表 1(Table 1)
图 1(Fig. 1)
双香豆素对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外抑制作用
引用本文
李倬伟, 王方, 王君君, 陈祯涵, 李焕荣, 周双海, 刘雪威. 双香豆素对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外抑制作用[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(3): 1160-1168.
LI Zhuowei, WANG Fang, WANG Junjun, CHEN Zhenhan, LI Huanrong, ZHOU Shuanghai, LIU Xuewei. Inhibitory Effect of Dicumarol on Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in vitro[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2023, 54(3): 1160-1168.
双香豆素对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外抑制作用
北京农学院动物科学技术学院, 北京 100096
摘要：为探究双香豆素(DIC)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的影响，本研究首先通过CCK-8法检测DIC对Marc-145细胞的细胞毒性，并计算其半数毒性浓度(CC50)；进而使用荧光定量PCR和Western blot检测DIC对PRRSV增殖水平的影响；通过不同给药方式处理细胞进一步探究DIC针对的PRRSV增殖阶段。结果表明，DIC对Marc-145细胞的细胞毒性CC50为96.11 μmol·L-1，并在浓度为25 μmol·L-1时即表现出明显的抗PRRSV活性；DIC可以呈剂量依赖性地抑制不同时间和不同滴度的PRRSV增殖。DIC对PRRSV感染周期的吸附、入胞和释放阶段无影响，但是可明显抑制PRRSV的复制阶段。本研究证实DIC以较低浓度在Marc-145细胞中表现出明显的抗PRRSV活性，并主要针对PRRSV的复制阶段。本研究提示双香豆素具备开发成临床抗病毒药物或添加剂的潜力，为新的PRRSV抗病毒药物的研发提供理论依据。
关键词：双香豆素 猪繁殖与呼吸综合征病毒 PRRSV 抗病毒
Inhibitory Effect of Dicumarol on Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in vitro
College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 100096, China
Abstract: In this study, we investigated the effect of dicumarol (DIC) on the proliferation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Firstly, the cytotoxicity of DIC on Marc-145 cells was detected by CCK-8 method and calculated the half toxicity concentration (CC50). Then, the effect of DIC on the proliferation of PRRSV was detected using qPCR and Western blot. Further, DIC targeted stage of PRRSV proliferation were explored by treating the cells with different administration methods. The results showed that the CC50 of DIC against Marc-145 cells was 96.11 μmol·L-1 and DIC exhibited significant anti-PRRSV activity at a concentration of 25 μmol·L-1; DIC inhibited PRRSV proliferation in a dose-dependent manner at different times and titers. DIC had no effect on the adsorption, entry and release of the PRRSV infection cycle but significantly inhibited the replication of PRRSV. This study confirmed that DIC exhibited significant anti-PRRSV activity in Marc-145 cells at low concentrations and mainly targeted the replication phase of PRRSV, suggesting that DIC have the potential to be developed into clinical antiviral drugs or additives, providing a theoretical basis for the development of new PRRSV antiviral drugs.
