2. 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所, 杭州 310021;
3. 浙江省台州市动物疫病预防控制中心, 台州 317700
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;
3. Taizhou Animal Disease Prevention and Control Center, Taizhou 317700, China
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)的病原体。APP血清型众多,血清型与不同的病程相关[1]。根据荚膜抗原的差异,APP可分为1~15型[2-3]。Sárközi等[4]、Bossé等[5-6]和Stringer等[7]在无法分型的菌株中发现了血清16~19型。截至目前,APP已知19个血清型。
溶血毒素(Actinbacillus pleuropneumoniae-RTX,Apx)是APP最主要的毒力因子,包括ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣA毒素[8],它们由相邻的按特定顺序排列的4个基因CABD组成的操纵子调控。ApxⅠ、ApxⅢ操纵子有完整的CABD基因,而ApxⅡ操纵子只有C基因和A基因[9]。不同血清型菌株间的毒力差异是由所携带的Apx毒力因子模式决定的[10]。因此,APP的毒力被认为与血清型密切相关[11]。
APP血清型间抗原性存在差异,交叉保护力低[12],不同地区流行的血清型不尽相同[13]。因此,将特定区域一定时间内APP血清型的流行分布情况调查清楚,可及早采取针对性预防措施。为此,本研究调查了近十年来浙江省APP的流行情况,以期为探索有效的防控措施提供支持。
1 材料与方法 1.1 主要试剂TaKaRa TaqTM试剂盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit试剂盒(TaKaRa Bio中国有限公司);蛋白酶K、0.1 mol·L-1 Tris(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
1.2 菌株来源本研究所用的64株APP分离株均由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所猪病研究室分离鉴定保存。其中,63株是肺分离株,1株是关节分离株。样品主要来自浙江省内猪场,样品信息详见表 1。
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表 1 样品信息 Table 1 Sample information |
参考Stringer等[14]及Sthitmatee等[15]的血清分型方法及毒素测定方法合成引物,本研究所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.4 PCR扩增采用蛋白酶K法提取基因组DNA,对64份样品进行血清分型及毒素测定。使用Taq酶25 μL反应体系进行PCR扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果 2.1 血清分型结果及分析血清型鉴定结果如图 1所示。64个菌株分属7个血清型,其中,8型24株(占37.5%);5型11株(占17.19%);7型9株(占14.06%);15型8株(占12.5%);2型、12型、19型各4株(各占6.25%)。
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图 1 2012—2021年各血清型菌株的检出数量及血清型分布 Fig. 1 Number of isolates and serovar distribution from 2012 to 2021 |
由于我国猪群中尚未有关于血清19型菌株感染的报道,为进一步验证本研究中发现的4株分离株为血清19型菌株,将测序结果在NCBI上比对。测序结果与血清19型参考菌株7213384-1(GenBank登录号: MT468887.1)的相似性为99.18%~100.00%,可确定其为血清19型菌株。
各血清型在不同年份的分布如图 1所示,血清5、7、8、15型出现在较多的年份中。血清8型在2018年之后成为浙江省的优势血清型。血清19型出现在2017、2019和2021年,表明19型菌株已在浙江省猪群中持续存在。
2.2 毒素检测结果及分析在64个分离株中,毒素基因ApxIVA及ApxⅡCA的检出率为100%。ApxⅠBD和ApxⅢBD检出率分别为96.88%和92.19%。而ApxⅢCA和ApxⅠCA的检出率只有和65.63%和28.13%。用毒素基因的扩增结果表示APP的毒力因子模式,所有毒素基因扩增结果均相同的归为同一毒力因子模式,本研究共鉴定出12种不同的毒力因子模式(表 2)。血清5和7型毒力因子模式最为复杂, 分别有3种;血清2型和8型分别有2种;血清12、15、19型都只检测出1种毒力因子模式。其中,血清12型、19型的毒力因子模式跟8型的其中一种毒力因子模式相同。研究结果表明,同一血清型的不同菌株之间会存在不同的毒力因子,不同血清型的菌株也可能会携带相同的毒力因子,血清型与所携带的Apx毒素基因之间不存在必然联系。
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表 2 APP分离株的毒力因子模式 Table 2 Virulence gene profiles of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates |
血清学分型是APP最重要的分类方法。血清1、2、5、7、8型在世界范围多个国家出现频率相对较高,其中,2型是世界范围内多个国家检出率最高的血清型[16-18]。我国学者的研究表明,国内猪场中血清1、3、7型出现的频率最高,其他血清型出现的较少,个别省份地区也有不同的优势血清型[19-20]。
本研究发现血清8型在浙江占主导地位,其次为血清5、7、15型。而在国内其他地区检出率较高的血清1、3型未被检出。此外,血清19型首次在我国猪群中检出。作者发现该血清型菌株最早于2017年就在浙江地区传播,直至2021年仍有流行,因此有必要对该血清型菌株的流行病学及危害进行持续跟踪研究。本研究结果表明,浙江省的APP优势血清型与国内其他地区有明显差异。
在针对APP疫苗的制备过程中,必须包含溶血毒素。把具有相同Apx毒素基因的APP分为一类,或许有可能为研制更有效疫苗提供线索[21]。除所有血清型APP均产生的ApxⅣA外,本研究检出数量最多的毒素基因为ApxⅠBD、ApxⅡCA和ApxⅢBD,因此针对这3个毒素制备的亚单位疫苗可能对浙江省猪传染性胸膜肺炎的防控带来更好的效果。
4 结论本研究表明胸膜肺炎放线杆菌浙江分离株主要为血清8型,并在国内首次检出血清19型,且菌株的血清型与其携带的Apx毒素种类之间不存在必然联系。
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(编辑 白永平)