2. 西南大学发光分析与分子传感教育部重点实验室, 重庆 400700;
3. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193
2. Key Laboratory of Luminescence Analysis and Molecular Sensing (Southwest University), Ministry of Education, Chongqing 400700, China;
3. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China
犬乳腺肿瘤(canine mammary tumor，CMT)为仅次于皮肤肿瘤的第二位雌性犬常见肿瘤疾病，发病率占据未绝育母犬肿瘤疾病的50%~70%，且其中约50%为恶性[1-2]。犬不仅与人类处于相同环境，其生物学行为及疾病的临床表现也均相差无几，两者在该病的相对年龄阶段及发病率类似[3-6]。常规检测手段包括临床诊断、实验室检查(血常规和生化等)、超声、X线、细胞学诊断及组织病理学等对CMT仍具局限性。对于大部分病例，手术切除仍是最主要的治疗手段，但仅约50%的恶性乳腺肿瘤病例符合手术条件[7-8]。肿瘤细胞可通过淋巴及血液转移至肺、骨骼、肝以及大脑等脏器，从而大幅度缩短患犬存活时间及降低存活率[9-11]。因此，筛选较为可靠的CMT预后指标以及标志物对于兽医临床工作意义重大。高通量测序技术的发展为精准医学提供了强大的支持。可在极短时间内实现对各种疾病进行基因筛查。该技术已广泛用于人类医学的基础研究与临床诊疗中，但在CMT的相关研究中还未多见[12-16]。CMT相关基因表达及调控机制仍待进一步探索。研究发现，有氧糖酵解现象在某些人类恶性肿瘤疾病中表现活跃，能够加快肿瘤细胞增殖并缩短患者生存期[17]。作为细胞糖酵解环节中的第一限速酶，HK2参与了人类多种肿瘤疾病的发生与发展，但HK2在犬体内正常组织以及肿瘤病灶的表达情况，及其与犬乳腺肿瘤进展与预后关联性未见报道。本研究通过高通量转录组测序技术筛查出HK2在犬乳腺肿瘤组织中为显著差异表达基因，在此基础上，本课题将HK2作为研究对象，探讨其在犬不同组织类型以及乳腺肿瘤患犬中的表达情况，分析其与生存预后关联性。以期为CMT的基因诊断提供新的思路与方法。
1 材料与方法 1.1 试验动物与组织样本收集2016—2018年在西南大学教学动物医院、中国农业大学教学动物医院以及重庆市友好动物医院等诊疗机构接受外科手术切除的121例犬乳腺肿块组织样本(所选病例均仅进行了彻底的乳腺肿块切除，并通过组织病理学确认癌旁组织结构，未同时进行子宫卵巢摘除术)；采集15例健康试验犬正常乳腺样本以及来自3只健康试验犬的其他24个组织脏器类型(包括肾上腺、膀胱、脾、肝、脂肪、子宫、骨髓、卵巢、脑、皮肤、胃、胰腺、舌、骨骼肌、肾、脊髓、小肠、肠淋巴结、心、肺、结肠、气管、甲状腺和食道)(动物伦理审查编号：IACUC-20160910-02)。所有临床病例术前均获得动物主人知情同意，详细记录各病例动物主人联系方式、病史以及临床症状等相关信息。所有试验犬均为健康犬，所有动物均在吸入麻醉情况下获取组织样本。所有组织样本均在无菌手术室内由经验丰富的外科医生摘取，每份样本离体后均分别保存于甲醛溶液和液氮中备用，用于后续组织病理学诊断、免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)检测以及实时定量PCR(quantitative real time PCR，qPCR)检测；随机挑选3份恶性CMT样本以及3份正常乳腺组织样本进行高通量转录组测序。
1.2 主要试剂与仪器一次性切片刀片(德国Leika公司)，粘附载玻片(江苏世泰实验器材有限公司)，1%盐酸-乙醇、EDTA免疫组化抗原修复缓冲液(福州迈新生物技术开发有限公司)，无水乙醇、二甲苯、甲醇、双氧水均购自重庆川东化工(集团)有限公司，醇溶伊红、中性树胶、免疫组化湿盒、苏木素、PBS磷酸盐缓冲液、CBS柠檬酸盐缓冲液、DAB显色液、抗体稀释液、酶标羊抗鼠/兔二抗、Ki67-鼠源单抗均购自广州深达生物制品技术有限公司，HK2鼠源单抗(美国Gene Tex公司)，总RNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，SYBRGreen PCR试剂盒及逆转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。
呼吸麻醉机(首美达实业股份有限公司)，心电监护仪(美国Masimo公司)，全自动组织脱水机(天津爱华医疗器械有限公司)，石蜡组织切片机、台式离心机(赛默飞世尔科技公司)，石蜡包埋机、摊片烤片机(湖北康强科技发展有限公司)，显微成像系统(奥林巴斯株式会社)，核酸浓度测定仪(杭州奥盛仪器有限公司)，Real-time PCR检测(Roche有限责任公司)。
