2. 西安交通大学生命科学与技术学院, 西安 710000;
3. 天康生物股份有限公司, 乌鲁木齐 830000
2. College of Life Science and Technology, Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710000, China;
3. Tecon Biology Co., Ltd., Urumqi 830000, China
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)疫苗是预防口蹄疫传播的有效措施。佐剂常用于增强口蹄疫灭活抗原(inactivated foot-and-mouth disease viral antigen，FMD-Ag)的免疫原性，从而增强其效力[1]。ISA-206油乳剂在FMD疫苗应用广泛，ISA-206油乳剂虽然佐剂效果优良，但易在注射部位产生肉芽肿等[2]，因此，开发低毒、免疫增强效果良好的佐剂是提高FMD疫苗效力的关键。
近年来，中药类佐剂、纳米乳剂、细胞因子佐剂、模式识别受体佐剂等被应用于FMD疫苗佐剂的筛选[3]。中药多糖作为FMD疫苗佐剂在提高疫苗效力的同时表现出良好的安全性，如黄芪多糖、白术多糖、川明参多糖、牛膝多糖等能够诱导FMD疫苗特异性IgG抗体、T细胞增殖、细胞因子分泌，并促进树突状细胞成熟[4-5]。研究表明，中药多糖亲水性高、稳定性好，具有良好的乳化和增稠作用，如沙蒿多糖、铁皮石斛多糖、党参多糖等作为乳化剂能降低油-水界面表面张力，提高乳液稳定性[6-7]。因此，中药多糖作为免疫增强剂具有改善FMD疫苗的免疫原性和稳定性的潜力。
新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)是菊科蒿属中药，多糖、黄酮、一枝蒿酮酸、生物碱等为其主要活性成分并具有多种药理活性，包括免疫增强活性，抗病毒，抗肿瘤的作用[8]。栽培一枝蒿相关制剂已应用于临床，如复方一枝蒿感冒颗粒用于抗流感治疗；一枝蒿酊剂用于治疗过敏性、神经性皮炎等[4, 9]。前期研究发现栽培一枝蒿粗多糖(cultivated A. rupestris L. crude polysaccharides，CARCP)作为卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)、流感疫苗和FMD疫苗的佐剂通过提高抗体水平、激活效应和记忆T细胞、增强CTL反应、活化树突状细胞等调控Th1/Th2反应，并具有良好的安全性[10-11]。
现用商品化FMD疫苗由FMD-Ag与ISA-206油乳剂通过乳化制备而成，乳化方法和乳化程度会影响疫苗的免疫效果。常用乳化方法有研磨法、注射器混合法、搅拌法、超声法等，研磨法和注射器混合法使用简便，但易造成抗原浪费；超声乳化方便快捷，但需要专用仪器和冰浴；搅拌乳化简单可控，常用于生产中[12-13]。基于前期的研究，选用CARCP作为FMD疫苗的佐剂，协同ISA-206油乳剂与FMD-Ag制备不同组合的FMD疫苗，皮下免疫小鼠后检测体液免疫和细胞免疫水平，比较不同乳化方法对FMD疫苗免疫效果的影响。由于不同的储存条件也会影响FMD疫苗的效力，为此探讨了不同储存条件下CARCP单独或协同ISA-206油乳剂对FMD疫苗稳定性的影响，为CARCP多糖佐剂作为FMD疫苗佐剂的研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料栽培一枝蒿多糖为实验室制备[11]，简述如下：粉末经无水乙醇脱色后，水提醇沉法制备CARCP，Sevag法除蛋白，苯酚/硫酸法测得多糖含量为35.65%。FMD-Ag(146S 9.06 μg·mL-1)、FMD疫苗、ISA-206来自天康生物股份有限公司；羊抗鼠HRP-IgG购自South biotech公司；3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(tetramethyl-benzidine, TMB)购自Sigma公司；RPMI 1640培养基购自Gibco公司；Perm/Wash buffer、兔抗鼠PE-CD3、FITC-CD4、FITC-CD8、APC-CD4、PE-CD44购自BD公司；其他试剂为国产分析纯。
1.2 不同乳化方法制备疫苗不同组合的FMD疫苗(水油比为46∶54)中，FMD-Ag和CARCP为水相，ISA-206为油相，采用搅拌和超声方法分别乳化制备FMD-Ag+ISA-206和FMD-Ag+ISA-206+CARCP，操作如下：(1)超声乳化：乳化15 s(20 kHz，200 W)，间歇1 min，反复乳化10 min。(2)搅拌乳化：自动混合机中300 r·min-1搅拌10 min。
