表 1(Table 1)
家畜早期妊娠诊断的研究进展
引用本文
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家畜早期妊娠诊断的研究进展
1. 兰州大学草地农业科技学院 草种创新与草地农业生态系统全国重点实验室 农业农村部草牧业创新重点实验室 草地农业教育部工程研究中心, 兰州 730020;
2. 民勤县畜牧兽医工作站, 民勤 733300
2. 民勤县畜牧兽医工作站, 民勤 733300
摘要：本文从原理、方法、诊断时间和准确率等方面对家畜妊娠临床诊断法、实验室诊断法以及胎儿游离DNA检测法进行综述, 总结了不同妊娠诊断方法的优缺点、发展趋势以及实际应用效果, 为探索不同应用场景下适宜的家畜妊娠诊断方法提供参考。传统的临床诊断法具有快捷经济的优点, 但准确率受人为操作影响较大; 实验室诊断法提高了准确率, 提早了检测时间, 但存在成本高和检测标准不统一的局限性; 胎儿游离DNA检测法可用于家畜胎儿性别鉴定, 而非性别依赖性胎儿DNA特异性标志物仍需进一步探索。
关键词：放射免疫分析法 酶免疫测定法 早期妊娠因子 妊娠相关糖蛋白 胎儿游离DNA
Advance of Early Pregnancy Diagnosis in Livestock
1. Engineering Research Center of Grassland Agriculture, Ministry of Education, Key Laboratory of Grassland Livestock Innovation of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, State Key Laboratory of Herbage Improvement and Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China;
2. Extension Station of Animal Husbandry and Veterinary Medicine in Minqin County, Minqin 733300, China
2. Extension Station of Animal Husbandry and Veterinary Medicine in Minqin County, Minqin 733300, China
Abstract: This article reviewed the clinical diagnostics, laboratory diagnostics and circulating cell-free fetal DNA(ccffDNA) detection of pregnancy from the following four aspects: principle, method, diagnostic time and accuracy. Through the comparison and comprehensive analysis of the above methods, The advantages, limitations, research trends and the actual application effects of the above diagnostic methods were summarized, in order to provide suitable methods of livestock pregnancy diagnosis applied in different situations. The traditional clinical diagnostics have the double advantages of fast and cheap, but the accuracy is susceptible to the artificial operation. Laboratory diagnostics are earlier and more accurate, but they have disadvantages of lacking unified standard and costing more. The detection of ccffDNA can be used to identify fetal sex in domestic animals, whereas the specific markers of non-sex-dependent fetal DNA are still needed to be explored further.