1.3 组织病理学诊断将采集固定的组织样本放入全自动脱水机梯度脱水：75%乙醇60 min、85%乙醇100 min、95%乙醇100 min、95%乙醇100 min、无水乙醇90 min、无水乙醇100 min梯度脱水、二甲苯两缸透明处理、三缸石蜡浸蜡处理。脱水石蜡包埋，自动切片机切片。蜡片置入40 ℃水面展片，烤片15 min。脱腊处理：三缸二甲苯各5 min、100%乙醇4 min、95%乙醇3 min、90%乙醇2 min、80%乙醇1 min、自来水1 min。苏木素染色5 min。流水冲洗15 min。1%盐酸-乙醇分化3 s。稍水洗后温水返蓝10 s。流水冲洗2 min。醇溶伊红染色液染色1 min。梯度脱水后使用中性树脂封片。
犬乳腺肿瘤的类型与分级参照Goldschmidt等[18]推荐的原则，同时观察肿瘤大小、脉管浸润情况与肿瘤坏死情况。组织病理切片结果由4位经验丰富的临床病理学专家分别独立判读。
1.4 高通量转录组测序以正常犬乳腺组织作为对照组，犬恶性乳腺肿瘤组织作为试验组。在获取2组样本组织病理学判读结果后，随机各抽取3份，干冰运输送北京诺禾致源生物科技有限公司进行高通量转录组测序。样本处理方法：提取总RNA后，琼脂凝胶电泳分析RNA的降解与污染程度；RNA纯度(OD260 nm/OD280 nm比值)、浓度与完整性分别使用纳米分光光度计、Qubit®RNA分析试剂盒和Agilent 2100进行检测；寡核苷酸(dT)通过多尾结合来富集RNA，6-碱基随机引物、缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶I将mRNA片段逆转为双链cDNA，并纯化；在末端对纯化的cDNA进行修复并添加一条尾巴连接到测序连接器；使用AMPure XP磁珠选择片段大小；最后通过PCR富集cDNA文库。文库检查后进行序列分析(文库有效浓度＞2 nmol·L-1)。使用HTSeq软件分析每个样本中的基因表达水平。采用H-cluser、K-means和SOM方法对差异表达基因的相对表达水平进行聚类分析。通过GOseq软件方法对基因本体(GO)进行富集和分析，以筛选差异表达基因。KEGG数据库用于DEGs的路径富集与分析。本研究进行了3次生物学重复。采用统计学分析，以Padj＜0.05为筛选差异表达基因的标准。
1.5 qPCR检测qPCR检测25个组织器官(含犬正常乳腺组织)以及CMT中HK2的mRNA相对表达水平。按照试剂盒要求提取组织总RNA，测定核酸浓度。试剂盒进行cDNA合成，RNA量(100~500 ng)。内参mRNA为GAPDH。使用Primer 5软件设计qPCR引物序列(表 1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将反转录得到的cDNA模板配制反应液(20 μL)进行qPCR反应。
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表 1 qPCR引物序列 Table 1 Primer sequences used for qPCR |
石蜡切片烤片60 min(60 ℃)后脱蜡处理：三缸二甲苯各5 min、100%乙醇4 min、95%乙醇3 min、90%乙醇2 min、80%乙醇1 min、自来水1 min。3%甲醇-双氧水在室温下浸泡10 min。PBS洗涤2次(每次5 min)。将切片浸入0.01 mol·L-1、pH6.0 CBS缓冲液或pH8.0 EDTA中，高压锅高压抗原修复5 min。切片自然冷却至室温后PBS洗涤2次。滴加5%~10%山羊血清封闭液(1∶10~1∶20倍稀释)，室温孵育30 min封闭。一抗4 ℃过夜孵育。PBS洗涤2次。二抗37 ℃孵育30 min。PBS洗涤2次后，DAB室温下显色5~10 min。自来水稍冲洗后，使用苏木素复染3 min。自来水冲洗、脱水与封片。HK2染色结果由4位具有经验的临床病理学专家分别独立判读，并在显微镜下对每个样本的切片进行拍照保存，照片使用IPP软件进行统计分析。Ki-67指数根据阳性表达细胞占比进行评分：0(无表达)、1+(＜10%)、2+(10%~50%)以及3+(＞50%)。对HK2蛋白表达情况进行评定后，结合组织学特征分析HK2蛋白表达与犬乳腺肿瘤临床参数及预后之间的相关性。
