2. 河南牧业经济学院动物医药学院, 郑州 450046;
3. 河南牧业经济学院河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室, 郑州 450046;
4. 河南农业大学动物医学院, 郑州 450046
2. College of Veterinary Medicine, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China;
3. Henan Key Laboratory of Innovation and Utilization of Unconventional Feed Resources, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China;
4. College of Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, China
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的急性传染病。在临床上，PRRS表现为母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难、高死亡率，因部分病猪有耳端青紫的特征，俗称“蓝耳病”[1]。1996年，PRRSV首次在我国出现，随后在全国各地流行，给养殖业造成了严重损害[2]。持续感染是PRRS最主要的流行病学特点，猪群一旦感染PRRS就很难彻底清除。目前，对于PRRSV的防控没有行之有效的手段，只能通过科学、合理的疫苗免疫，饲养环境等综合防控减少PRRSV的感染与传播。
1976年，Kemper等[3]从兔网状红细胞裂解物的核糖体中分离纯化得到两种合成血红蛋白所必需的因子IF-M2Bα和IF-M2Bβ，后来它们被命名为真核翻译起始因子5A(eukaryotic initiation factor 5A，eIF5A)[4]。eIF5A是真核翻译起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)家族成员之一，是一种含有157个氨基酸，分子质量为17~21 ku的酸性小分子蛋白质，它广泛存在于动植物的真核细胞中[5]。eIF5A有eIF5A1和eIF5A2两种异构体，它们共享80%的cDNA序列和94%的氨基酸序列[6]。
eIF5A在进化过程中高度保守，是细胞内唯一含有羟腐胺氨酸(hypusine)修饰的蛋白质[7]。Hypusine修饰需要由脱氧羧腐胺赖氨酸合酶和脱氧羧腐胺赖氨酸羟化酶两步酶催化产生，其对eIF5A的功能至关重要[8]。eIF5A最初被认为与蛋白质翻译的启动有关，能够指导甲硫氨酰-嘌呤霉素的合成，但后来研究表明酵母中eIF5A的缺失仅导致总蛋白合成速率的轻微下降[9]，eIF5A实际参与的是翻译延伸过程[10]。研究表明eIF5A与病毒感染密切相关：Olsen等[11]发现阻断eIF5A hypusine修饰的形成，能影响VP30的表达，进而干扰埃博拉病毒的复制。Ruhl等[12]证实eIF5A能与人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)的反式激活蛋白发生特异性结合，抑制HIV-1的复制。eIF5A是否会影响PRRSV的增殖目前尚未可知，为了探索eIF5A在PRRSV感染中的作用，本研究构建了稳定表达eIF5A的MARC-145-eIF5A细胞系，并通过间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay，IFA)、荧光定量PCR(Real-Time PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)和病毒滴度试验(TCID50)来测定PRRSV在稳定表达eIF5A的MARC-145-eIF5A细胞系的增殖情况。为探索eIF5A调控PRRSV复制的分子机制提供理论基础，也为PRRSV的防控提供新思路。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 细胞、病毒及载体 HEK293T和MARC-145细胞均由本实验室保存并稳定传代。PRRSV高致病性毒株HN07-1为河南农业科学院动物免疫学重点实验室惠赠(GenBank登录号为KX766378.1)。慢病毒表达载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro、包装载体psPAX2和pMD2.G购自Addgene公司。
1.1.2 主要试剂 质粒提取试剂盒、Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶购自Tiangen公司，限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ购自NEB公司，DNA凝胶回收试剂盒、ECL发光试剂盒、嘌呤霉素购自上海碧云天生物技术有限公司，DMEM细胞培养液购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青有限公司，Lipo8000TM转染试剂购自Thermo公司，反转录试剂盒购自TaKaRa公司，荧光定量检测试剂盒购自Roche公司，TRIZOL购自Invitrogen公司，FITC标记的羊抗鼠IgG以及羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠以及羊抗兔IgG均购自Abbkine公司，PRRSV N蛋白单抗购自VMRD公司、eIF5A单抗购自CST公司。
