2. 浙江大学动物科学学院动物医学系 & 动物预防医学研究所, 杭州 310058;
3. 华中农业大学动物医学院, 武汉 430070
2. Institute of Preventive Veterinary Medicine & Department of Veterinary Medicine, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;
3. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
鼠伤寒沙门菌是引起食源性疾病最常见的血清型之一。相比鼠伤寒沙门菌(抗原式为4, [5], 12:i: 1, 2),沙门菌血清型4, [5], 12:i: -,缺失了2相鞭毛抗原“1, 2”,是一种鼠伤寒沙门菌单相变种[1],在20世纪90年代前很少分离到,然而目前该血清型已经逐渐成为人类临床、食品动物和肉食品中的主要血清型[2-4],威胁着公共卫生安全。2018—2019年在广东省中山市的哨点医院和食物中毒事件采样检出的沙门菌[5]、在浙江省余姚市河水环境中沙门菌[6]以及2014—2017年在深圳地区腹泻患者沙门菌[7]中,鼠伤寒沙门菌单相变种均为主要血清型。最新一项调查表明,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -在河南省病人中的流行,首次超过鼠伤寒沙门菌,仅次于肠炎沙门菌,排在第二位[8]。2020年,郑州市腹泻患者S.1, 4, [5], 12:i: -沙门菌检出率高于鼠伤寒沙门菌[9]。国外已有研究表明,鼠伤寒沙门菌单相变种引起的疫情暴发与猪肉及猪肉产品有关[10-12]。河南省是我国猪肉主要生产区,2017年河南单独贡献了6 220万头以上的猪,约占我国消费总量的10%[13]。同时,自从2014年开始,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -已经成为在美国猪临床样品中鉴定出的最主要血清型[14];另一项研究表明,通过猪临床病例分析,该血清型具有鼠伤寒沙门菌相似的致病潜力[15]。Xie等[16]研究表明,猪是我国沙门菌血清型4, [5], 12:i: -的主要宿主。本课题组先前研究表明,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -是河南省猪临床病例中沙门菌的主要流行血清型,且耐药性强,给公共卫生安全带来威胁[17]。然而,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -在河南省猪产业链中的流行情况和基因组学信息,目前无相关报道。
本课题组前期在河南地区1 441份猪肉等食品中分离到17株沙门菌血清型4, [5], 12:i: -和4株鼠伤寒沙门菌,共21株[18]。同时,本课题组另一项研究从河南省1 732份猪粪样品中(其中猪场1 334份样品、屠宰场398份样品)共分离到70株鼠伤寒沙门菌,当时未将鼠伤寒沙门菌与沙门菌血清型4, [5], 12:i: -进行区分,均归为鼠伤寒沙门菌[19],目前怀疑,70株鼠伤寒沙门菌中,可能也包含有沙门菌血清型4, [5], 12:i: -。因此,本研究从河南省猪产业链中收集了3 173份样品,总共分离到91株鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4, [5], 12:i: -。本研究采用全基因组测序方法,对河南省猪产业链中91株鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4, [5], 12:i: -分离菌进行基因组学分析,其目的是为了阐明这些菌株的血清型、序列型、质粒类型、耐药性和毒力的基因组学特征,试图解释沙门菌血清型4, [5], 12:i: -进化中获得选择性优势的可能机制,旨在为本地区人和动物沙门菌感染的防控研究打下基础。
