2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Chengdu 610041, China
牛腺病毒3型(bovine adenovirus type 3, BAdV-3)为腺病毒科哺乳动物腺病毒属的成员,是引起牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex,BRDC)的重要病原之一[1-2]。在自然条件下,单独感染牛时临床表现轻微或无症状,常常伴随其他呼吸道病原混合感染,主要引起发热、犊牛肺炎、支气管炎和肠炎等症状[3-5]。BAdV-3是无囊膜的线性双链DNA病毒,基因组大小约34 kb,由六邻体(hexon)和五邻体(penton)构成核衣壳,其中,五邻体(penton)又由基部与纤突(fiber)组成[6-8]。fiber分为3个结构域:尾区(tail)、轴区(shaft)和旋钮区(knob),其长度因不同的血清型而异,在BAdV-3感染细胞时,fiber能与细胞受体相互作用,负责病毒的趋向性和中和抗体的产生[9-11]。其中fiber轴区的长短以及旋钮区的变异对病毒的组织嗜性和免疫逃避起决定性作用[12-15]。
自Darbyshire于1965年在英国首次从健康牛结膜中分离出BAdV-3后,BAdV-3又在多国被检出,地域涵盖亚洲、欧洲、北美、南美和非洲[3, 16-21]。血清学调查显示,在比利时、芬兰、伊朗、土耳其及波兰等地的牛群中,BAdV-3抗体阳性率为46.7%~92.3%[22-26],最近日本学者Ng等[27]对50头有BRDC症状的加州乳牛通过宏基因组学的方法对其鼻拭子中的病毒进行检测,结果显示,BAdV-3在鼻腔分泌物中阳性检出率高达48%,与BRDC的发生显著相关(P < 0.000 1),说明BAdV-3不仅在世界范围内广泛流行,呈现高检出率,并且与呼吸道疾病的发生有紧密联系。2009年,国内首次报道从黑龙江的1头患有呼吸道疾病病牛的鼻拭子中分离到1株BAdV-3,命名为HLJ0955(传统型),证实了国内BAdV-3的存在[28-29]。随后严昊[30]对哈尔滨市周边地区的牛场进行了检测,BAdV-3血清阳性率为20.6%。2015年,杨萌[7]对我国咸阳市部分奶牛场进行血清学调查,阳性率为46.65%,说明BAdV-3已在国内普遍流行。2020年,本实验室申燕等[20]对四川省11个引种肉牛场中患BRDC的牛进行检测,对采集的108份BRDC临床样本进行荧光定量PCR检测,BAdV-3检出率高达78.7%,并成功分离到1株fiber轴区自然缺失的新型毒株(BO/YB24/17/CH),并且证实该缺失株在引种肉牛中普遍存在,目前,在国外尚无该缺失株报道。用该毒株接种BALB/c小鼠进行致病性研究,发现小鼠除了出现与传统型毒株(HLJ0955)感染相似的肺部组织病变外,24只小鼠中有7只还出现了BAdV-3感染不常见的脾肿胀、病毒血症等症状,并且在包括脾在内的多个器官都能检测到病毒,而毒株HLJ0955感染小鼠后仅能从肺中分离得到该种病毒[31],说明该fiber轴区缺失型与国内之前报道的传统型相比致病性更强,并且可能已在我国牛群中广泛分布和流行,具有独特的进化趋势,应引起足够的重视。
目前,国内有关BAdV-3的血清学流行病学资料比较普遍,但关于病原检测报道较少[7, 30],BAdV-3的分子特征资料匮乏。因此为了进一步了解BAdV-3在国内的分布与流行情况,确定目前国内流行毒株的分布及其分子特征,本研究基于本实验室之前建立的检测BAdV-3的TB Green Real-time PCR方法[20],对国内6个省(四川省、山西省、河南省、河北省、江苏省和内蒙古自治区)的9个规模化养牛场,包括奶牛在内的140份鼻拭子样本展开感染状况调查,并对其中的阳性样本进行fiber轴区基因检测,进一步对部分BAdV-3阳性样本进行fiber基因序列片段扩增,分析其分子特征。本研究对我国部分地区BAdV-3感染状况开展调查,在国内外首次对fiber轴区基因缺失型和传统型进行统计分析,了解BAdV-3的遗传进化规律,为国内对该病的防控以及BAdV-3疫苗的研制提供支持。
