奶牛乳腺炎是乳腺组织受到病原微生物感染和理化因素刺激等发生的炎症反应,其对牧场造成的巨大经济损失,严重制约着奶业的发展[1]。据统计,对于全球奶牛行业,乳腺炎每年造成的经济损失高达350亿美元[2],中国、美国、新西兰、德国奶牛养殖业每年损失分别为30亿美元、20亿美元、2亿美元、11亿美元[3-7]。据报道,引起奶牛乳腺炎的原因主要包括病原微生物感染、环境因素、遗传因素以及饲养管理和奶牛个体状态等方面。其中,微生物(尤其是细菌)入侵通常是引发奶牛乳腺炎的主要原因[5]。无乳链球菌(Streptococcus agalactia)是引起奶牛乳腺炎的常见和主要致病菌之一,导致乳腺炎的发病率高达45.01%[8-11]。无乳链球菌的毒力因子具有黏附和侵袭机体细胞的作用,使菌体在奶牛乳腺表面形成生物被膜,进而干扰机体的正常免疫功能并引发疾病[12]。研究表明,无乳链球菌编码的大量毒力因子,主要表现在定植、侵袭、生物被膜形成、免疫逃避等多个方面[13],可通过产生介导细菌和宿主受体之间相互作用的表面蛋白,在入侵奶牛乳腺时参与到细菌与宿主细胞和细胞外基质的黏附过程[14]。值得注意的是,纤维蛋白原结合蛋白、层黏连蛋白结合蛋白、菌毛等均是无乳链球菌在黏附过程中起关键作用的黏附因子[15-18]。此外,无乳链球菌还可以引发新生儿肺炎、败血性休克综合征和高死亡率的脑膜炎以及其他动物的多种疾病。由此可见,控制和预防无乳链球菌型乳腺炎对于提高养殖场经济效益和公共卫生安全具有重要意义。
现阶段,我国治疗奶牛乳腺炎多以抗生素治疗为主,常因抗菌药物使用剂量不合理、不科学,使牛奶中药物残留和耐药菌株等问题不断出现,导致水土等环境污染,进而严重危害人类健康[19]。随着我国饲料禁抗、养殖减抗、产品无抗时代的到来,因天然活性物质具有不易产生耐药性、低毒高效、低残留等优势,符合畜禽绿色健康养殖理念,具有广阔的应用前景[20]。苦参碱是从苦参等豆科植物提取的一种中药有效成分,属于四环喹诺里西啶类生物碱,具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗微生物、抗纤维化、抗过敏等特性[21]。研究发现,苦参碱可显著抑制金黄色葡萄球菌的增殖,通过影响生物被膜的形成、阻碍细菌对细胞的黏附能力而发挥抗菌作用[22-23]。冷晓红等[24]研究发现,在培养基中添加苦参碱后,金黄色葡萄球菌、无乳链球菌及大肠杆菌等多种细菌的生长繁殖均受到明显抑制。在陆平祝等[25]研究中,苦参碱对于金黄色葡萄球菌具有良好的抑制效果。韩欢胜等[26]发现,苦参碱凝胶对无乳链球菌有较好抑菌效果,还有研究发现,苦豆草总碱灌注液对无乳链球菌也有抑菌效果[27]。虽然苦参碱在病原菌侵入机体的过程中具有较好抑制作用,但如何调控病原菌侵入机体过程中发挥作用的毒力因子及其对牛源无乳链球菌体外抑菌效果尚未阐明。
本研究以牛源无乳链球菌为研究对象,通过检测苦参碱对无乳链球菌的最小抑菌浓度和时间-抑菌曲线,分析苦参碱对无乳链球菌的抑菌活性;并通过全血杀伤试验、黏附试验、透射电镜等研究手段,探究苦参碱对无乳链球菌毒力因子的作用效果,以期为中药单体抑菌产品的开发和应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验仪器DF-371 CO2细胞培养箱(美国Thermo公司);DL-CJ-1 N超净工作台(北京HDL有限公司);Multiskan FC酶标仪(上海Thermofisher有限公司);HH-2电热恒温水浴锅(上海比朗仪器有限公司);3K15高速冷冻离心机(美国Sigma公司);3K15高速冷冻离心机(美国Sigma公司);SX-700蒸汽灭菌锅(日本TO超净工作台MY公司);LHS-150HC-II恒温恒湿箱(上海一恒科学仪器有限公司);ZD-85双功能气浴恒温振荡器(常州嵘实验仪器厂);AE3荧光倒置显微镜(北京Motic公司);微量分光光度仪(北京BH公司);荧光定量PCR仪(Roche公司)。