1 材料与方法 1.1 主要试剂XLD琼脂培养基(木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂)和SS琼脂培养基,购自广东环凯生物科技有限公司;胰蛋白酶大豆肉汤(Tryptic Soy Broth,TSB),购自美国BD公司;2×PCR Taq Master Mix with dye,购自加拿大ABM公司;DL 2 000 DNA Marker,购自TaKaRa公司;FastPure® Bacteria DNA Isolation Mini Kit,购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.2 主要仪器PCR扩增仪:ETC811,北京东胜生物科技公司;凝胶成像分析系统:Gel DocTMXR,美国BIO-RAD公司;高速离心机:5424R,德国Eppendorf公司;超微量紫外分光光度计:NanoDrop 1000,美国Thermo公司。
1.3 细菌河南省猪场和屠宰场粪便样品(n=1 732)来源的70株鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4, [5], 12:i: -,河南零售市场猪肉等样品(n=1 441)来源的17株沙门菌血清型4, [5], 12:i: -和4株鼠伤寒沙门菌,总共91株沙门菌。
1.4 试验方法1.4.1 细菌复活 首先将待复活91株细菌从-80 ℃冰箱取出,接种于培养基,进行沙门菌的复活,通过PCR法对复活细菌进行沙门菌的鉴定,确保复活的细菌均为沙门菌。
1.4.2 DNA提取 按照生产厂家试剂盒说明书操作,提取待测沙门菌的DNA。
1.4.3 DNA浓度检测 将所提取的细菌DNA,使用超微量紫外分光光度计,测定其核酸浓度,保证后期全基因组测序要求。
1.4.4 基因组测序 将DNA样品送天津诺禾致源生物信息科技有限公司,采用Illumina NovaSeq 6000平台PE150对端测序技术,进行样品DNA的全基因测序。
1.4.5 基因组学分析 将质控合格的测序数据,通过SPAdes v3.12.0[20]进行序列的拼接。基于细菌的全基因组序列,使用SISTR软件预测菌株的血清型。基于全基因组数据,通过ABRicate v0.8,采用CGE ResFinder v3.1[21]、VFDB[22]和CGE PlasmidFinder v2.0[23]工具,分别对菌株的耐药基因、毒力基因和携带质粒类型进行分析。
2 结果 2.1 血清型预测基于91株沙门菌的全基因组序列进行血清型预测,结果显示,其中50株沙门菌被预测为沙门菌血清型4, [5], 12:i: -,另外41株沙门菌被预测为鼠伤寒沙门菌(表 1)。由于猪场和屠宰场样品源70株检测菌,先前通过传统血清学分型时,未进行鼠伤寒血清型和沙门菌血清型4, [5], 12:i: -的区分,当初两者均归类为鼠伤寒沙门菌,因此无法与全基因组血清分型的结果相比较。零售市场猪肉等样品源21株检测菌,通过传统血清学分型,其结果显示17株沙门菌鉴定为沙门菌血清型4, [5], 12:i: -,另外4株沙门菌鉴定为鼠伤寒沙门菌,与全基因组学血清分型的结果相比较,有3株沙门菌鉴定的结果不一致(表 1)。为了统一猪场和屠宰场样品源、零食市场猪肉等样品源91株沙门菌的血清分型方法,本研究均按照全基因组学预测的血清型分型结果,进行分组分析。通过分析表明,河南省猪产业链中沙门菌血清型4, [5], 12:i: -的流行率(1.58%, 50/3 173)略高于鼠伤寒沙门菌的流行率(1.29%, 41/3 173);相比鼠伤寒沙门菌,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -在屠宰场和零售市场样品中流行率更高,然而,相比鼠伤寒沙门菌,该血清型在猪场样品中流行率更低(表 1)。
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表 1 河南省猪产业链中鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4, [5], 12:i: -流行分布 Table 1 Prevalence distribution of Salmonella Typhimurium and Salmonella serotype 4, [5], 12:i: - in pig-borne food chain of Henan Province |
采用基于全基因组数据的MLST分型方法,对91株沙门菌进行亚分型。结果显示,65株菌为ST34(71.42%,65/91),另外26株菌为ST19(28.57%,26/91),表明ST34是优势序列型;其中50株沙门菌血清型4, [5], 12:i: -的序列型均为ST34,表示为4, [5], 12:i: -/ST34,然而另外41株鼠伤寒沙门菌,有15株鼠伤寒沙门菌的序列型为ST34,表示为Typhimurium/ST34, 余下的26株鼠伤寒沙门菌的序列型为ST19,表示为Typhimurium/ ST19(表 2)。