1 材料与方法 1.1 临床样本2021年10月—2022年1月,于国内6省区(四川、山西、河南、河北、江苏、内蒙古)的9个规模化养殖场分别采集有呼吸道症状的奶牛、肉牛的鼻腔拭子140份(本地牛,年龄4~9月,样本信息见本文结果部分),所有待检测样本均采用低温运输,装于25 mL离心管中于-80 ℃超低温冰箱保存。
1.2 试剂及仪器Virus DNA Kit核酸提取试剂盒(天根生化北京科技有限公司);TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、HiPer plus Taq HiFi PCR mix、DNA Marker 2000和E. coli DH5ɑ感受态细胞(宝生物工程大连股份有限公司);Gel Extraction Kit胶回收试剂盒(OMEGA公司);pMD19-T克隆载体(日本TaKaRa公司);核酸染料GoldenView(西安赫特生物科技有限公司)。金属浴(杭州博日科技有限公司),普通PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司)、QuantStudio 3荧光定量PCR仪(美国Thermoforma公司),核酸电泳仪、凝胶成像系统VersaDoc2000 (Bio-Rad公司)。
1.3 临床样本处理及核酸提取将采集的140份鼻拭子,按1∶5的比例分别加入灭菌PBS 5 mL并振荡混匀,反复冻融3次后,经8 000 r·min-1 4 ℃离心5 min,使用灭菌的枪头吸取上清液400 μL于灭菌的EP管中(规格1.5 mL)。采用Virus DNA Kit核酸提取试剂盒提取样本DNA,提取后于-80 ℃保存备用。
1.4 临床样本BAdV-3 Real-time PCR检测采用本实验室申燕等[20]建立的基于TB Green检测BAdV-3的Real-time PCR方法,使用其设计的以hexon基因为靶基因的特异性检测引物BAdV-3-120,引物信息见表 1。qPCR反应体系为20 μL, 包括TB Green Premix ExTaq Ⅱ 10 μL, 上下游引物各1 μL, 超纯水6 μL,模板2 μL,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,62 ℃ 20 s,循环数为40;熔解段:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,循环数为1。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer information |
利用MEGAX软件分析比对GenBank中登录的全部13条BAdV-3 fiber基因序列(登录号为AC_000002.1、AX338887.1、AR178749.1、AF030154.1、BD133132.1、BD409754.1、DD453126.1、DL136070.1、NC001876.1、HV975272.1、JN381195.1、MN912513.1),根据它们共同的保守区域,利用Primer5软件设计了1对在fiber轴区跨缺失端特异性基因检测引物BAdV-3-426(表 1),PCR扩增反应体系为25 μL,2× M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 12.5 μL,上下游引物各1 μL,ddH2O 8.5 μL,模板2 μL。PCR反应条件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 25 s,55 ℃ 25 s,72 ℃ 10 s,35个循环;72 ℃ 5 min。
1.6 部分阳性样本fiber基因PCR扩增为了解BAdV-3的分子特征,设计了1对覆盖了fiber缺失区域的引物BAdV-3-938(表 1)。PCR反应条件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 25 s,56 ℃ 25 s,72 ℃ 15 s,35个循环;72 ℃ 5 min。对8个阳性场随机选取了14个强阳性及单感染样本进行fiber基因扩增。回收大小为938 bp左右的所有PCR扩增产物的目的片段并纯化,纯化后的产物在16 ℃连接到pMD19-T载体上。随后将连接载体的产物转化到DH5α感受态细胞中,筛选出阳性克隆并提取质粒,并进行测序。测序后截取fiber基因目的片段,用MEGA 7、DNASTAR Lasergene7.1软件进行进一步的分子进化树分析和同源性分析。