1.2 试验方法1.2.1 重组载体的构建 全基因合成eIF5A基因序列(GenBank登录号：XM 008010117.1)，含EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切位点，对目的基因片段以及pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro载体于37 ℃双酶切1 h。回收纯化线性化的质粒，在2×Seamless Cloning Mix作用下50 ℃连接15 min，将目的基因片段无缝连接至线性化载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Pur，得到重组载体pLV-CMV-eIF5A-EF1a-Puro。将得到重组载体转化至DH5α感受态细胞，送上海生工生物工程有限公司测序。
1.2.2 重组慢病毒载体的构建及包装 将对数生长期的HEK293T细胞均匀接种至10 cm细胞培养皿，生长密度达到约80%时换加不含青链霉素的生长液培养2 h，使用Lipo8000TM转染试剂将构建好的重组载体pLV-CMV-eIF5A-EF1a-Puro和阴性对照载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro，分别与psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞，转染6 h后更换维持液，继续培养48和72 h后收集上清。将收集的慢病毒上清液过滤、离心后分装，保存于－80 ℃。
1.2.3 慢病毒转导和细胞筛选 将MARC-145细胞接种于6孔板，待生长密度达到80%时接种慢病毒，孵育4~6 h后弃去感染液更换维持液继续培养至96 h。细胞稳定生长后更换含5 μg·mL-1嘌呤霉素的细胞生长液进行筛选，第3天更换抗性筛选生长液，待阴性对照组完全死亡终止筛选。初步筛选得到阳性细胞后，用有限稀释法将筛选后的细胞悬液传代到96孔板中，保证每孔只有0~1个细胞，以抗性筛选生长液再培养10~14 d，观察挑取生长状态良好的单细胞克隆接种至24孔板，待细胞孔长满后进行鉴定。
1.2.4 eIF5A稳定表达的对细胞活性的影响 使用MTS检测法测定细胞增殖活力，分别将筛选到的生长状态良好的MARC-145-eIF5A细胞和阴性对照组细胞以每孔104个均匀接种到96孔板内。于不同时间点(0、6、12、24、36和48 h)在板孔中加10 μL MTS试剂，37 ℃下在二氧化碳培养箱中避光孵育2 h后，使用酶标仪于490 nm波长下检测各孔OD值。
1.2.5 筛选细胞的鉴定1.2.5.1 Real-time PCR检测 通过Real-time PCR检测筛选细胞的eIF5A转录水平的表达，以转入空载的MARC-145细胞为对照。提取细胞总RNA，反转录为cDNA，保存于－20 ℃备用。Real-time PCR检测引物β-Actin和eIF5A的序列，如表 1所示。
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表 1 引物序列表 Table 1 Primer sequences used in our study |
反应程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 34 s重复40个循环，最后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s完成检测。
1.2.5.2 IFA检测 将筛选的MARC-145-eIF5A细胞均匀传代至24孔板，待细胞长满用预冷95%甲醇固定细胞15~20 min，用5%脱脂奶于37 ℃封闭细胞1 h，PBS洗涤细胞3次，用eIF5A单抗作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗于37 ℃孵育细胞1 h，均匀覆盖DAPI显色液，避光染色5 min后，用PBS洗涤细胞3~5次，在IX53型荧光倒置显微镜下观察结果。
1.2.5.3 Western blot检测 将筛选的MARC-145-eIF5A细胞均匀传代至平皿中，待细胞长满平皿后消化收集至EP管，用RIPA裂解液裂解细胞，5×蛋白上样缓冲液处理后进行SDS-PAGE，随后将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜，5%脱脂奶封闭膜1 h，eIF5A单抗作一抗孵育PVDF膜1 h，HRP标记的羊抗兔IgG作二抗孵育PVDF膜1 h，用ECL化学发光试剂盒显色。
1.2.6 eIF5A稳定表达对PRRSV增殖的影响1.2.6.1 eIF5A稳定表达对PRRSV滴度的影响 PRRSV分别接种MARC-145-eIF5A细胞系和转入空载体的对照组细胞，分别于12、24、36、48、72 hpi收获病毒液，配制成10-1~10-10十个浓度梯度，接种至96孔板长满底壁80%左右的MARC-145细胞，37 ℃培养4~6 d后，观察并记录细胞病变情况，用Reed-Muench两氏法计算TCID50值并绘制PRRSV的生长曲线。