1.3 动物与免疫分组雌性ICR小鼠(6~8周龄)购自新疆医科大学动物实验中心(合格证号SCXK(新)2016-0003)。在温度24 ℃±1 ℃，湿度50%±10%，12/12 h-光/暗循环下适应1周。动物伦理批件编号为BRGE-AE001。
将制备好的FMD疫苗于0、14 d经皮下途径免疫小鼠(100 μL·只-1，FMD-Ag 0.3 μg·只-1)，每组4只。FMD-Ag+ISA-206不同乳化方法试验分4组，包括：0.9% NaCl、商品化FMD疫苗、搅拌乳化FMD-Ag+ISA-206和超声乳化FMD-Ag+ISA-206。FMD-Ag+ISA-206+CARCP不同乳化方法试验分4组，包括：0.9% NaCl组、商品化FMD疫苗、搅拌乳化FMD-Ag+ISA-206+CARCP组和超声乳化FMD-Ag+ISA-206+CARCP组。FMD疫苗稳定性试验分11组，包括：0.9% NaCl、商品化FMD疫苗、FMD-Ag+ISA-206+CARCP，以及搅拌乳化制备的FMD-Ag+ISA-206和FMD-Ag+ISA-206+CARCP分别储存于4、25 ℃条件下放置0、30、180 d的8个试验组。
1.4 IgG抗体水平检测间接ELISA法检测IgG水平[10]，简述如下：1 μg·mL-1 FMD-Ag包被过夜，封闭1 h后加入14 d (1∶100) 和28 d (1∶1 000) 稀释血清孵育1 h。加入山羊抗鼠HRP-IgG放置1 h。TMB显色15 min后终止反应，测定OD450 nm。
1.5 T淋巴细胞亚群检测流式细胞术检测初免后28 d的脾T细胞亚群水平[11]，简述如下：制备脾单细胞悬液，将1×106单细胞悬液用Perm/Wash buffer洗涤后，PE-CD3、FITC-CD4；PE-CD3、FITC-CD8；APC-CD4、FITC-CD8、PE-CD44分别进行表面分子染色30 min，流式细胞仪检测。
1.6 疫苗稳定性试验将搅拌乳化的FMD不同疫苗组合分别储存于4、25 ℃条件下放置0、30、180 d后免疫小鼠，检测免疫后小鼠的体液和细胞免疫水平。
1.7 统计学分析试验结果采用“ x±s”表示，GraphPad Prism 5.0分析试验数据。数据用单因素方差分析后进行Turkey多重比较，*.P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 FMD-Ag+ISA-206不同乳化方法对体液免疫反应的影响初免后的IgG水平如图 1所示，与商品化FMD疫苗相比，搅拌乳化和超声乳化的FMD-Ag+ISA-206的IgG水平均无显著差异(P>0.05)；且两种乳化方法之间IgG水平也无显著差异(P>0.05)。
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A. 14 d IgG抗体水平；B. 28 d IgG抗体水平。ns. P>0.05 A. IgG antibody levels at 14 d; B. IgG antibody levels at 28 d. ns. P>0.05 图 1 FMD-Ag+ISA-206不同乳化方法对IgG抗体的影响(n=4) Fig. 1 Effect of different emulsification methods of FMD-Ag+ISA-206 on IgG antibody (n=4) |
初免后28 d脾T细胞活化状态如图 2所示，与商品化FMD疫苗相比，搅拌乳化FMD-Ag+ISA-206和超声乳化FMD-Ag+ISA-206的CD3+CD4+和CD3+CD8+ T细胞比例无显著差异(P>0.05)；两种乳化方法的T细胞比例差异不显著(P>0.05)。
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A.CD3+CD4+T细胞百分比；B. CD3+CD8+T细胞百分比。ns. P>0.05 A. Percentage of CD3+CD4+ T lymphocyte; B. Percentage of CD3+ CD8+ T lymphocyte. ns. P>0.05 图 2 FMD-Ag+ISA-206不同乳化方法对T细胞亚群的影响(n=4) Fig. 2 Effects of different emulsification methods of FMD-Ag+ISA-206 on T-cell subsets (n=4) |