2 结果 2.1 临床样本BAdV-3检测结果在国内6个省区的9个规模化养牛场(四川省、山西省、河南省、河北省、江苏省和内蒙古自治区)采集牛呼吸道样本,并用特异性的qPCR方法检测BAdV-3。结果显示:从140份样本中检测出BAdV-3阳性样本共51份,BAdV-3总阳性率为36.4%(51/140),场群阳性率88.9%(8/9)。其中四川和河南省检出率分别高达82.9%(29/35)和83.3%(10/12),江苏省、山西省和内蒙古自治区的检出率分别为20%(3/15)、20%(4/20)和10.4%(5/48),河北省未检出(0/10)。其中100份成年肉牛呼吸道样本中BAdV-3的检出率为26%(26/100),场群阳性率为85.7%(6/7);40份奶牛呼吸道样本中BAdV-3的检出率为62.5%(25/40),场群阳性率为100%(2/2)(表 2)。
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表 2 140份鼻拭子检测结果及样本信息 Table 2 Detection results and sample information of 140 nasal swabs |
为了确定目前在国内流行的优势毒株,对我国6个省的51份阳性样本进行fiber轴区基因检测。PCR分型结果显示,传统型目的条带为426 bp, 缺失毒株目的条带为189 bp(图 1)。缺失位置与数量一致,轴区连续缺失237个碱基对(79个氨基酸),统计结果传统型占总阳性率80.4%(41/51),场群阳性率为77.8%(7/9);缺失型阳性率占总阳性率19.6%(10/51),场群阳性率为33.3%(3/9)。且fiber基因缺失的毒株仅在四川(奶牛场A、肉牛场B)和河南(肉牛场H)两省检测到,检出率分别为24.1%(7/29)和30%(3/10),场群阳性率分别为100%(2/2)和100%(1/1)。其余省份未发现fiber缺失型(表 2)。
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M. DNA相对分子质量标准;P. 阳性对照;N. 阴性对照;1~5.基因缺失型毒株;6~10.传统型毒株 M. DNA marker I; P. Positive control; N. Negative control; 1-5. Deleted strains; 6-10. Conventional strains 图 1 BAdV-3 PCR分型检测 Fig. 1 PCR typing of BAdV-3 |
对8个阳性场随机选取了14个强阳性及单感染样本进行fiber基因序列片段扩增,将克隆出的14个阳性样本的fiber片段与GenBank中所有的BAdV-3的fiber基因进行核苷酸比对并构建系统发育进化树。结果14个阳性样本之间的相似性为60.5%~100%,14个阳性样本中有3株缺失毒株,与PCR分型结果一致,符合率为100%(14/14)。3株缺失型毒株与8个中国毒株(MN912525.1、MN912531.1、MN912529.1、MN912527.1、MN912526.1、MN912530.1、MN9125328.1、MN912513.1)聚为一支(图 2),其长度均为695 bp,与传统毒株相比缺失了243 bp(除了包含上述79个连续缺失的氨基酸,还有两个点缺失)。GenBank中所有fiber缺失株序列的相似性为99.5%~100%;另外11株聚为一支,长度均为938 bp,为传统型,相似性为99.6%~100%,与HLJ0955毒株相比,相似性为90.0%~90.6%。