1.2 试验试剂无乳链球菌(标准菌株ATCC13813)购自中国兽医药品监察所,苦参碱(纯度99%)购自中国食品药品检定研究院。脑心浸出液肉汤、麦康凯琼脂培养基、血琼脂平板培养基、DNA提取试剂盒、一次性细菌培养皿购自北京索来宝生物公司;1%结晶紫染液、番红染液、青链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA、DMEM/F12培养基、澳洲胎牛血清(FBS),购自美国Gibco公司;总RNA提取试剂盒,购自上海OMAGA公司;cDNA反转录试剂盒和TB GreenTM Premix Ex Taq II,购自日本TaKaRa公司。
1.3 无乳链球菌悬液的制备取少量无乳链球菌标准菌种,用接种环接种于含有5 mL已灭菌脑心浸出液培养基的试管中,将试管置于摇床中,在37 ℃、200 r·min-1件下培养18 h,此时细菌浓度约为109CFU·mL-1。取培养后的菌液100 μL稀释至1 mL,按此倍比稀释方法稀释菌液,然后取100 μL菌种接种于脑心浸出液固体培养基,在37 ℃恒温培养箱中培养18 h,记录菌落个数,此时细菌浓度约为1×108CFU·mL-1。
1.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定准确称取19.2 g苦参碱粉末溶于已配置好的细菌液体培养基中,灭菌备用。将含有不同浓度苦参碱的液体培养基分别添加至无菌的96孔微量培养板中,每孔加入100 μL苦参碱浓度依次为0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg·mL-1的苦参碱培养基溶液,每个浓度平行重复3次;苦参碱浓度0 mg·mL-1为空白对照组。将无乳链球菌悬液采用倍比稀释法稀释至105CFU·mL-1,向每孔依次加入100 μL稀释后的菌液,对照孔加入100 μL培养基。每孔做3个重复。微量培养板置于37 ℃培养箱中培养24 h后,用酶标仪检测吸光度值(OD600 nm)。当药物完全抑制无乳链球菌生长的苦参碱浓度即为苦参碱对无乳链球菌最小抑菌浓度(MIC)。
1.5 黏附能力的测定1.5.1 奶牛乳腺上皮细胞悬液的制备 在细胞培养瓶中培养至密集单层的奶牛乳腺上皮细胞,选取生长良好的细胞,置于离心机在550 r·min-1条件下离心5 min,弃去上清夜,用细胞完全培养液使细胞悬浮。吸取1 mL细胞悬液接种于96孔板中,使每孔细胞接种量为1×104个左右,置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养备用。
1.5.2 无乳链球菌与苦参碱共培养 用梯度稀释法配制苦参碱溶液,使苦参碱浓度依次为0、2、4、6、8、10 mg·mL-1。向试验组每支试管中加入1体积不同浓度苦参碱和9体积制备好的无乳链球菌菌液(1×108CFU·mL-1),对照组为加入1体积培养基和9体积菌液。将试验组和对照组置于37 ℃摇床上共培养18 h,备用。取共培养的无乳链球菌菌液,用细胞完全培养液稀释至1×105CFU·mL-1,保存在4 ℃备用。
1.5.3 细菌感染奶牛乳腺上皮细胞 当96孔板中单层细胞达到90%以上融合时,吸除细胞培养液,用PBS冲洗2次后,向每孔加入1 mL已稀释好的无乳链球菌菌液,维持原有培养条件继续培养,分别在接种菌株后2.5 h取样,检测无乳链球菌对于乳腺上皮细胞的黏附能力。