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表 2 91株被测沙门菌序列分型与其血清型对应关系 Table 2 Corresponding relationship between sequence types and serotypes of 91 Salmonella strains tested |
通过质粒携带分析发现,91株沙门菌中共检测到17种质粒,84株沙门菌至少携带1种以上的质粒,占92.31%(84/91),另外7株沙门菌均不携带任何一种质粒,占7.69%(7/91);有的菌株最多可携带6种类型质粒。其中50株沙门菌血清型4, [5], 12:i: -菌株中,有49株菌至少携带1种以上质粒,占98%(49/50),而41株鼠伤寒沙门菌中,有35株菌至少携带1种以上质粒,占85.36%(35/41),表明相比鼠伤寒沙门菌,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -更容易携带质粒。
通过质粒携带率比较分析,发现Typhimurium/ST19菌株主要携带有IncFIA_1(53.8%)、IncFIB(AP001918)_1(53.8%)、IncFIC(FII)_1(53.8%)、IncFII_1(53.8%)、IncY_1(53.8%)质粒,然而Typhimurium/ST34菌株主要携带IncHI2A_1(100%)和IncHI2_1(100%)、Col440I_1(13.33%)质粒,4, [5], 12:i: - /ST34菌株主要携带IncHI2A_1(38%)、IncHI2_1(38%)、Col440I_1(30.00%)质粒(图 1)。因此,猪产业链中Typhimurium/ST34菌株和4, [5], 12:i: - /ST34菌株都是IncHI2A_1、IncHI2_1和Col440I_1质粒的偏好宿主,而Typhimurium/ST19菌株是IncFIA_1、IncFIB(AP001918)_1、IncFIC(FII)_1、IncFII_1和IncY_1质粒的偏好宿主(图 1)。
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图 1 Typhimurium/ST19菌株、4, [5], 12:i: - /ST34菌株和Typhimurium/ST34菌株携带各种质粒的百分率 Fig. 1 Percentage of various plasmids carried by Typhimurium/ST19 strains, 4, [5], 12:i: - /ST34 strains and Typhimurium/ST34 strains |
2.4.1 耐药基因种类 基于91株鼠伤寒及沙门菌血清型4, [5], 12:i: -菌株基因组数据,进行抗生素耐药基因携带检测。结果显示,这些菌株携带11类抗生素耐药基因,共计42种耐药基因(其中ARR-3_4基因分类不详),其中氨基糖苷类抗生素抗性基因数量最多,其次磺胺类、喹诺酮类、四环素类、酰胺醇类、β-内酰胺类、叶酸抑制类、大环内酯类、多黏菌素类、磷霉素类(表 3)。
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表 3 91株鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4, [5], 12:i: -菌株中耐药基因和种类 Table 3 Antimicrobial resistance genes and classification of 91 Salmonella Typhimurium strains and Salmonella serotype 4, [5], 12:i: - strains |