Key words:
dicumarol porcine reproductive and respiratory syndrome virus PRRSV antiviral
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是危害世界养猪业最严重的病毒性疾病之一，临床表现主要包括妊娠母猪流产、早产、产死胎和木乃伊胎，仔猪消瘦、生长缓慢以及成活率下降等，以及各年龄育肥猪的呼吸系统疾病。其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)能够诱导机体免疫抑制，导致继发感染或混合感染[1]。PRRSV的另一特点是变异速度较快。目前，我国主要流行亚型为PRRSV-2(高致病毒株、NADC-30样毒株和NADC-34样毒株)，近年来，陆续出现PRRSV-1[2-5]。此外，我国多地免疫猪群出现野毒株和疫苗毒株重组的新毒株，并呈现多毒株并存的现象[6]，提示现有的商品化疫苗并不能提供很好的交叉保护，给该病的有效免疫防控带来巨大困难。因此，新的PRRSV防控手段的研发迫在眉睫。抗病毒药物是控制病毒性疾病的一个重要研究方向。天然产物，特别是传统中草药分布广泛、简便易得、低毒，并且可以作为动物饲料的一部分[7]。因其在临床治疗病毒感染性疾病中疗效显著，成为新药物发现的宝贵资源。目前，已经证明多种天然化合物可作为抗PRRSV的潜在药物[8-10]。双香豆素[3, 3-亚甲基双(4-羟基香豆素), dicumarol, DIC]存在于芸香科植物、伞形科植物、菊科植物、豆科植物，主要作为一种抗凝剂用于血栓的预防和治疗，同时也可以通过调节酶活性、诱导细胞凋亡等机制，具有一定的抗病毒作用[11-14]。DIC对PRRSV是否具有抑制作用尚未可知。因此研究DIC对PRRSV增殖的影响并确定其机制，能够为PRRSV预防和控制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 细胞和病毒 Marc-145细胞(非洲绿猴肾上皮细胞)及高致病性PRRSV毒株BB0907均由南京农业大学姜平教授馈赠。
1.1.2 主要试剂与仪器 双香豆素(dicumarol，DIC)购自上海麦克林生化科技有限公司；PRRSV N蛋白单克隆抗体由南京农业大学姜平教授馈赠；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)购自上海碧云天生物技术有限公司；RNA提取试剂TRIzol、DMEM均购自Invitrogen公司。恒温二氧化碳无菌细胞培养箱(Thermo，型号：3543)；荧光定量PCR仪(Stratagene公司，型号：Mx 3005P)；酶标仪(Bio-RAD，型号：BR-680)。
1.2 方法1.2.1 Western blot 使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，按照碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。根据BCA结果将各组蛋白浓度调整统一。加入5×Loading Buffer混匀后，置于100 ℃沸水中煮10 min。利用12.5%聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质样品，并电印迹到硝酸纤维素膜膜上，通过封闭、孵育PRRSV N蛋白单克隆抗体(1∶1 500)、孵育辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶2 000)等步骤检测目标蛋白。
1.2.2 荧光定量PCR 每孔Marc-145细胞加入200 μL TRIzol收集细胞，按照总RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，依据HiScript Ⅱ 1 st Strand cDNA Synthesis进行RNA反转录。以cDNA为模板，依据qPCR SYBE Green Master Mix说明书进行qPCR。反应体系：2× SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，模板0.2 μL，引物F、R(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ROX Reference Dye (20 μmol·L-1)，RNase free water 8.6 μL。反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，1个循环。同时设定阴性对照，获得Ct值。目的基因的mRNA的相对表达采用2-△△Ct法分析[15]。所有处理组均重复检测3次。引物详见表 1。
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表 1 荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for qPCR |
1.2.3 DIC对Marc-145细胞的毒性测定 在96孔板中培养Marc-145细胞，待细胞汇合度达到70%时，吸弃孔中培养液，加入用DMEM稀释的不同浓度的DIC溶液(0、1.925、3.9、7.812 5、31.25、62.5、125、250、500、1 000 μmol·L-1)，置37 ℃培养箱培养48 h后弃去药液，每孔加入10 μL CCK-8溶液和200 μL细胞培养液，37 ℃温箱继续孵育2 h，通过酶标仪测定各组OD450 nm值，利用Graphpad软件计算出DIC对Marc-145细胞的CC50。