1.7 数据统计分析使用GraphPad Prism5.0或SPSS 18.0对数据进行统计分析。分类变量数据(例如动物品种和肿瘤类型等)以百分比表示；连续变量数据(例如动物年龄和生存时间等)以平均值或平均值±标准差表示，采用t检验进行数据分析。使用卡方检验分析HK2蛋白的表达情况与临床各参数及预后间的相关性。使用Kaplan-Meier分析犬术后生存曲线。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 临床病例信息与组织病理学诊断该研究共收集来自小动物临床手术切除的121例犬乳腺肿块病例样本。患犬包括25个犬种，其中，贵宾犬数量最多，29/121(24.0%)。患犬年龄跨度为3~15岁，平均年龄为9.8岁，其中，102只犬(84.3%)未进行绝育手术。本研究的患犬中患有乳腺增生10例(8.3%); 良性乳腺肿瘤33例(27.3%)(相关病理切片见图 1，表 2为病理学分类情况)；恶性乳腺肿瘤78例(64.5%)(相关病理切片见图 2，表 3为病理学分类情况)。恶性乳腺肿瘤中浸润性乳腺癌的组织学等级：I级25例、II级45例和III级6例，其他2例间叶来源的恶性肿瘤(纤维肉瘤和骨肉瘤各1例)均为II级[18]。54例(69.2%)恶性乳腺肿瘤出现坏死灶，14例(17.9%)存在脉管侵犯。
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A.正常乳腺；B.乳腺增生；C.复合性腺瘤；D.混合性瘤；E.简单性腺瘤；F.纤维腺瘤 A. Normal mammary gland; B. Adenosis; C. Complex adenoma; D. Mixed tumor; E. Simple adenoma; F. Fibroadenoma 图 1 犬正常乳腺、乳腺增生和良性乳腺肿瘤病理切片(100×，400×) Fig. 1 Pathological section of normal mammary gland, adenosis and benign mammary tumors in dogs (100×, 400×) |
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表 2 33例犬良性乳腺肿瘤组织病理学分类 Table 2 Histopathological classification of 33 cases of canine benign mammary tumors |
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A.正常乳腺；B.复合性腺癌；C.实体癌；D.简单性腺癌；E.混合性癌；F.鳞状细胞癌；G.梭形细胞癌；H.粉刺癌；I.黏液癌；J.富脂质癌；K.骨肉瘤；L.纤维肉瘤 A. Normal mammary gland; B. Complex carcinoma; C. Solid carcinoma; D. Simple carcinoma; E. Mixed carcinoma; F. Squamous cell carcinoma; G. Spindle cell carcinomas; H. Comedocarcinoma; I. Mucinous carcinoma; J. Lipid-rich carcinoma; K. Osteosarcoma; L. Fibrosarcoma 图 2 犬正常乳腺与恶性乳腺肿瘤病理切片(100×，400×) Fig. 2 Pathological section of normal and malignant mammary tumors in dogs (100×, 400×) |
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表 3 78例犬恶性乳腺肿瘤组织病理学分类 Table 3 Histopathological classification of 78 cases of canine malignant mammary tumors |
分析结果显示，犬正常乳腺组织对照组与犬乳腺肿瘤试验组之间有14 807个共有表达基因，其中，具有显著差异表达的基因为36个，含上调表达基因20个；下调表达基因16个，显著差异基因的整体分布火山图(图 3)。
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图 3 差异基因火山图 Fig. 3 Volcano plot of differentially expressed genes |
GO富集从细胞组成、分子功能和生物过程3个方面进行分析。差异表达基因共富集1 279个条目，其中，差异表达最显著的30个GO term(图 4)所示。基于显著差异表达基因进行KEGG信号通路富集分析，结果(图 5)所示，显著差异表达基因主要集中在糖代谢、脂肪消化与吸收、碳水化合物消化与吸收、PPAR、AMPK等通路及胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、疟疾、神经胶质瘤、膀胱癌、丁酰苷菌素与新霉素生物合成等疾病或生物学过程中。