称取3.7 g脑心浸出液培养基溶解于100 mL超纯水中,然后在121 ℃条件下高压灭菌20 min,室温冷却后备用。取出感染后的样本,向每孔加入1 mL 1% Tritonx-100 (v/v),室温静置10 min,待细胞裂解释放出细菌后,吹打混匀,将该悬液用PBS倍比稀释。吸取100 μL上述稀释液接种到脑心浸出液固体培养基上,置于37 ℃恒温培养箱中培养48~72 h,取出进行菌落计数,计算每孔无乳链球菌总数。
1.6 全血杀伤试验在奶牛晨饲前,用采血针连接肝素钠真空采血管采集奶牛静脉血液,每管采血10 mL。将采集到的尾中静脉血保存于4 ℃备用。用无菌奶牛全血将无乳链球菌培养至对数期,用高速冷冻离心机在12 000 r·m-1条件下离心2 min收集菌体。用PBS冲洗3遍,并将细菌浓度调至1×105 CFU·mL-1。试验组将370 μL全血和20 μL不同浓度苦参碱(0、2、4、6、8、10 mg·mL-1)与10 μL上述菌液混合培养;对照组将苦参碱替换为等量的灭菌PBS。37 ℃培养3 h后进行细菌菌落计数,比较两组无乳链球菌在血液中的存活率。
1.7 透射电镜试验组将无乳链球菌悬液接种到加有苦参碱(浓度为最小抑菌浓度)的脑心浸出液肉汤培养基中过夜培养,对照组不加苦参碱溶液。将培养液置于离心机12 000 r·min-1离心2 min,用PBS清洗3遍后,向样品中加入2 mL电镜固定液,置于4 ℃条件下固定1.5 h。用30%、50%、70%、80%、90%和100%的梯度酒精对样本进行脱水,每次脱水15 min。然后用叔丁醇溶液置换酒精3次,每次停留10 min。最后将细菌转移至细菌载玻片,置于超低温冷冻干燥机中冷冻干燥2 h。将处理好的无乳链球菌置于样品台上,喷金后用透射电镜(XL30-ESEM,Philips)观察细菌形态,并拍摄照片。
1.8 生物膜检测将无乳链球菌接种于THB肉汤培养基中过夜培养,然后将其稀释至OD600 nm=0.05。取100 μL稀释好的菌液接种到96孔板上,以培养基为空白对照,依次加入100 μL不同浓度苦参碱溶液(0、2、4、6、8 mg·mL-1),置于培养箱中培养24 h。试验重复3次。弃去培养液,用PBS洗涤3次,每孔加入200 μL 0.1%结晶紫溶液,染色15 min。弃去染色液,PBS洗涤三次,每孔加入200 μL 95%乙醇溶液溶解结晶染料,振荡混匀,酶标仪测定OD590 nm。
1.9 荧光定量PCR将无乳链球菌悬液接种到加有苦参碱(浓度为最小抑菌浓度)的脑心浸出液肉汤培养基中过夜培养,为苦参碱组,对照组则为不加苦参碱溶液。按照马芳等[28]和Shang等[29]的报道进行检测,将培养液置于离心机12 000 r·min-1离心2 min,用PBS清洗3遍后,按照Total RNA Kit I(OMEGA,中国)试剂盒进行RNA的提取。提取的总RNA用Denovix超微量紫外可见分光光度计(DS-11,美国)进行浓度和纯度检测,然后采用cDNA合成试剂盒(TaKaRa,日本) 合成cDNA,反应条件为37 ℃,15 min(反转录反应),85 ℃,5 s(反转录酶的失活反应)。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)条件为95 ℃预变性30 s;95 ℃延伸5 s,60 ℃退火30 s,40个循环。融解60 ℃退火,1 min,95 ℃ 15 s。毒力因子的基因引物序列见表 1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以16S作为内参基因,使用2-ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达量。
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表 1 毒力基因的引物序列 Table 1 Primers sequences of virulence genes |