初免后14及28 d，不同乳化方法制备的FMD-Ag+ISA-206+CARCP的IgG水平结果如图 3所示，搅拌乳化FMD-Ag+ISA-206+CARCP、超声乳化FMD-Ag+ISA-206+CARCP的IgG抗体水平与商品化FMD疫苗相比差异不显著(P>0.05)；且两种乳化方法所制备的FMD-Ag+ISA-206+CARCP之间的IgG抗体水平差异也不显著(P>0.05)。
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A. 14 d IgG抗体水平；B. 28 d IgG抗体水平。ns. P>0.05 A. IgG antibody levels at 14 d IgG; B. IgG antibody levels at 28 d IgG. ns. P>0.05 图 3 FMD-Ag+ISA-206+CARCP不同乳化方法对IgG的影响(n=4) Fig. 3 Effects of different emulsification methods of FMD-Ag+ISA-206+CARCP on IgG(n=4) |
初免后28 d T细胞亚群如图 4所示，搅拌乳化FMD-Ag+ISA-206+CARCP、超声乳化FMD-Ag+ ISA-206+CARCP的CD3+CD4+和CD3+CD8+ T细胞水平与商品化FMD疫苗相比无显著差异(P>0.05)；两种乳化方法所制备的FMD-Ag+ISA-206+ CARCP相比T细胞亚群水平差异不显著(P>0.05)。
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A. CD3+CD4+T细胞百分比；B. CD3+CD8+T细胞百分比。ns. P>0.05 A. Percentage of CD3+CD4+ T lymphocyte; B. Percentage of CD3+ CD8+ T lymphocyte. ns. P>0.05 图 4 FMD-Ag+ISA-206+CARCP不同乳化方法对T细胞亚群影响(n=4) Fig. 4 Effects of different emulsification methods of FMD-Ag+ISA-206+CARCP on T cell subsets (n=4) |
搅拌乳化FMD-Ag+ISA-206和FMD-Ag+ISA-206+CARCP在不同条件储存后免疫小鼠，IgG水平如图 5所示，4和25 ℃储存0 d时，FMD-Ag+ISA-206+CARCP组28 d IgG显著高于商品化FMD疫苗组(P < 0.05)。4和25 ℃储存30和180 d时，FMD-Ag+ISA-206+CARCP组IgG显著高于FMD-Ag+ISA-206组(P < 0.05)。
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A. 14 d IgG抗体水平；B. 28 d IgG抗体水平。*.P < 0.05, **.P < 0.01, ns. P>0.05 A. IgG levels at 14 d; B. IgG levels at 28 d. *.P < 0.05, **.P < 0.01, ns. P>0.05 图 5 不同储存条件下FMD-Ag+ISA-206+CARCP对IgG的影响(n=4) Fig. 5 Effect of FMD-Ag+ISA-206+CARCP on IgG under different storage conditions(n=4) |
搅拌乳化制备的疫苗于不同储存条件下免疫小鼠后，脾T细胞百分含量结果如图 6所示，与商品化FMD疫苗相比：4和25 ℃储存0 d时，FMD-Ag+ ISA-206+CARCP组的CD4+和CD8+ T细胞水平显著高于商品化FMD疫苗组(P < 0.05)，CD4+CD44+ T、CD8+CD44+ T细胞百分含量无显著性差异(P>0.05)。4 ℃储存30 d，FMD-Ag+ISA-206+CARCP组的CD4+、CD8+、CD4+CD44+、CD8+CD44+T细胞与FMD-Ag+ISA-206组相比没有显著差异(P>0.05)。4 ℃储存180 d, FMD-Ag+ISA-206+CARCP组CD4+、CD4+CD44+、CD8+CD44+ T细胞水平显著高于FMD-Ag+ISA-206组(P < 0.05)。25 ℃储存30和180 d时，FMD-Ag+ISA-206+CARCP组的T细胞水平显著高于FMD-Ag+ISA-206组(P < 0.05)。