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A.显示差异最显著的前30个GO term；B.生物过程；C.细胞组成；D.分子功能 A. The top 30 GO terms with the most significant difference were presented; B. Biological process; C. Cellular component; D. Molecular function 图 4 差异表达基因GO富集图 Fig. 4 GO term of differentially expressed genes |
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图 5 差异表达基因KEGG富集散点图 Fig. 5 KEGG enrichment of differentially expressed genes |
根据高通量转录组测序，本研究筛选到了HK2[log2(Fold change)=3.715 9]、MEST以及GDF5等36个显著差异性表达基因，基于HK2是细胞糖酵解途径中的关键酶，综合转录组测序与qPCR验证试验结果，发现HK2的表达变化与犬乳腺肿瘤具有一定相关性，鉴于目前未见其在犬乳腺肿瘤中的相关研究报道，参考HK2的人医临床研究价值，本研究选择HK2作为研究对象。
结果显示，HK2 mRNA在犬体内各组织脏器中存在不同程度的表达(图 6)。其中，结肠的相对表达量最高，脑组织的相对表达量最低。犬正常乳腺组织中HK2表达量相对偏低，在检测的25个(含乳腺组织)组织脏器中仅高于脑组织、心、肾与肝。IHC结果显示，HK2主要着色于组织胞质中。在全身组织样本中，HK2几乎不表达的组织脏器包括乳腺、膀胱、脊髓、甲状腺、卵巢、脑组织、皮肤、胃和心(总占比36.0%，图 7)；低表达的组织脏器包括肝、肾上腺、胰腺、气管、子宫和脂肪(总占比24.0%，图 8)；高表达的组织脏器包括肠淋巴结、肺、骨髓、肌肉、结肠、脾、舌、肾(肾小球)、食道和小肠(总占比40.0%，图 9)。
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数据以“x±s”表示 The data are presented as "x±s" 图 6 HK2 mRNA在犬全身不同组织器官中的相对表达量 Fig. 6 Relative expression of HK2 mRNA in different tissues and organs of dogs |
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A.乳腺；B.膀胱；C.卵巢；D.脑；E.皮肤；F.胃；G.脊髓；H.心；I.甲状腺 A. Mammary gland; B. Bladder; C. Ovary; D. Brain; E. Skin; F. Stomach; G. Spinal cord; H. Heart; I. Thyroid 图 7 HK2蛋白几乎不表达的组织器官(100×，400×) Fig. 7 Tissues and organs with almost no expression of HK2 protein (100×, 400×) |
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A.肾上腺；B.气管；C.肝；D.脂肪；E.胰腺；F.子宫 A. Adrenal gland; B. Trachea; C. Liver; D. Fat; E. Pancreas; F. Uterus 图 8 HK2蛋白低表达的组织器官(100×，400×) Fig. 8 Tissues and organs with low expression of HK2 protein (100×, 400×) |
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A.肠淋巴结；B.结肠；C.肺；D.脾；E.骨髓；F.舌；G.肌肉；H.肾；I.食道；J.小肠 A. Intestinal lymph node; B. Colon; C. Lung; D. Spleen; E. Bone marrow; F. Tongue; G. Muscle; H. Kidney; I. Esophagus; J. Small intestine 图 9 HK2蛋白高表达的组织器官(100×，400×) Fig. 9 Tissues and organs with high expression of HK2 protein (100×, 400×) |