用SPSS 17.0统计学软件进行数据统计分析,差异显著性分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。试验结果平均数±标准差(X ±SD)表示,P < 0.05表示差异显著,P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 苦参碱对无乳链球菌的最小抑菌浓度苦参碱与无乳链球菌菌株共培养24 h,当苦参碱浓度为0.25、0.5、1 mg·mL-1时,对无乳链球菌的增殖影响较小,与对照组(0 mg·mL-1)相比差异不显著(P>0.05);与对照组相比,苦参碱浓度为2 mg·mL-1、4 mg·mL-1、8 mg·mL-1和16 mg·mL-1时,无乳链球菌增殖能力显著下降,差异极显著(P < 0.01)(图 1A)。由图 1B可知,无乳链球菌在与苦参碱共培养的0~4 h内,均未发生明显增殖。从第4小时开始,与低于4 mg·mL-1苦参碱共培养的菌株开始出现增殖生长,其余浓度共培养的菌株都未发生增殖。在6~12 h内,与低于4 mg·mL-1苦参碱共培养的菌株进入对数生长期,呈现出快速增殖生长,并在12 h达到最大值;12~24 h内,与低于4 mg·mL-1苦参碱共培养的标准菌株进入到平台期,增殖生长基本停止,并出现下降趋势。浓度大于4 mg·mL-1的苦参碱对无乳链球菌的增殖生长呈现完全抑制,与苦参碱最小抑菌浓度的测定试验结果相符。
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*.P < 0.05;**. P < 0.01。下同 *.P < 0.05;**. P < 0.01. The same as below 图 1 苦参碱对无乳链球菌的最小抑菌浓度(A)及时间-抑菌曲线(B) Fig. 1 Minimum inhibitory concentration(A)and Time-growth curve(B)of matrine to Streptococcus agalactiae |
通过苦参碱对无乳链球菌黏附能力的干预试验,由图 2可知,与对照组(0 mg·mL-1)相比,苦参碱为2 mg·mL-1时无乳链球菌对乳腺上皮细胞的黏附率降低至93.2%;苦参碱浓度在4 mg·mL-1时,无乳链球菌对于乳腺上皮细胞的黏附率显著降低(P < 0.05);苦参碱浓度在6 mg·mL-1以上时,无乳链球菌对于乳腺上皮细胞的黏附率极显著降低(P < 0.01)。
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图 2 苦参碱对无乳链球菌标准菌株乳腺上皮细胞黏附率的影响 Fig. 2 Effect of matrine on adhesion rate of mammary epithelial cell of Streptococcus agalactiae |
为明确苦参碱对无乳链球菌抵御机体杀伤作用的影响,本研究进行了全血杀伤试验。由图 3可知,与对照组(0 mg·mL-1)相比,当苦参碱浓度为4 mg·mL-1时,无乳链球菌标准菌株在血液中的存活率降低至70.40%,差异显著(P < 0.05);当苦参碱浓度为6、8和10 mg·mL-1时,菌株在血液中的存活率分别降低至41.40%、17.98%和5.33%,差异极显著(P < 0.01)。
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图 3 苦参碱对无乳链球菌全血杀伤作用的影响 Fig. 3 Effect of matrine on blood killing of Streptococcus agalactiae |