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A. CD4+ T细胞比例；B. CD8+ T细胞比例；C. CD4+CD44+ T细胞比例；D. CD8+ CD44+ T细胞比例。*.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, ns. P>0.05 A. Percentage of CD4+ T cell; B. Percentage of CD8+ T cell; C. Percentage of CD4+ CD44+ T cell; D. Percentage of CD8+ CD44+ T cell. *.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, ns. P>0.05 图 6 不同储存条件下FMD-Ag+ISA-206+CARCP对T细胞亚群的影响(n=4) Fig. 6 Effect of FMD-Ag+ISA-206+CARCP on T cell subsets under different storage conditions(n=4) |
多糖协同油乳剂作为疫苗佐剂不仅能提高机体特异性免疫应答，还能提高油乳剂疫苗的稳定性，如山药多糖、黄芪多糖、白术多糖等[14]。现用商品化FMD疫苗为包含ISA-206油乳剂的W/O/W剂型，油乳剂与疫苗的乳化方法和储存条件会影响疫苗的效力和稳定性[15]。油乳剂因在体内不易降解而存在毒副作用，中药多糖不仅具有免疫调节活性，也可以增加油乳剂型疫苗水相的黏度，提高油乳剂疫苗的稳定性，是一种具有潜力的新型佐剂候选[6]。搅拌乳化和超声乳化常用于W/O/W油乳剂疫苗的制备，搅拌乳化可避免药物降解、易于实际生产，超声乳化分散粒径均匀，产量较小、工艺放大困难，适用于实验室研究[13]。为此，本研究选用了搅拌和超声乳化方法制备CARCP协同ISA-206的FMD不同疫苗组合，通过特异性抗体和T细胞水平比较不同乳化方法的异同；同时，阐明不同储存条件下CARCP对FMD疫苗稳定性的影响。
选择合适的乳化方法是确保疫苗效果的关键，抗体和T细胞是口蹄疫保护性免疫的重要效应分子和细胞[16]。本研究选用搅拌和超声乳化混合FMD疫苗的不同组合，以商品化FMD疫苗为对照，通过检测免疫后小鼠的体液及细胞免疫水平，比较乳化方法对FMD-Ag+ISA-206免疫效果的影响。结果显示，搅拌和超声乳化制备的FMD-Ag+ISA-206免疫后小鼠血清中的IgG水平和脾中的CD4+和CD8+ T细胞亚群水平没有差异。在此基础上，观察了CARCP协同ISA-206采用搅拌和超声乳化制备FMD疫苗的佐剂效果。结果表明，搅拌和超声乳化制备的FMD-Ag+ISA-206+CARCP的IgG水平及CD4+和CD8+ T细胞亚群没有差异。这些结果初步表明，搅拌及超声乳化方法对FMD疫苗的免疫效果没有差异，同时也说明在实验室建立的搅拌乳化方式与FMD疫苗规模生产的乳化方法没有差异，为CARCP作为FMD疫苗佐剂的理论研究提供重要的试验参考。
W/O/W剂型疫苗的稳定性对于维持机体免疫反应至关重要。多糖高亲水性、高黏度等特性，可以改善疫苗体系的稳定性[6, 17]。为了探究CARCP协同ISA-206对FMD疫苗稳定性的影响，本试验选用搅拌乳化制备疫苗FMD+ISA-206和FMD-Ag+ ISA-206+CARCP，放置在不同温度(4和25 ℃)和不同储存时间(0、30和180 d)后免疫小鼠，检测免疫后的抗体水平和T细胞水平[16]。试验结果表明，在4和25 ℃放置30和180 d后，与没有添加CARCP组相比，CARCP的添加促进了IgG抗体的持续产生，CD4+、CD8+、CD4+CD44+、CD8+CD44+ T细胞也表现出相同的趋势。这些结果显示W/O/W型疫苗储存超过一定温度和时间会导致疫苗免疫原性和稳定性下降[15]，同时表明添加CARCP能够维持FMD疫苗的稳定性，与菊粉多糖、刺五加多糖等中药多糖的研究结果相似[6, 17]，提示CARCP作为佐剂和乳化剂增强了疫苗的稳定性和效力。
4 结论搅拌和超声乳化制备的FMD-Ag+ISA-206+CARCP免疫效果没有差异。CARCP协同ISA-206油乳剂促进了FMD疫苗的稳定性和效力，为CARCP作为FMD疫苗的免疫增强剂和乳化剂的研究提供重要的试验依据。
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(编辑 白永平)