酸还在动物肠道炎症损伤后的组织修复中起重要作用。研究发现，犊牛的腹泻发生率与空肠结构蛋白表达呈负相关，给腹泻犊牛饲喂丁酸钠可显著提高空肠中Occludin和Zonulin的表达，从而缓解犊牛腹泻^[77]。在结肠炎动物肠道，丁酸产量增加并通过与肠道低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)相互作用，诱导肠上皮紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，从而缓解肠道的炎症损伤^[78]。丁酸还能通过上调SCFAs受体G蛋白偶联受体109A(G protein coupled receptor109A, GPR109A)的表达抑制细胞凋亡信号通路的激活从而缓解病毒诱导的肠上皮细胞凋亡^[79]。

在肠道上皮层富集了大量能够产生免疫球蛋白的浆细胞和抗原呈递细胞，这些免疫细胞形成免疫防线进一步巩固肠道防御屏障。在肠道中，宿主免疫系统是控制肠道微生物群的有力工具，而肠道微生物对宿主免疫系统的形成至关重要^[80]。动物免疫系统能够使用免疫细胞PRRs来检测和识别共生微生物，当微生物与上皮屏障接触时，PRRs激活宿主的肠道免疫系统，促进免疫细胞的活化以及细胞因子的产生。此外，由于肠道内的共生微生物能够长期的与宿主上皮屏障直接(通过细胞接触)或间接(通过MAMPs或代谢物SCFAs、次级胆汁酸和色氨酸代谢物的扩散)接触，共生微生物可以平衡宿主防御机制，影响宿主的免疫应答反应，从而建立免疫耐受性，因此当病原微生物侵入时免疫系统可以将其清除，并保留共生微生物^[3-4]。

Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是动物肠道中常见的一种重要的PRRs，在识别病原体、引导机体免疫应答方面起关键作用^[81-82]。当侵入肠道的病原体被TLRs识别后，TLRs通过激活下游免疫通路，促使免疫因子的产生，通过上调溶菌酶分泌和炎症细胞对感染部位的过滤来促进入侵病原体的清除，从而为共生微生物提供良好的生存环境^[83-84]。TLRs还可以介导肠道共生微生物群和宿主免疫系统之间的串扰和相互作用来缓解炎症的发生^[85]。如在结肠炎小鼠上，TLR4介导A.muciniphila对抗炎调节性T细胞的激活，从而缓解小鼠结肠炎症状^[85-86]。

宿主和肠道微生物群以高度互惠的关系共存，对健康状况具有至关重要的影响。肠道微生物群和肠上皮屏障的相互作用支持了宿主多样化的肠道及全身生理功能，维持最佳的屏障功能和免疫稳态、预防了病原菌的肠道定殖。

4 小结

在动物的长期进化过程中，宿主和微生物之间建立起的共生关系在动物的生命活动中发挥至关重要的作用。胃肠道上皮作为共生微生物和宿主动物之间的功能介质，可以通过一系列的细胞分子与共生微生物相互作用来调节胃肠道的防御、代谢、免疫等功能。同时，不同宿主间的差异微生物和代谢产物可以作为标志物来预测动物的能量利用效率和健康状况等。由于微生物的复杂性与多样性，关于二者的相互作用的分子机制仍需更多的研究探索，从而为动物胃肠道早期发育、功能调节以及疾病预防开辟新的道路。