与犬正常乳腺组织比较，犬良性乳腺肿瘤中HK2 mRNA表达水平显著升高，两者存在极显著性差异(P＜0.01)。犬恶性乳腺肿瘤中HK2 mRNA表达水平进一步升高，与正常乳腺组织相比差异极显著(P＜0.01)，较良性乳腺肿瘤显著升高(P＜0.05，图 10)。HK2蛋白在良性乳腺肿瘤中低表达为21/33(63.6%)；高表达为12/33(36.4%)。在恶性乳腺肿瘤组织中，HK2蛋白的低表达为11/78(14.1%)；高表达为67/78(85.9%，图 11)。HK2蛋白在犬正常乳腺组织与肿瘤乳腺组织中的表达存在极显著性差异(P＜0.01)，在良性乳腺肿瘤与恶性乳腺肿瘤之间的表达同样存在极显著性差异(P＜0.01)。
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数据以“x±s”表示。*. P＜0.05；**. P＜0.01 The data are presented as "x±s". *.P < 0.05; **.P < 0.01 图 10 HK2 mRNA在正常乳腺、良性乳腺肿瘤与恶性乳腺肿瘤中的相对表达量 Fig. 10 Relative expression of HK2 mRNA in normal mammary gland, benign mammary tumors and malignant mammary tumors |
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A.良性乳腺肿瘤；B.恶性乳腺肿瘤 A. Benign mammary tumor; B. Malignant mammary tumor 图 11 HK2蛋白在犬乳腺肿瘤中的表达情况(100×，400×) Fig. 11 Expression of HK2 protein in canine mammary tumors (100×, 400×) |
HK2蛋白在犬乳腺肿瘤组织中的表达情况与其他临床特征之间具有显著相关性(表 4)。结果显示，在犬恶性乳腺肿瘤中HK2的表达与肿瘤大小(P=0.006)、组织学分级(P=0.034)、脉管浸润(P=0.023)和Ki-67指数(P=0.030)存在显著正相关，与肿瘤组织坏死情况(P=0.729)无统计学相关性。术后对111例犬乳腺肿瘤病例进行随访调查，获取82例(经详细的随访、检查等方式排除意外、急性疾病或典型其他致命性慢性疾病导致死亡的可能性)术后3年的随访信息。其中, 31例存活不足1年、17例存活超过1年、5例存活超过2年以及29例存活超过3年。27例出现复发或转移。HK2蛋白表达水平与患犬术后存活时间显著相关，HK2低表达的患犬术后3年存活率显著高于HK2高表达患犬(P=0.001)，HK2高表达的患犬术后出现肿瘤复发或转移率显著高于HK2低表达患犬(P=0.023，表 5)。同时，HK2蛋白表达水平也与患犬术后3年总生存时间趋势具有显著相关性(P=0.01)，HK2高表达的患犬术后3年的生存时间趋势显著低于低表达患犬(图 12)。
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表 4 犬乳腺肿瘤中HK2蛋白的表达情况与临床特征的相关性 Table 4 Correlation between the expression of HK2 protein and clinical features in canine mammary tumors |
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表 5 犬乳腺肿瘤中HK2蛋白的表达情况与患犬预后的相关性 Table 5 Correlation between the expression of HK2 protein and the prognosis of dogs |
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使用Kaplan-Meier分析，P=0.01。P＜0.05表示存在统计学差异 Using a Kaplan-Meier, P=0.01. P < 0.05 says difference was statistically significant 图 12 HK2蛋白表达水平与患犬术后3年存活趋势 Fig. 12 Correlation between HK2 protein expression and 3-year survival trend after operation in dogs |