2.4.2 耐药基因携带率 根据耐药基因检测结果,按照Typhimurium/ST19菌株、Typhimurium/ST34菌株和4, [5], 12:i: -/ST34菌株分组,分别进行耐药基因携带率分析。结果显示,91株沙门菌中携带率超过50%的耐药基因包括aac(6′)-Iaa_1(100%)、aph(6)-Id_1(52.75%)、ant(3″)-Ia_1(59.34%)、aph(3″)-Ib_5(53.85%)、tet(B)_2(80.22%)、sul3_2(50.55%)、floR_2(67.03%)、dfrA12_8(60.44%)、cmlA1_1(59.34%)和blaTEM-1B_1(54.95%)共10种。除了aac(6′)-Iaa_1(100%),4, [5], 12:i: -/ST34菌株携带率超过30%的耐药基因主要包括aac(6′)-Ib-cr_1(36%)、aph(3″)-Ib_5(68%)、aph(6)-Id_1(68%)、blaOXA-1_1(34.00%)、blaTEM-1B_1(72%)、floR_2(44%)、tet(B)_2(90%)、sul2_3(66%)(图 2)。
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图 2 Typhimurium/ST19菌株、Typhimurium/ST34菌株和4, [5], 12:i: -/ST34菌株携带耐药基因的百分率 Fig. 2 Percentage of drug-resistant genes carried by Typhimurium/ST19 strains, Typhimurium/ST34 strains and 4, [5], 12:i: -/ST34 strains |
相比Typhimurium/ST19菌株和Typhimurium/ST34菌株,4, [5], 12:i: -/ST34菌株携带耐药基因种类更多,包括aadA16_1(2%)、aadA2_2(2%)、blaCTX-M-65_1(10%)、dfrA27_1(2%)、qnrB6_2(2%)、qnrS2_1(14%)、sul2_21(2%)(图 2)。然而,相比Typhimurium/ST19菌株和4, [5], 12:i: -/ST34菌株,Typhimurium/ST34菌株对aph(3′)-Ia_1、ARR-3_4、aac(6′)-Ib-cr_1、aph(4)-Ia_1、aac(3)-IVa_1、blaOXA-1_1、catB3_2、oqxA_1、oqxB_1、sul1_5、sul2_2、sul3_2等耐药基因携带率更高(图 2)。
2.5 毒力基因基于91株菌基因组数据,进行这些菌株携带毒力基因的筛查。结果表明,共携带104个毒力基因(表 4),除了fimC、fimH、grvA、gogB、lpfD和shdA以外,对其他毒力基因的携带率均为100%。通过比较分析发现,Typhimurium/ ST34菌株、4, [5], 12:i: - /ST34菌株对fimC、fimH、gogB和grvA毒力基因的携带率均为100%,然而Typhimurium/ ST19菌株对fimC、fimH、gogB和grvA毒力基因的携带率分别为80.77%、65.38%和53.85%、53.85%。同时,4, [5], 12:i: -/ST34菌株和Typhimurium/ST19菌株对lpfD毒力基因的携带率为100%,而Typhimurium/ST34菌株对这个毒力基因的携带率为33.33%。另外,Typhimurium /ST34菌株、4, [5], 12:i: - /ST34菌株和Typhimurium/ST19菌株对shdA毒力基因携带率分别为33.33%、12.00% 和15.38%。
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表 4 91株被测沙门菌中携带的耐药基因 Table 4 Virulence genes carried in 91 Salmonella strains tested |
分析后发现,4, [5], 12:i: -/ST34菌株比Typhimurium/ST34和Typhimurium/ST19菌株可能携带更多种类的毒力基因,表明沙门菌血清型4, [5], 12:i: -/ST34菌株进化过程中可能获得更好的选择优势,不过是否意味着该菌型更容易导致人类或者动物感染,还需进一步研究。
3 讨论虽然我国已有多地报道血清型4, [5], 12:i: -为人类临床沙门菌分离株的优势血清型[5, 8-9, 24-26],但是该血清型在动物和肉食品中流行的报道相对较少[27-30]。本研究首次证实,河南省猪产业链来源沙门菌血清型4, [5], 12:i: -的流行已经超过鼠伤寒沙门菌,如果这些沙门菌血清型4, [5], 12:i: -菌株通过猪肉等食物链传播给当地人群,也能够引起感染的话,在一定程度上解释了最近在河南省病人中沙门菌血清型4, [5], 12:i: -的流行已经超过鼠伤寒沙门菌、排在第二位[8]的原因。