1.2.4 DIC对PRRSV的50%抑制浓度(IC50)的测定 将DIC用营养液稀释成不同浓度，同时设立含等量DMSO的阴性对照组；接种PRRSV(0.01 MOI)，37 ℃孵育30 h，吸弃细胞上清；进行间接免疫荧光试验：将细胞用PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%TritonX-100透膜30 min，用PBS洗3次，每次5 min。加入PRRSV N蛋白单克隆抗体(1∶1 000稀释)，37 ℃孵育细胞1 h；PBS洗细胞3次，3 min·次-1；加入绿色荧光二抗Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀释，Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG，A0428，上海碧云天生物技术有限公司)，37 ℃孵育45 min；于室温下用DAPI染色细胞核10 min；荧光显微镜下观察结果；用尼康A1共聚焦显微镜随机记录3张照片；用ImageJ软件测定其荧光值强度；利用GraphPad Prism 7.0软件统计并计算出DIC对PRRSV的50%抑制浓度(IC50)。
1.2.5 DIC的抗PRRSV活性测定 在24孔板中培养Marc-145细胞，待细胞汇合度达到60%时，将营养液换成含有不同浓度DIC(5、10和25 μmol·L-1) 的10% DMEM培养液。培养细胞12 h，吸弃孔中培养液，用无菌PBS洗1遍后，接种0.1MOI的PRRSV。于37 ℃孵育1 h后弃去病毒液，PBS充分洗涤，再将含有DIC的2% DMEM重新加入细胞孔中，培养36 h，进行qPCR检测PRRSV ORF7的mRNA含量；Western blot检测PRRSV的N蛋白含量；反复冻融3次，检测病毒的TCID50。
1.2.6 DIC不同给药时间对PRRSV感染周期影响的测定 在24孔板中培养Marc-145细胞，待细胞汇合度达到60%时，按试验分组(全程不给药M1、预处理阶段+复制全周期给药M2、预处理阶段+吸附阶段给药M3、吸附阶段给药M4、入侵阶段给药M5、复制阶段给药M6、仅预处理阶段给药M7)接种0.1MOI的PRRSV及DIC。在24 hpi收获细胞，进行荧光定量PCR，检测PRRSV ORF7的mRNA含量；进行Western blot，检测N蛋白含量。
1.2.7 DIC对PRRSV吸附阶段影响的测定 将长满单层的培养在24板中的Marc-145细胞置于4 ℃预冷1 h。弃液，用预冷的PBS清洗细胞表面3次，加入不同浓度的DIC并接种PRRSV(1 MOI)，同时设立DMSO对照组。将细胞板置于4 ℃冰箱中1 h，用预冷的PBS清洗细胞表面3次，然后裂解细胞进行细胞RNA的提取，用qPCR检测细胞内PRRSV ORF7 mRNA含量。
1.2.8 DIC对PRRSV入胞阶段影响的测定 将细胞汇合度达到70%的Marc-145细胞，用浓度为10 μg·mL-1蛋白合成抑制剂环乙酰亚胺(cycloheximide，CHX)预处理12 h，用预冷的PBS清洗细胞表面后接种PRRSV(1MOI)，4 ℃孵育1 h。再次用预冷的PBS清洗细胞3次，去除游离的病毒粒子，加入含有DIC(25 μmol·L-1)或DMSO的DMEM，37 ℃孵育30 min。用柠檬酸缓冲液(pH=3)洗涤细胞以去除未内化的病毒。用qPCR检测细胞内PRRSV ORF7 mRNA含量。
1.2.9 DIC对PRRSV复制阶段影响的测定 对汇合度达到70%Marc-145细胞接种1 MOI PRRSV，37 ℃培养6 h，用PBS清洗细胞3次，加入含DIC(25 μmol·L-1)或DMSO的新鲜DMEM(含2% FBS)，37 ℃孵育。在7、8和9 h后，用qPCR检测细胞内PRRSV ORF7 mRNA含量。
1.2.10 DIC对PRRSV释放阶段影响的测定 对汇合度达到70%的Marc-145细胞接种0.1 MOI PRRSV，37 ℃孵育1 h，吸弃孔内病毒液，加入含2% FBS的DMEM。在18 hpi时，用PBS洗涤细胞3次，加入含有DIC(25 μmol·L-1)或DMSO的DMEM(含2% FBS)，并在37 ℃下继续培养10、30和60 min，分别收获上清液。用绝对荧光定量检测细胞上清中存在的病毒含量。
1.3 统计学方法本研究中使用GraphPad prism 8.0软件(One-way ANOVA test)进行统计学分析绘图，所有数据都被表示为“平均值±标准差(x±s)”，P < 0.05(*)表示差异显著，P < 0.01(**)、P < 0.001 (***)和P < 0.000 1(****)表示差异极显著。