Key words:
radioimmunoassay enzyme immunoassay early pregnancy factor pregnancy-associated glycoproteins circulating cell-free fetal DNA
准确的早期妊娠诊断一方面可以及时对已妊娠的母畜精细化管理，保证母畜健康和胎儿发育正常；另一方面可以快速鉴别空怀母畜，及时补配，缩短胎间距，从而达到提高家畜繁殖效率和养殖业经济效益的目的[1]。目前，家畜妊娠诊断的方法包括外部观察法与试情法、触诊法、阴道检查法、超声波探查法等临床诊断法; 雌激素检测法、早期妊娠因子(early pregnancy factor, EPF)检测法、妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoproteins, PAGs)检测法、干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)检测法等实验室诊断法。其中大多数诊断方法无法同时满足菅原七郎[2]提出的家畜早期妊娠诊断五项原则，即尽早、准确率高于85%、方法简便、对母畜仔畜安全无害、经济实用。本文综述了不同家畜妊娠诊断方法的原理、方法、诊断时间、准确率和局限性，旨在探索兼具超早期、准确率高、简便经济等特点的家畜妊娠诊断方法，进而达到提高家畜繁殖效率的目的。
1 临床诊断法 1.1 外部观察法与试情法外部观察法与试情法是最早应用于家畜生产的妊娠诊断方法，本质是通过观察配种后家畜食欲、饮欲、活动量、腹围、乳头、外阴及分泌物[3]的变化，以及是否有返情表现来判断其妊娠与否。此法可用于猪配种后第18~24天[4]、羊配种后21 d[5]以及马配种后18 d[6]的妊娠诊断。在猪配种后第26~31天，同时使用“公猪查情”法与压背法对判断已妊娠母猪的准确率可达到90.3%，但用此法判断未妊娠母猪的准确率很低，仅有36.07%[7]。外部观察法与试情法广泛应用于猪的妊娠诊断，当应用于其他家畜的妊娠诊断时，易受观察者主观判断[8]、家畜种类(妊娠母马返情率高达5%~10%，且怀母驹母马返情率更高[6])、母畜生殖健康水平[8]等因素的影响，准确率不稳定，应用受限。
1.2 触诊法20世纪80年代中，触诊法作为妊娠诊断方法开始应用于畜牧生产，包括直肠触诊法、腹壁触诊法以及直肠-腹壁触诊法。直肠触诊法是目前大型家畜繁殖生产中最主要的妊娠诊断方法，通过隔着直肠壁，触摸感受母畜子宫动脉直径和搏动强弱的改变、卵巢和子宫角大小形状和质感改变以及胎儿存在与否[9]来判断母畜是否妊娠。此法广泛应用于奶牛的妊娠诊断[10]，授精60 d后妊娠诊断准确率可达86.96%[11]，但准确性受奶牛胎囊内的液体量多少、奶牛体型、年龄及生殖健康水平(子宫积水或子宫蓄脓会导致误诊)[12]多种因素共同影响。此法也应用于马的妊娠诊断，最早在配种后17~20 d[6]即可触摸到子宫和卵巢的变化，但由于马直肠壁薄且脆弱，须选用操作规范且极具经验的技术员谨慎操作，避免对马的肠道造成损伤。直肠触诊法在体型较小的家畜中应用受限：只有手臂较细的术者才可以对大体型经产母猪进行直肠触诊；而羊的直肠-腹壁触诊法对技术员的操作规范和操作经验以及待检母羊的保定要求极高，一旦操作不当或保定失败，触诊棒[13]的使用会大大增加医源性流产的风险。触诊法更适合作为牛、马等大型家畜的妊娠诊断，对技术员的技术和经验要求较高，同样存在妊娠诊断不及时的局限性。