1.2.6.2 eIF5A稳定表达对PRRSV N基因表达的影响 MARC-145-eIF5A细胞及转入空载体的对照组细胞密度达到80%后接种MOI=0.1的PRRSV并于24 hpi收获细胞，通过Real-time PCR检测PRRSV N基因的表达情况。Real-time PCR检测方法同“1.2.5.1”，使用的β-Actin和PRRSV-N引物见表 1。
1.2.6.3 eIF5A稳定表达对PRRSV N蛋白表达的影响 IFA试验方法同“1.2.5.2”，使用PRRSV N蛋白单抗作一抗，FITC标记的山羊抗小鼠IgG作二抗，经DAPI染液避光染色后，在倒置荧光显微镜下观察。
Western blot试验方法同“1.2.5.3”，以PRRSV N蛋白单抗为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，用ECL化学发光显色液显色并观察结果。
1.3 统计学分析各试验均平行重复3次，利用Graphrap Prism 8软件采用T-test方法对试验数据进行统计学分析。
2 结果 2.1 重组慢病毒载体的构建全基因合成633 bp的eIF5A序列，双酶切后连接至载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro，获得的重组载体转化至感受态细胞DH5α，用氨苄抗性LB培养基扩培，提取重组载体测序后得到慢病毒表达载体pLV-CMV-eIF5A-EF1a-Puro。将pLV-CMV-eIF5A-EF1a-Puro和包装载体psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞包装得到重组慢病毒。
2.2 细胞活性检测按每孔104个细胞的密度将MARC-145-eIF5A细胞和对照组细胞接种至96孔板，分别在0、6、12、24、36和48 h每孔加10 μL MTS，每个时间点做3个重复，37 ℃培养箱中放置2 h后测得490 nm波长下的OD值，发现MARC-145-eIF5A细胞未出现生长缓慢或细胞死亡等情况，细胞活性正常(图 1)。
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ns. P>0.05 图 1 MTS法检测MARC-145-eIF5A细胞系的细胞活性 Fig. 1 The cell viability of MARC-145-eIF5A cell line was detected by MTS method |
2.3.1 Real-time PCR鉴定 为检测MARC-145-eIF5A细胞系中eIF5A mRNA的表达水平，收集细胞提取总RNA反转录得到cDNA，再通过Real-time PCR检测eIF5A基因的表达情况。MARC-145-eIF5A细胞系的eIF5A mRNA表达量与对照组相比显著上调(P < 0.01)(图 2A)。
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A. Real-time PCR检测构建MARC-145-eIF5A细胞的eIF5A mRNA表达水平(**. P < 0.01)；B. Western blot检测构建MARC-145-eIF5A细胞的eIF5A蛋白表达水平；C. IFA验证eIF5A蛋白在MARC-145-eIF5A细胞系和对照组中的表达 A. The mRNA expression of eIF5A in MARC-145-eIF5A cells was detected by Real-time PCR (**. P < 0.01); B. The expression of eIF5A protein in MARC-145-eIF5A cells was detected by Western blot; C. IFA was used to verify the expression of eIF5A protein in MARC-145-eIF5A cell line and the control group 图 2 MARC-145-eIF5A细胞系的筛选与鉴定 Fig. 2 Screening and identification of MARC-145-eIF5A cell line |
2.3.2 Western blot鉴定 使用Western blot检测MARC-145-eIF5A细胞和对照组中eIF5A的表达(图 2B)，结果显示，与对照组相比MARC-145-eIF5A细胞系的eIF5A蛋白表达量显著增多。
2.3.3 IFA鉴定 以eIF5A单抗作为一抗，在倒置荧光显微镜下可观察到MARC-145-eIF5A细胞的荧光信号与对照组细胞相比显著增多(图 2C)。表明筛选得到的MARC-145-eIF5A细胞中eIF5A的表达量显著增多。
2.4 eIF5A稳定表达对PRRSV滴度的影响PRRSV分别接种MARC-145-eIF5A细胞系和对照组细胞，分别于12、24、36、48、72 hpi收获病毒液，进行TCID50试验并绘制病毒生长曲线，结果显示：在MARC-145-eIF5A细胞系各个时间点收获PRRSV病毒液的滴度显著高于对照组(P < 0.05)，这表明体外稳定表达eIF5A显著促进了PRRSV的增殖(图 3)。