由透射电镜的结果可知,无乳链球菌标准菌株经最小抑菌浓度(4 mg·mL-1)的苦参碱处理后,其荚膜生成受到显著抑制,菌体细胞膜表面光滑。未与苦参碱溶液共培养的无乳链球菌具有较厚的多糖荚膜,其表面形态较粗糙,与处理组形成明显对比(图 4)。
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A. 标准菌株未加入苦参碱;B. 标准菌株加入MIC浓度苦参碱 A. Standard strain without matrine; B. Standard strain cultured with matrine at MIC 图 4 苦参碱对无乳链球菌标准菌株荚膜生成的影响 Fig. 4 Effect of matrine on capsule formation of Streptococcus agalactiae |
在苦参碱对无乳链球菌菌株生物膜形成能力的试验中,与对照组(0 mg·mL-1)相比,当苦参碱浓度为2 mg·mL-1时,无乳链球菌的生物膜的形成降低至92.64%,差异显著(P < 0.05)。当浓度分别为4、6和8 mg·mL-1时,无乳链球菌生物膜的形成进一步被抑制,分别降低至46.18%、44.06%、16.34%,显著极差异(P < 0.01,图 5)。
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图 5 苦参碱对无乳链球菌标准菌株生物膜形成的影响 Fig. 5 Effect of matrine on biofilm formation of Streptococcus agalactia |
与侵袭和免疫逃避相关的毒力基因的C5补体切割酶(ScpB)、组装荚膜多糖的(CpsA)基因、溶血色素(CylE)和CAMP因子(CAMP),在苦参碱组中表达量均显著下调(P < 0.05),而与生成荚膜多糖密切相关的CpsE基因,则显著上升(P < 0.05,图 6A)。与毒力因子黏附作用显著相关的Bac、Bca基因、层黏连蛋白结合蛋白(Lmb)、BIBA表面蛋白(BIBA)、菌毛蛋白(PI-2b)和纤维蛋白原结合蛋白的(FbsB)基因,在苦参碱组中的表达量均显著降低(P < 0.05,图 6B)。
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图 6 苦参碱对无乳链球菌侵袭和免疫逃避相关基因(A)以及无乳链球菌黏附相关基因(B)表达的影响 Fig. 6 Effects of matrine on the expression of invasion and immune escape-related genes(A), and adhesion-related genes (B) of Streptococcus agalactiae |
本研究通过苦参碱对无乳链球菌最小抑菌浓度测定发现,当苦参碱浓度为4 mg·mL-1时,无乳链球菌出现显著抑制,这与先前的报道相一致[25]。冷晓红等[24]研究发现,苦参碱对多种细菌生长繁殖均有抑制作用,如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌;其中,苦参碱对无乳链球菌的抑制效果最强,最小抑菌浓度3.125~6.25 mg·mL-1。韩欢胜等[26]研究发现,苦参碱凝胶对无乳链球菌也有较好的抑菌效果,其最低抑菌剂量和最低杀菌剂量分别为3.13和6.25 mg·mL-1。张虹等[27]研究发现,苦豆草总碱灌注液可以抑制从奶牛乳腺炎中分离得到的病原菌株,并测得苦豆草总碱对无乳链球菌的最小抑菌浓度为3 mg·mL-1,平均杀菌浓度为50 mg·mL-1。由此表明,苦参碱对无乳链球菌具有良好的抑菌作用。此外,通过本研究中时间生长曲线可知,苦参碱在与无乳链球菌共培养6 h后,开始对其产生抑制作用,且与荧光定量PCR结果相一致。这表明在6 h内苦参碱对无乳链球菌的抑制作用与苦参碱影响菌体毒力因子的有关,但具体调节机制还有待进一步的验证。