1.3 阴道检查法阴道检查法是使用开膣器或内窥镜，通过观察子宫颈口状态变化、阴道黏膜颜色变化以及分泌物性状变化来判断母畜妊娠与否[14]，可作为猪、牛、羊的早期妊娠诊断方法。阴道检查法可用于配种3周后母猪的妊娠诊断，但准确率受个体间差异和生殖健康水平影响较大，妊娠母猪子宫颈及阴道的病理变化可造成妊娠征状不明显，母畜空怀时持久黄体的存在也可能导致类似妊娠变化。此法在牛的生产中准确率低，仅可作为妊娠诊断的辅助参考[15]。此法用于配种后60 d的母羊的妊娠诊断，确诊率可达95%[14]。阴道检查法在猪和牛的妊娠诊断中准确率很低，在羊的妊娠诊断中准确率较高，但诊断时间较晚，且对技术人员的操作经验要求较高。
1.4 超声波探查法20世纪80年代到90年代，A超、D超和B超先后在我国畜牧生产和兽医临床上得到广泛的推广应用。超声波探查法是让超声波穿过不同动物组织器官，产生不同强度的回波信号的一种物理检查法，通过检测羊水有无(A型超声波诊断法)，探测胎心音、胎动音、脐带血流音和母体子宫脉管血流音[16](D型超声波诊断法)或以光点明暗代表回声信号的强弱, 显示出相应部位的断层声像图[17](B型超声波诊断法)，来判断母畜妊娠与否。由于A型超声波诊断法易出现假阴性的情况[18]；D型超声波诊断法价格昂贵且对操作者技术要求较高；在猪、牛、羊、马等各类家畜生产中，应用最广泛的是B型超声波诊断法。腹部B型超声波诊断法用于母猪早期妊娠诊断的最佳时间是配种后24 d[18]，确诊率可达100%。在牛的生产中，B型超声波诊断法主要采用直肠扫查法[19]，彩色多普勒超声对配种后17 d的母牛进行妊娠诊断准确性可达80.4%，在21 d达到96.4%[20]。此法用于配种后33~45 d的母羊，准确率为90%[21]。刘宗玲等[22]用B超直肠探查法对湖羊进行妊娠诊断，配种后20 d的妊娠确诊率为30.8%，配种后25 d升至84.6%，在配种后30 d达到100%。但此法在羊的妊娠诊断中存在的问题包括：检查前羊采食过多会影响B超成像，需要检查前控饲；发情和生殖疾病可能出现子宫液体暗区造成误判；检查过程中力度、角度和深度不当，可能造成直肠机械损伤甚至流产，不适用于体型偏小的母羊[23]。马的B超直肠探查法，在配种后13 d准确率可达90%以上，配种27 d后准确率可升至100%[24]。同样，个体差异以及子宫炎症、卵巢囊肿和持久黄体等生殖系统疾病可能会影响B超成像造成误判，操作人员在检查过程中也要注意力度和深度，避免机械损伤。B超法因其诊断时间早、准确率高等特点，适用于各类家畜的早期妊娠诊断，但B超直肠探查法不适用于体型较小的家畜，且存在因为设备昂贵无法应用于小型养殖场的局限性。
2 实验室诊断法 2.1 雌性激素检测法雌性激素是由卵巢和胎盘产生的类固醇激素, 分泌随着卵巢周期性变化而波动，在家畜的发情周期和妊娠期中呈规律性变化。随着免疫学诊断技术的发展，人们开始利用免疫学方法，对妊娠前后家畜血清、乳汁、粪便和尿液中的雌性激素进行检测，根据其含量来判断母羊是否妊娠, 在畜牧生产上可应用于发情鉴定和早期妊娠诊断。
2.1.1 放射性免疫分析法 放射性免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)是一种将放射同位素的灵敏性与免疫反应的特异性相结合的微量分析方法[25]，可通过测定母畜血浆、乳汁及尿液中的的孕酮(progesterone, P4)或硫酸雌酮(estrone sulfate, E1S)浓度进行早期妊娠诊断。可用于猪、牛、羊的早期妊娠诊断。RIA测定杂种母猪配种后28 d血浆中E1S含量，若高于0.5 ng·mL-1则可判断为已妊娠，诊断的准确率高达100%[26]。妊娠牛乳汁孕酮(milk progesterone, MP4)含量从7~9 d开始极显著高于未妊娠牛(P < 0.01)，且差异随着时间增加而增大[27]。用RIA法对配种后21~26 d的奶牛进行妊娠诊断，孕酮含量高于4.0 ng·mL-1可判定为已妊娠，孕酮小于2.0 ng·mL-1判定为未妊娠，总准确率为84.31%[28]。用此法对配种后22~25 d的萨能奶山羊进行妊娠诊断，孕酮值小于8.3 ng·mL-1判断为空怀，妊娠诊断阳性准确率为96.5%，阴性准确率为90%[29]。RIA与超声波探查法相比，诊断时间可提前5~10 d，诊断的准确率也较高，但由于设备昂贵，对技术和环境要求较高，无法当日得到结果以及存在放射性危害等原因[30]，此方法应用受限。