2 结果 2.1 DIC对Marc-145细胞的细胞毒性测定DIC的结构式如图 1A所示。用不同浓度DIC溶液处理Marc-145细胞，通过CCK8试验检测细胞毒性。结果显示：当DIC浓度 < 31.25 μmol·L-1时，CCK-8检测DIC对Marc-145细胞无明显毒性。通过GraphPad软件分析，DIC对Marc-145细胞的CC50为96.11 μmol·L-1(图 1B)。用不同浓度(0~150 μmol·L-1)的DIC或溶剂DMSO处理细胞后，接种PRRSV(0.01 MOI)，30 h进行间接免疫荧光试验，通过统计DIC与DMSO对照组的PRRSV荧光，计算出DIC对PRRSV的IC50为12.75 μmol·L-1。CC50较高，IC50较低，说明DIC对Marc-145细胞毒性较低，且在该细胞上对PRRSV具有较好的抗病毒作用。
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A.双香豆素的化学式；B. 双香豆素的CC50测定；C. 双香豆素的IC50测定 A. Chemical formula of DIC; B. CC50 determination of DIC; C. IC50 determination of DIC 图 1 双香豆素的化学式及其CC50和IC50测定 Fig. 1 Chemical formula of DIC and the CC50and IC50 determination |
用不同浓度DIC(5、10和25 μmol·L-1)处理Marc-145细胞12 h后，接种0.1 MOI的PRRSV。于37 ℃培养36 h(培养过程营养液中含有对应浓度DIC)。通过qRT-PCR检测PRRSV ORF7的mRNA含量；Western blot检测PRRSV的N蛋白含量；并反复冻融3次，检测病毒的TCID50。结果显示：与对照组(未添加DIC组)相比，DIC处理组Marc-145细胞中PRRSV的N蛋白表达量(图 2A)与ORF7 mRNA的相对表达量(图 2B)降低，并呈剂量依赖性。DIC浓度为25 μmol·L-1的给药组，差异最为显著(P＜0.000 1)，几乎检测不到N蛋白。同时，不同浓度给药组TCID50结果也显示DIC可以抑制PRRSV的增殖，并呈剂量依赖性(图 2C)。
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A. Western blot检测DIC剂量依赖性抑制PRRSV增殖；B. qPCR法检测DIC剂量依赖性抑制PRRSV增殖；C. TCID50检测DIC剂量依赖性抑制PRRSV增殖。*.P < 0.05，**.P < 0.01，***.P < 0.001，****.P < 0.000 1，ns. P>0.05，下图同 A.Western blot was used to detect the dose-dependent inhibition of PRRSV proliferation by DIC; B. The dose-dependent inhibition of PRRSV proliferation by DIC was detected by qPCR; C. TCID50 detection of DIC dose-dependent inhibition of PRRSV proliferation. *.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, ****.P < 0.000 1, ns. P>0.05, the same as below 图 2 DIC剂量依赖性抑制PRRSV增殖 Fig. 2 DIC dose-dependent inhibition of PRRSV proliferation |
检测DIC在PRRSV增殖的不同时间的作用，分别在病毒接种后的12、24和48 h进行Western blot和qPCR，比较DIC处理组和未处理组细胞内N蛋白表达量与ORF7 mRNA含量的区别。结果如图 3显示，与对照组相比，同一时间点的DIC给药组中PRRSV的N蛋白表达量(图 3A)与ORF7 mRNA的相对表达量(图 3B)显著降低。表明DIC在PRRSV增殖的不同时间均具有抑制病毒增殖的作用。
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A. Western blot检测N蛋白含量；B. qPCR检测ORF7 mRNA的相对表达量 A. Western blot for N protein content; B. qPCR method for relative expression of ORF7 mRNA 图 3 DIC抑制不同时间的PRRSV增殖 Fig. 3 DIC inhibits PRRSV proliferation at different time |
用不用滴度的PRRSV接种Marc-145细胞，检测DIC是否对不同滴度的病毒具有抑制作用。结果显示，PRRSV在高剂量(0.1MOI)和低剂量(0.01MOI)时，DIC给药组中PRRSV的N蛋白表达量(图 4A)与ORF7 mRNA的相对表达量(图 4B)都显著降低。表明DIC可对不同滴度的PRRSV的增殖起到抑制作用。
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A. Western blot检测DIC抑制不同滴度PRRSV增殖；B. qPCR检测DIC抑制不同滴度PRRSV增殖 A.Western blot showed that DIC inhibited the proliferation of PRRSV with different titers; B. Detection of DIC inhibiting PRRSV proliferation with different titers by qPCR 图 4 DIC可抑制不同滴度的PRRSV增殖 Fig. 4 DIC can inhibit the proliferation of PRRSV with different titers |