3.2 苦参碱对无乳链球菌毒力的影响无乳链球菌经乳导管进入乳腺组织,并黏附于奶牛乳腺上皮细胞是初期乳腺炎发病机制中的重要环节。因此,无乳链球菌的黏附因子在这一过程中发挥了重要调节作用。本研究结果发现,当苦参碱浓度为2 mg·mL-1L时,无乳链球菌对于乳腺上皮细胞黏附率降低至63.2%,这与马芳等[28]的研究结果一致。同时,Fessia等[30]研究表明,苦参碱与无乳链球菌共培养2 h后,苦参碱能够抑制无乳链球菌黏附并内化到上皮细胞。此外,本研究还发现苦参碱可显著抑制与毒力因子黏附作用相关基因的表达。由此可见,苦参碱可通过降低无乳链球菌的黏附能力,从而减少其在乳腺组织中的增殖。
本研究表明,苦参碱对无乳链球菌抵御机体杀伤能力呈剂量依赖性,且苦参碱处理后无乳链球菌荚膜显著减少。当无乳链球菌入侵奶牛乳腺组织时,奶牛机体免疫系统被激活。Ehrnström等[31]研究发现,当无乳链球菌入侵机体后,机体可调节TLR8和补体C5因子在全血中的释放,并引起凝血酶活化,进一步抑制无乳链球菌的生长。而且,有研究表明,无乳链球菌可以通过荚膜逃避机体的免疫反应,从而出现免疫抑制[28]。因此推测,苦参碱是通过增加血液对无乳链球菌的杀伤作用,从而有效地降低了无乳链球菌的免疫逃避能力,这与本研究结果苦参碱可显著降低与侵袭和免疫逃避相关的毒力基因表达结果相一致。
据报道,荚膜多糖是无乳链球菌极其重要的毒力因子,在无乳链球菌侵袭和免疫逃避中都发挥着至关重要的作用[12]。根据荚膜多糖的空间结构的不同,可以将无乳链球菌分为10种血清型,每种血清型都有不同的抗原性。在本研究中,添加4 mg·mL-1苦参碱后无乳链球菌标准菌株的透射电镜结果表明,菌体细胞膜表面光滑,但细菌形态良好且细胞骨架未受到影响。这一结果进一步说明了苦参碱可抑制无乳链球菌的荚膜生成,也印证了无乳链球菌在全血杀伤试验中的免疫逃避能力。然而,值得注意的是,本研究结果发现,苦参碱处理后,与生成荚膜多糖密切相关的CpsE基因表达显著上调,这可能与加膜多糖的空间结构及抗原性密切相关。因此,苦参碱如何抑制无乳链球菌荚膜多糖的合成,影响无乳链球菌的感染能力,但具体的分子机制还有待进一步的验证。
前期有研究表明,无乳链球菌在体外培养时不会产生生物被膜,而与细胞共培养时,菌株生物膜形成能力增强。该报道与Rosini和Margarit[32]的研究结果一致,即在乳腺上皮细胞中形成类似生物膜群落,可以增强无乳链球菌对宿主的防御和营养剥夺能力,进而促进无乳链球菌的生存和繁殖。本试验发现,当苦参碱浓度为2 mg·mL-1时,无乳链球菌生物膜形成降低至92.64%;在苦参碱为4、6和8 mg·mL-1时,无乳链球菌生物膜的抑制率分别为46.18%、44.06%、16.34%,这与Shang等[29]使用茶皂素抑制无乳链球菌生物膜形成的结果相似。然而,苦参碱抑制无乳链球菌生物膜形成的具体机制还有待于进一步研究。综上所述,苦参碱对无乳链球菌具有较好的抑菌活性,为其进一步在畜禽生产中的应用奠定了基础。
4 结论苦参碱在体外能够有效地抑制无乳链球菌(ATCC13813)的增殖,最小抑菌浓度为4 mg·mL-1;可显著降低无乳链球菌的生物膜形成,且对多糖荚膜的生成有显著影响。此外,无乳链球菌对于乳腺上皮细胞的黏附率明显下降,菌体在血液中的存活率显著降低。苦参碱可显著降低与侵袭和免疫逃避、黏附作用相关的毒力基因的表达。
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(编辑 范子娟)