2.1.2 酶免疫测定法 酶免疫测定法(enzyme immunoassay, EIA)是将酶促反应的敏感性可视性与抗原抗体结合的特异性相结合，用酶标记乳汁中P4或血清中E1S，利用酶的显色反应，通过分光光度计或酶标读数器读取底物液的光密度值，计算P4或E1S浓度进行妊娠诊断，可用于猪、牛、羊的早期妊娠诊断。用EIA法测定配种后15~26 d母猪血清中的E1S含量，含量到达0.9 ng·mL-1或更高者都判断为妊娠，总准确率为97.8%[31]。另外，用此法对配种后21~25 d的母猪进行检测，将粪便中孕酮含量超过150 ng·g-1判定为已妊娠，妊娠诊断阳性准确率为95.9%，阴性准确率为72%[32]。吴凌等[33]用自制酶联免疫(enzyme-link immuno sorbent assay, ELISA)试剂盒，测定配种后19~23 d奶牛乳汁中MP4浓度，妊娠诊断阳性确诊率为93.3%，阴性准确率为95.8%。用EIA法检测配种后19 d的母羊，血清中孕酮含量高于2.5 ng·mL-1判为妊娠，总准确率为91.4%[34]。用ELISA法检测配种30 d的绵羊血清中孕酮含量，高于16.5 ng·mL-1判定为已妊娠，准确率可达100%[35]。EIA与RIA相比，没有放射性危害，灵敏度和特异性高，但操作过程较为繁琐，对操作要求高[36]；ELISA试剂盒的价格昂贵且对保存条件要求高[37]，使此法应用受限。
2.1.3 胶体金免疫层析法 胶体金免疫层析法(gold immune colloidal technique, GICT)是利用胶体金免疫层析双抗夹心法，研制出妊娠诊断试纸，检测母畜尿液中的孕酮含量，以孕酮水平高低判断母畜是否妊娠的一种检测方法[38]，可用于猪、牛、羊的早期妊娠检测。ICA在母猪配种后(20±2)d时取尿液初诊，在配种后40 d时再进行复检确诊，因其无侵入性、操作简便、检测迅速、成本低且准确性高的优点，在猪的生产中推广使用前景好[8]。奶牛早孕胶体金检测试纸的妊娠确诊率为值94.4%，未妊娠确诊率为91.2%；DG·Blue eyes牛妊娠快速诊断可视试剂盒的诊断时间为配种后20~25 d，妊娠诊断阳性确诊率为97.3%，阴性确诊率为97.0%[39]。许欣[40]用自制的胶体金试纸条对配种后21 d的湖羊进行妊娠诊断，孕酮含量大于1.7 ng·mL-1判定为已妊娠，妊娠诊断阳性确诊率为83.3%，阴性准确率为66.7%。胶体金免疫层析法同时具有准确率高、超早期、安全无损伤、操作简便、检测迅速的优点，但目前还未研制出用于羊、马等家畜早期妊娠诊断的商品化的可视试剂盒。
2.2 早期妊娠因子检测法EPF在胚胎发育过程中作为滋养层自分泌和旁分泌的免疫耐受因子[41]，抑制母体对胎儿的免疫排斥以维持妊娠，存在于早期妊娠的人、猪、牛、羊等哺乳动物的血清、淋巴细胞、宫颈黏液和阴道采集物中[42]，在妊娠后24 h即可检出。在牛的生产中，EPF常用玫瑰花环抑制试验和硫酸铜检测法等进行测定：玫瑰花环抑制试验对配种后1个月的母牛进行妊娠诊断，妊娠与空怀母牛R值差异显著(P < 0.05)[43]；用3%的硫酸铜对妊娠31~50 d的母牛进行妊娠诊断，正确率可达90.35%[44]。在羊的生产中，可利用血清EPF在酸性环境中可与其他蛋白质形成絮状物[45]的特点判定是否妊娠，即血清酸滴定法。此法用于配种后16~30 d羊的妊娠诊断，阳性、阴性确诊率分别为89.88% 和96.83%，总确诊率为90.81%[46]。由于EPF不是胎盘特异性蛋白，肿瘤引起的EPF释放可造成假阳性结果[47]，所以此法不能作为早期妊娠诊断的常规方法。
2.3 妊娠相关糖蛋白检测法PAGs是反刍动物胎盘滋养层产生的一大类非活动性天冬氨酸蛋白酶[48]，在乳汁和血清中存在。用双抗体夹心ELISA方法检测授精30 d后奶牛血浆中的PAG1单克隆抗体，妊娠总准确率可达89.7%[49]。因PAGs检测法的检测成本及其对实验室和操作技术的要求都较高，无法大规模推广。
2.4 干扰素刺激基因检测法IFN-τ是一种反刍动物特有的妊娠识别信号，在妊娠14~25 d时由滋养层细胞分泌，可引起外周血细胞中干扰素刺激基因的上调表达。用荧光定量PCR检测发现，妊娠18 d牛外周血中ISG15和OAS1这两种ISG的表达量均显著高于未妊娠牛[50]，可作为早期妊娠诊断标志物，判别标准还需进一步研究。