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GenBank登录号和病毒名称的缩写在分支的末端表示,B. 牛;C. 犬;F. 禽;Fr. 青蛙;H. 人类;P. 猪;T. 火鸡。▲表示本研究毒株,●表示中国毒株 The GenBank login number and the abbreviation of the virus name are indicated at the end of the branch, B. Cow; C. Dog; F. Bird; Fr. Frog; H. Human; P. Pig; T. Turkey. ▲ indicates the strain studied in this study, and ● indicates a Chinese strain 图 2 fiber基因片段进化树分析 Fig. 2 Evolutionary tree analysis based on fiber gene segment |
自2009年于作等[28]从黑龙江省分离到第1株BAdV-3,BAdV-3已在我国多个地区被检出,包括黑龙江省、陕西省、山东省、辽宁省及四川省等,近几年流行病学调查显示,在哈尔滨市、咸阳市、四川省等地的牛群中阳性率为20.6%~78.7%[7, 20, 29-31]。本研究对国内6个省区的9个规模养牛场进行BAdV-3病原PCR检测,140份样本中共检出51份BAdV-3阳性,总平均阳性率为39.87%,与之前报道的检出率相符,说明BAdV-3已在国内牛群中普遍流行。其中,100份成年肉牛呼吸道样本中BAdV-3的检出率为26%(26/100);40份奶牛呼吸道样本中BAdV-3的检出率为62.5%(25/40),说明BAdV-3不仅广泛感染我国的肉牛,在奶牛中也普遍感染,甚至有更高的检出率,应该引起足够重视。
本调查通过对51份阳性样本进行fiber轴区基因检测,确定目前在国内哪一种基因型为优势毒株,结果显示:传统型占总阳性率80.4%(41/51),场阳性率为77.8%(7/9);缺失型阳性率占总阳性率19.6%(10/51),场阳性率为33.3%(3/9),说明目前在国内流行的BAdV-3主要是传统型。fiber自然缺失的毒株仅在四川和河南两省检测到,并在某些场呈现与传统型混合感染的情况,在这两省中缺失型阳性率检出率分别为24.1%(7/29)和30%(3/10);传统型检出率分别为75.9%(22/29)和70%(7/10)。这与之前申燕等[20]对四川省11个引种肉牛场中患BRDC的牛进行检测,发现来自5个省份(山东、辽宁、山西、黑龙江和内蒙古自治区)的引种肉牛都检测到缺失型BAdV-3的结果有所不同。造成这种差异的原因可能有两个:一是本研究采集样本的时间、地点以及样本量与申燕等不一样,个别牛场采集样品数过少,可能产生假阴性结果;二是本次采集的样本为各省当地牛,不同于之前申燕等采集的四川省11个引种肉牛场样本。研究报道显示,BAdV-3存在跨种间传播,除了感染牛外,在异种动物山羊、绵羊以及羊驼中也有检测到BAdV-3阳性抗体[22, 32-34],因此申燕等研究中的牛可能在引种过程中被四川当地牛或其他携带BAdV-3的异种动物所感染。所以申燕等的流调结果可能不能代表fiber缺失型在整个国内的流行情况,仅代表四川省的情况。本试验来自四川省的样本BAdV-3检出率为82.9%,与申燕等之前报道的78.7%的BAdV-3检出率相近, 进一步证实了以上推论。
综上表明,BAdV-3已在我国牛场中广泛分布,目前,流行的主要以传统型毒株为主。但由于本研究自身的局限性,样本仅来源于国内6个省区,为进一步了解缺失型毒株在国内的流行情况,应该在全国展开更全面的调查。鉴于fiber轴区缺失型对BALB/c小鼠的致病性强于传统型,目前应对四川和河南地区的养牛场实施重点监控,并加强该缺失型的流行病学调查,尽量避免该型由于引种等原因在其他省发生流行,同时应对fiber轴区缺失型毒株对牛的致病性和致病机理展开进一步研究,建立科学合理的防控体系。
4 结论BAdV-3已在我国牛场中广泛分布,目前流行的主要以传统型毒株为主,fiber轴区缺失毒株在我国具有独特的地域分布,主要在四川和河南省流行。本研究丰富了国内BAdV-3的感染状况调查,为了解我国BAdV-3的流行及独特的遗传进化规律提供了帮助。
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(编辑 白永平)