为了确定DIC抑制PRRSV增殖的具体机制，首先建立了时间过程分析，以确定DIC的抗PRRSV活性阶段，时间过程分为7组(全程不给药M1、预处理阶段+病毒增殖全过程M2、预处理阶段+吸附阶段给药M3、吸附阶段给药M4、入侵阶段给药M5、复制阶段给药M6、仅预处理阶段给药M7)(图 5A)。结果显示，与M1对照组相比，M2和M6给药组的PRRSV的N蛋白(图 5B)和ORF7 mRNA(图 5C)表达水平均显著降低。表明DIC可能主要在PRRSV的复制周期发挥抗病毒作用。
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A.在不同PRRSV感染时间段给药分组；B. Western blot检测DIC抑制不同时期PRRSV增殖；C. qPCR法检测DIC抑制不同时期PRRSV增殖 A. Different treatment times of DIC and infection time of PRRSV; B. Western blot for N protein content; C. qPCR detection of relative expression of ORF7 mRNA 图 5 感染前后不同时间加入DIC对PRRSV增殖的抑制作用 Fig. 5 Inhibition of PRRSV proliferation by adding DIC at different times before and after infection |
为了进一步确定DIC影响PRRSV感染周期的具体阶段，分别在PRRSV的吸附、入胞、复制和释放阶段检测DIC的作用。
利用qPCR检测加入不同浓度的DIC并接种PRRSV(1 MOI)的Marc-145细胞内PRRSV ORF7 mRNA含量，结果如图 6A所示，DIC对PRRSV吸附阶段无影响。
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A. qPCR检测DIC对PRRSV吸附阶段的影响；B. qPCR检测DIC对PRRSV入胞阶段的影响；C.qPCR检测DIC对PRRSV复制阶段的影响；D. 绝对荧光定量PCR检测DIC对PRRSV释放阶段的影响 A.qPCR method was used to detect the effect of DIC on the adsorption stage of PRRSV; B. qPCR method was used to detect the effect of DIC on the entry stage of PRRSV; C. qPCR was used to detect the effect of DIC on the replication stage of PRRSV; D. Effect of DIC on PRRSV release phase detected by absolute fluorescence quantitative PCR 图 6 DIC对PRRSV不同复制阶段的影响 Fig. 6 Effects of DIC on different replication stages of PRRSV |
进而，用CHX预处理Marc-145细胞，再接种PRRSV(1 MOI)，清洗细胞后加入含有DIC (25 μmol·L-1)或DMSO的DMEM，洗涤细胞，用qPCR检测进入细胞内的PRRSV的ORF7 mRNA含量，结果如图 6B所示，DIC对PRRSV入胞阶段无影响。
将Marc-145细胞接种PRRSV后，分别在7、8和9 hpi收集细胞，检测细胞内ORF7 mRNA的相对表达量(图 6C)，8和9 hpi组的DIC处理的细胞内ORF7 mRNA的相对表达量显著降低，表明DIC对PRRSV复制阶段有抑制作用。
Marc-145细胞接种0.1 MOI PRRSV，洗涤后加入含有DIC(25 μmol·L-1)或DMSO的DMEM(含2% FBS)，继续培养10~60 min，分别收获细胞上清液用绝对荧光定量检测PRRSV含量。结果显示，10、30和60 min DIC处理组与对照组相比，细胞上清中的病毒含量无差别(图 6D)。表明DIC不影响PRRSV的释放阶段。
综上，DIC能够抑制HP-PRRSV的复制阶段。
3 讨论PRRSV对生猪养殖产业造成的经济损失巨大，并在传播和进化过程中极易发生变异。目前，传统PRRS疫苗保护效果不佳，因此，迫切需要新手段来降低该病毒对养殖行业的影响[16-18]。当前在临床上正使用的抗病毒药，价格昂贵且易产生耐药性[3, 19]。鉴于此，基于天然产物的药物治疗具有较大的替代潜力[20]。双香豆素存在于多种植物中，来源广泛。在临床上双香豆素因其与维生素K的化学结构相似而被用作天然抗凝剂，其临床应用时间长，安全性高[21-22]。近年来，一些研究证明了DIC的抗病毒活性，如DIC在体外具有抑制狂犬病病毒复制的活性[23]；DIC对多种亚型的流感病毒具有预防或治疗作用[24]；此外，DIC表现出显著的抗HBV活性，研究证明，口服DIC显著降低小鼠HBV模型体内的病毒DNA含量[14]。