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*. P < 0.05 图 3 eIF5A稳定表达对PRRSV滴度的影响 Fig. 3 Effect of eIF5A stable expression on PRRSV titer |
为了验证eIF5A对PRRSV N基因表达的影响，用PRRSV感染MARC-145-eIF5A细胞系和对照组细胞，于12、24 hpi收集细胞后用Real-time PCR方法检测PRRSV N基因的表达，结果显示：稳定表达eIF5A细胞中的PRRSV N 基因的拷贝数显著高于对照组(P < 0.01)(图 4A)。
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A. Real-time PCR检测PRRSV感染MARC-145-eIF5A细胞中PRRSV N基因的表达(**. P < 0.01)；B. Western blot检测PRRSV N蛋白的表达；C. IFA检测PRRSV N蛋白的表达 A. The expression of PRRSV N gene in MARC-145-eIF5A cells infected with PRRSV was detected by Real-time PCR (**. P < 0.01); B. The expression of PRRSV N was detected by Western blot; C. The expression of PRRSV N was detected by IFA 图 4 PRRSV在MARC-145-eIF5A细胞的增殖情况 Fig. 4 PRRSV proliferation in MARC-145-eIF5A cells |
2.6.1 Western blot试验 用PRRSV感染MARC-145-eIF5A细胞系和对照组细胞后，于24 hpi收获细胞进行Western blot试验，结果显示：稳定表达eIF5A细胞中的PRRSV N蛋白的表达量显著高于对照组(图 4B)，说明体外稳定表达eIF5A促进了PRRSV的增殖。
2.6.2 IFA试验 通过IFA试验(图 4C)在倒置荧光显微镜下观察到MARC-145-eIF5A细胞与对照组细胞相比，荧光信号均有不同程度的增多，表明eIF5A对PRRSV的增殖有促进作用。
3 讨论自1987年PRRS暴发以来，PRRSV一直都是困扰养猪业的难题[13]。PRRSV作为一种RNA病毒，极易发生重组和变异产生新的毒株，导致疫苗免疫效果欠佳[14]。PRRSV传播迅速，可通过抑制宿主的先天免疫机制在宿主体内大量繁殖，继发混合感染，引起较高的死亡率，不仅严重威胁我国畜牧业的健康发展，还给全球养猪业造成巨大经济损失。目前，对PRRSV的复制机制知之甚少，PRRSV的防控存在诸多问题。深入研究PRRSV与宿主的相互作用将有利于预防和控制PRRSV的感染和传播。
eIFs包括eIF1、eIF2、eIF3、eIF4E、eIF2α、eIF5A等12种家族成员，多数以单个亚基形式存在，它们调控蛋白翻译起始和细胞生长、迁移等生命活动。近年来，研究发现eIFs是调控病毒感染的靶标：Elsby等[15]发现eIF2能够抑制水泡口炎病毒的翻译，Cencic等[16]研究发现阻断eIF4E与eIF4G之间的相互作用可以抑制人类冠状病毒的复制，石俊超等[17]研究发现eIF2α磷酸化可激活PERK-elF2α信号通路促进干扰素的产生，进而抑制猪血凝性脑脊髓炎病毒的复制。
eIF5A在真核生物、古细菌中广泛存在，其序列高度保守，在蛋白质翻译、mRNA转运和细胞的持续性增殖方面起重要作用[18]。前人研究表明，eIF5A通过核糖体亚基和mRNA形成复合体影响蛋白质翻译的起始，进而影响多种病毒的复制，包括埃博拉病毒[19]、马尔堡病毒[11]、人类免疫缺陷病毒[12]等，但eIF5A是否在PRRSV复制过程中发挥作用尚不清楚。本研究利用慢病毒系统建立稳定表达eIF5A的MARC-145-eIF5A细胞系，通过Real-time PCR、IFA、Western blot和TCID50试验，分别从PRRSV N基因及N蛋白的表达水平，PRRSV滴度等几个方面证明，在MARC-145-eIF5A细胞中PRRSV的增殖被显著促进。由此可见，eIF5A在PRRSV感染过程中起着促进PRRSV增殖的作用，但具体作用机制尚不清楚，课题组将做进一步研究。
4 结论本研究成功构建了稳定表达eIF5A的MARC-145-eIF5A细胞系。通过IFA、Real-time PCR、Western blot和TCID50试验验证了PRRSV在MARC-145-eIF5A细胞系的增殖情况：IFA结果显示，与对照组细胞相比MARC-145-eIF5A细胞PRRSV的荧光信号显著增多；Real-time PCR检测显示，MARC-145-eIF5A细胞系中PRRSV N基因的拷贝数显著高于对照组(P < 0.05)；Western blot检测显示，MARC-145-eIF5A细胞系中PRRSV N蛋白表达水平显著高于对照组；TCID50检测显示，MARC-145-eIF5A细胞系中不同感染时间的PRRSV滴度均显著高于对照组(P < 0.05)。以上结果均表明：体外稳定表达eIF5A蛋白能够显著促进PRRSV的增殖。本研究为探究eIF5A调控PRRSV复制的分子机制提供工具，也为PRRSV防控提供新思路。
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(编辑 白永平)