伴随着人们生活条件的改善及动物医学诊疗水平不断提升，宠物犬平均寿命也显著增加。在此背景下，肿瘤等慢性、中老年疾病的发病率与就诊率随之上升。尽管目前畜主对于母犬生理性绝育手术接受度普遍较高，但在首次发情后接受该手术的母犬仍无法完全避免乳腺肿瘤/肿块的发生[19]。在本研究的121只犬中，19只犬曾接受绝育手术，这也证实了该病的发生与绝育手术的时间点存在相关性。本研究中患犬品种广泛，无明显品种倾向性，其中贵宾犬数量最多(29/121)，这与畜主对犬种的喜好倾向有关，犬种发病总体趋势与其他研究基本一致[20-21]。患犬的年龄跨度为3~15岁，平均年龄为9.8岁，说明该疾病主要发生于中老年犬中[22]。在111例乳腺肿瘤病例中，恶性乳腺肿瘤病例占比达到70.3%(78/111)，该结果高于其他研究报道中的比例，但总体趋势并未矛盾[1]。首先，这或许与病例样本数量有关，更广泛的临床样本数量可能会将整体比例均衡。在本研究中的78例恶性乳腺肿瘤病例中，复合性腺癌病例数高达37例，占恶性乳腺肿瘤的47.4%，其次为实体癌(19例)，两者共同占比71.8%。这与人类乳腺癌不同，但两者均为犬乳腺肿瘤中常见的组织学类型[23-24]。
人类乳腺癌与犬乳腺肿瘤无论在流行病学、临床症状或生物学特征等方面均具有一定相似性。因此多年来，犬是人类医学研究中理想的模型动物。反之，人医临床中的大量研究也可为犬乳腺肿瘤疾病的诊治提供重要的思路与指导意义，尤其是筛选犬乳腺肿瘤相关标志物以及预后因子在动物临床医学中至关重要。
高通量测序技术的问世与发展无疑是生命科学领域的又一巨大进步，通过对高通量测序数据的分析可能筛选出在乳腺肿瘤某方面起到关键性调控作用的差异表达基因，并可在此基础上分析相关基因对乳腺肿瘤的功能影响以及开展深入的机制研究[25]。本研究首先对采集的犬正常乳腺与恶性乳腺肿瘤组织进行高通量转录组测序，分析得到36个显著差异表达基因，通过KEGG富集后发现，它们主要集中在糖代谢、脂肪消化与吸收、碳水化合物消化与吸收、PPAR通路、AMPK通路、胰腺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、疟疾、神经胶质瘤、膀胱癌、丁酰苷菌素与新霉素生物合成等方面。经过后期对显著差异表达基因的qPCR验证以及文献分析，本研究发现HK2更具显著性和代表性，因此将其作为研究对象。
早在2000年，Hanahan和Weinberg[26]就提出能量代谢失衡是肿瘤发生发展的异常特征之一。肿瘤细胞在快速生长过程中有较高的能量需求[27]。1920年, Warburg提出了大多数癌细胞更依赖于有氧糖酵解的理论，随后人们认为该效应与一系列DNA突变和缺失、信号通路发生改变以及肿瘤微环境有关[28-30]。大量研究发现“Warburg”效应确实存在于多种人类肿瘤疾病中[31-33]。HK2是糖酵解途径中的第一关键限速酶，催化葡萄糖产生葡萄糖-6-磷酸。其在鼠、牛和人等物种体内表达分布各异，但在犬体内的表达情况尚不清楚[34]。本研究首先检测了HK2在犬体内多个组织脏器中的表达情况，结果显示，HK2 mRNA在结肠组织中相对表达量最高，脑组织中相对表达量最低，乳腺组织处于相对低表达水平。HK2蛋白表达水平情况基本与mRNA表达趋势大体一致，其中，在乳腺组织中同样处于低表达水平。在人类多种恶性肿瘤疾病(如肝细胞癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌以及乳腺癌)中均发现HK2表达水平升高[35-38]。在极其有限的关于己糖激酶在犬乳腺肿瘤的小样本研究中，发现乳腺肿瘤中己糖激酶的表达水平高于癌旁健康组织，但并未对HK2进行研究分析[39]。本研究结果表明，HK2 mRNA与蛋白表达水平在犬乳腺肿瘤中均出现显著上调，且恶性乳腺肿瘤中表达量显著高于良性乳腺肿瘤。其中，HK2在恶性程度较高的上皮来源犬乳腺肿瘤类型中(例如实体癌、鳞状细胞癌和梭形细胞癌等)均为高表达，在其他类型中也均为高表达居多，这表明HK2与犬乳腺肿瘤的恶性程度密切相关。尽管间叶来源的病例较少，但均也表现出HK2高表达，这或许表明HK2在犬恶性乳腺肿瘤中的高表达与组织来源无明显相关性，该方面后期需更多临床样本加以验证。此外，本研究发现HK2的表达水平与犬恶性乳腺肿瘤的大小成正相关，这可能与HK2结合线粒体外膜的线粒体电压依赖性阴离子通道后，对肿瘤细胞提供能量使其快速增殖有关[40]。这也为HK2作为犬乳腺肿瘤疾病发展过程中的重要参考指标提供了理论依据。此外，有研究表明HK2在人类多形性胶质母细胞瘤中的高表达与患者预后呈负相关[41]。在人类乳腺癌的转移病例中，HK2进一步上调，尤其在乳腺癌脑转移病例中其更是少数表达上调的基因之一[42-43]。本研究发现HK2的表达情况与犬恶性乳腺肿瘤的组织学分级、脉管浸润和Ki-67增殖指数呈显著相关性；并与术犬肿瘤原位复发、远端转移以及存活时间呈显著相关性，这也预示着HK2或许可作为患犬极具价值的预后因子。
4 结论本研究表明，HK2在健康犬全身组织中表达水平各异，在正常乳腺组织中处于低表达水平，而在犬乳腺肿瘤(尤其是恶性乳腺肿瘤)组织中处于高表达水平，HK2高表达与犬乳腺肿瘤大小、复发或转移以及术后生存时间呈明显相关性，其可作为犬乳腺肿瘤病例实时监测及预后因子。
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(编辑 白永平)