本研究对双香豆素是否具有抑制PRRSV增殖作用进行了初步探究，证明了DIC在较低浓度时可有效抑制PRRSV在Marc-145细胞上增殖，其机制主要作用于病毒的复制阶段。首先确定双香豆素在Marc-145细胞上的毒性较低，其CC50为96.11 μmol·L-1，但其在25 μmol·L-1时即可表现出较高的抗PRRSV活性，说明其抗PRRSV效果较好。在PRRSV感染的不同时间，DIC均可以抑制PRRSV的增殖；并对高剂量和低剂量的PRRSV均具有抗病毒活性。以上提示DIC对不同程度PRRSV感染均有抑制作用。同时，本研究对DIC抗病毒的具体阶段进行了探究，证明DIC主要抑制PRRSV的复制阶段，提示DIC具有作为PRRSV治疗药物或添加剂的潜力，而不是一种预防性的药物。
4 结论本研究证明天然产物双香豆素在体外对PRRSV的感染具有抑制作用，且主要针对其复制阶段，为双香豆素在临床上治疗PRRS提供理论依据。
参考文献
| [1] |
LUNNEY J K, FANG Y, LADINIG A, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): pathogenesis and interaction with the immune system[J]. Annu Rev Anim Biosci, 2016, 4: 129-154. DOI:10.1146/annurev-animal-022114-111025 |
| [2] |
YIN B S, QI S S, SHA W L, et al. Molecular characterization of the Nsp2 and ORF5 (ORF5a) genes of PRRSV strains in nine provinces of China during 2016-2018[J]. Front Vet Sci, 2021, 8: 605832. DOI:10.3389/fvets.2021.605832 |
| [3] |
ZHAI S L, LIN T, ZHOU X, et al. Phylogeographic analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus 1 in Guangdong province, Southern China[J]. Arch Virol, 2018, 163(9): 2443-2449. DOI:10.1007/s00705-018-3873-z |
| [4] |
ZHU Z B, YUAN L L, HU D H, et al. Isolation and genomic characterization of a Chinese NADC34-like PRRSV isolated from Jiangsu province[J]. Transbound Emerg Dis, 2022, 69(4): e1015-e1027. |
| [5] |
ZHANG Q Y, JIANG P, SONG Z B, et al. Pathogenicity and antigenicity of a novel NADC30-like strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China[J]. Vet Microbiol, 2016, 197: 93-101. DOI:10.1016/j.vetmic.2016.11.010 |
| [6] |
XIE C Z, WANG Z, HA Z, et al. Genetic characterization of a new NSP2-deletion porcine reproductive and Respiratory Syndrome Virus in China[J]. Microb Pathog, 2021, 150: 104729. DOI:10.1016/j.micpath.2021.104729 |
| [7] |
AKRAM M, TAHIR I M, SHAH S M A, et al. Antiviral potential of medicinal plants against HIV, HSV, influenza, hepatitis, and coxsackievirus: a systematic review[J]. Phytother Res, 2018, 32(5): 811-822. DOI:10.1002/ptr.6024 |
| [8] |
KARUPPANNAN A K, WU K X, QIANG J, et al. Natural compounds inhibiting the replication of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Antiviral Res, 2012, 94(2): 188-194. DOI:10.1016/j.antiviral.2012.03.008 |
| [9] |