一个有趣的现象是,本研究中沙门菌血清型4, [5], 12:i: -均为ST34,与国内其他研究发现的人源[25, 31]、猪源[16]和食品源[29]沙门菌血清型4, [5], 12:i: -均为ST34的报道一致;然而,美国和欧洲在1991—2016年期间,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -为ST19比较普遍,不过,从2014年以后,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -为ST34的菌株流行逐渐增加[8, 32-33],与本研究结果不同。
质粒一般携带各种抗性基因(如抗生素耐药基因、重金属抗性基因)和毒力基因等,这些基因有益于其寄生宿主,帮助宿主抵抗应激环境和外来毒素威胁等[34]。肖颖等[25]报道的成都地区人源沙门菌中,相比于鼠伤寒和其他血清型,血清型4, [5], 12:i: -携带更多种类质粒,其中IncQ1质粒只有该血清型携带。同样,本研究发现,相比鼠伤寒沙门菌,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -更容易携带有质粒,但是两者均不携带IncQ1质粒。这些携带质粒的沙门菌血清型4, [5], 12:i: -菌株,不仅可以利用质粒携带的各种抗性基因或者毒力基因,在各种环境选择的作用下,获得有利的选择性优势,同时还可能通过质粒进一步传播各种抗性基因和毒力基因给别的菌株。
本研究91株菌中,以氨基糖苷类耐药基因的种类最多,其中aac(6′)-Iaa携带率为100%,与肖颖等[25]报道人源沙门菌对该基因携带率为100%的结果相同。另外本研究发现,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -菌株普遍携带blaTEM-1B_1(72%),与国内人源[31]、泰国猪源[35]、美国和欧洲人源[32]沙门菌血清型4, [5], 12:i: -菌株普遍携带该耐药基因的报道一致。但是,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -携带blaOXA-1_1(34%)的流行率,远远高于国内(18.4%)、美国(0.22%)、欧洲(0.21%)人源沙门菌血清型4, [5], 12:i: -携带该基因的流行率[31-32]。沙门菌血清型4, [5], 12:i: -菌株携带各种类型耐药基因,与本课题组先前研究这些菌株存在高度的多重耐药表型[18-19]的结果相符。
噬菌体携带的毒力基因sopE、sspH1在91株菌中检出率为100%,均高于国内其他研究和意大利人源菌株的发现结果[29, 31, 36-37]。但是,噬菌体携带的毒力基因gtgE在国内人源沙门菌血清型4, [5], 12:i: -菌株检测率94.7%[31],而本研究发现所有菌株均不携带该毒力基因,与意大利人源菌株不携带该基因的报道结果一致[36]。SopE,是一种通过鼠伤寒沙门菌III型蛋白分泌系统能够移位到宿主体内的效应蛋白,与宿主RhoGTPases结合和激活RhoGTPase信号通路,可促进细菌高效进入宿主细胞[38]。来自欧洲[39]和美国[40]的单相沙门菌分离菌株中均发现了sopE毒力基因。通过仔猪致病性试验和全基因组测序毒力基因的分析,均证实沙门菌血清型4, [5], 12:i: -与鼠伤寒沙门菌具有相似的致病性[41]。本研究中沙门菌血清型4, [5], 12:i: -由于携带各种毒力基因,可能具有鼠伤寒沙门菌相似致病潜力,但还需要开展仔猪致病性试验进行验证。
由于河南省猪产业链中流行的沙门菌血清型4, [5], 12:i: - 菌株耐药性十分严重[18-19],如果引起猪群感染的话,给防治带来巨大挑战。噬菌体在治疗动物细菌性疾病方面有着非常显著的成效,有望替代抗生素用于防治细菌性感染[42],因此下一步可以考虑开发特异性噬菌体制剂用于沙门菌血清型4, [5], 12:i: -感染的治疗。
4 结论总之,本研究表明,相比鼠伤寒沙门菌,沙门菌血清型4, [5], 12:i: -携带更多种类的耐药基因,且对各种毒力基因携带率更高,有助于在宿主和环境中生存,在进化过程中具有选择优势,可能是该血清型在猪产业链中成为主要流行的原因。
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(编辑 范子娟)