3 母体外周血胎儿游离DNA检测法因为滋养层细胞介导的胚胎植入过程与肿瘤细胞侵袭过程中的免疫逃逸机制和血管形成都极为相似，又受到肿瘤患者外周血中存在癌源性的游离DNA[51]这一发现的启发，Lo等[52]推测孕妇外周血中可能存在胎儿游离DNA，并采用快速煮沸法提取DNA模板，利用PCR扩增出男胎Y染色体特异性DYS14序列，证实了这一猜测。随着表观遗传学的不断发展，发现母体和胎儿DNA甲基化存在差异性：Chim等[53]发现了肿瘤抑制基因maspin基因的启动子在母婴之间甲基化的差异，胎源性maspin基因呈低甲基化状态，而母源性maspin基因呈高甲基化状态；Chan等[54]发现了与maspin甲基化状态相反的RASSF1A基因，母源性呈现低甲基化，而胎源性呈现高甲基化，并以此建立新的胎儿游离DNA检测技术。胎儿游离DNA在人类临床应用较广，包括胎儿性别检测、胎儿RhD血型基因检测、胎儿单基因病(亭廷顿病、软骨发育不全、强直性肌营养不良、囊性纤维化病)、胎儿非整倍性(21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征)[55]以及早产、先兆子痫、妊娠剧吐、侵入性胎盘等妊娠相关疾病的诊断[56]。目前，对于孕畜外周血中胎儿游离DNA的研究主要是利用Y染色体特异基因(Y chromosome-specific gene, SRY)进行家畜胎儿性别鉴定：根据席继峰等[57]的研究，巢式PCR扩增SRY基因对奶牛胚胎性别鉴定的准确率在1~2月龄为60%，2~3月龄达到85.7%，4~8月龄可达92.3%；赵冰茹等[58]利用加热法和酚-氯仿法提取妊娠细毛羊外周血中的胎儿游离DNA，并用巢式PCR扩增SRY基因，鉴定母羊胚胎性别的平均准确率为81.25%，胎儿游离DNA的检出率随着孕周的增加而增加，此法具有非创伤性且高效低廉的优点，但准确率还有待提高。此外，已有关于山羊胎盘DNA甲基化参与妊娠早期发胎盘育的研究：程文强[59]研究发现，山羊胎盘中的SPP1基因启动子发生了甲基化，可以上调SPP1基因表达，进而促进滋养层细胞的侵袭；根据王瑞宏[60]的研究，在山羊胎盘中PHLDA2基因启动子甲基化低于其他组织，而PHLDA2表达量高于其他组织，且在妊娠第45 d变化最为显著，可作为山羊胎盘胎儿发育的信号标志。
4 总结与展望家畜早期妊娠诊断方法的研究趋势，总体上向着准确、超早期、简便、经济的方向发展。但目前应用于家畜妊娠诊断的方法，在具备各自优点的同时也存在着各自的局限性(表 1)。
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表 1 不同妊娠诊断方法在家畜生产中的应用效果 Table 1 The application effect of various pregnancy diagnostics in livestock production |
传统的临床诊断法具有方法简便、检测迅速且经济的优点，但准确率受人为操作影响较大；近年来发展迅速的实验室诊断法提高了准确率，使诊断时间向超早期发展，但存在检测成本高和检测标准不统一的局限性。对于家畜早期妊娠诊断的研究仍需要进一步的深入，寻求一种同时具备准确率高、超早期、简便经济且对母畜仔畜无伤害的诊断方法，为我国家畜养殖业的发展提供技术支撑。
在人类医学中，胎儿游离DNA以其检测的非创伤性、半衰期短及妊娠诊断结果不受上次妊娠影响的优势，成为人类产前诊断的重要方法。根据已有研究，胎儿游离DNA在妊娠母鼠、妊娠母牛及妊娠母羊的血浆中均可被检测到，可通过检测牛、羊外周血胎儿游离DNA中SRY基因的存在，对胎儿性别进行鉴定。SRY基因属于Y染色体上的特异性序列，虽然可用于胎儿性别鉴定，但是作为妊娠诊断的特异性标志物只适用于包含雄性胎儿的胎次，在单胎家畜的妊娠诊断上应用受限。而母胎甲基化差异性基因，可作为非性别依赖性胎儿DNA特异性标志物用于家畜的早期妊娠诊断。已有研究发现，山羊胎盘中的SPP1基因启动子呈高甲基化，PHLDA2基因启动子呈低甲基化，然而这些甲基化差异基因可否于胎儿游离DNA中被检测到，进而探索出家畜早期妊娠诊断的新方法，还需要进一步的研究。
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(编辑 郭云雁)