LIU X W, BAI J, JIANG C L, et al. Therapeutic effect of Xanthohumol against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruses[J]. Vet Microbiol, 2019, 238: 108431. DOI:10.1016/j.vetmic.2019.108431 |
| [10] |
胡安君, 毕亚楠, 杨婉莉, 等. 甘草酸体外抗PRRSV的作用机制[J]. 中国兽医学报, 2018, 38(7): 1386-1393. HU A J, BI Y N, YANG W L, et al. Mechanism of glycyrrhizic acid against PRRSV in vitro[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2018, 38(7): 1386-1393. (in Chinese) |
| [11] |
HERNANDEZ A, LOÓPEZ-LLUCH G, BERNAL J A, et al. Dicoumarol down-regulates human PTTG1/Securin mRNA expression through inhibition of Hsp90[J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7(3): 474-482. DOI:10.1158/1535-7163.MCT-07-0457 |
| [12] |
魏静, 冯跃平, 郑茜, 等. 双香豆素体外抗肿瘤活性筛选及相关机制初探[J]. 药学学报, 2020, 55(12): 2904-2910. WEI J, FENG Y P, ZHENG X, et al. Anti-tumor activity screening and research on the primary mechanism of dicumarol in vitro[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2020, 55(12): 2904-2910. (in Chinese) |
| [13] |
CHEN C H, HSIEH Y C, YANG P M, et al. Dicoumarol suppresses HMGA2-mediated oncogenic capacities and inhibits cell proliferation by inducing apoptosis in colon cancer[J]. Biochem Res Commun, 2020, 524(4): 1003-1009. DOI:10.1016/j.bbrc.2020.01.147 |
| [14] |
CHENG S T, HU J L, REN J H, et al. Dicoumarol, an NQO1 inhibitor, blocks cccDNA transcription by promoting degradation of HBx[J]. J Hepatol, 2021, 74(3): 522-534. DOI:10.1016/j.jhep.2020.09.019 |
| [15] |
LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408. DOI:10.1006/meth.2001.1262 |
| [16] |
SCORTTI M, PRIETO C, ÁLVAREZ E, et al. Failure of an inactivated vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome to protect gilts against a heterologous challenge with PRRSV[J]. Vet Rec, 2007, 161(24): 809-813. |
| [17] |
ROSE N, RENSON P, ANDRAUD M, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSv) modified-live vaccine reduces virus transmission in experimental conditions[J]. Vaccine, 2015, 33(21): 2493-2499. DOI:10.1016/j.vaccine.2015.03.040 |
| [18] |
HOLTKAMP D J, KLIEBENSTEIN J B, NEUMANN E J, et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers[J]. J Swine Health Prod, 2013, 21(2): 72-84. |
| [19] |
KHATUN A, SHABIR N, SEO B J, et al. The attenuation phenotype of a ribavirin-resistant porcine reproductive and respiratory syndrome virus is maintained during sequential passages in pigs[J]. J Virol, 2016, 90(9): 4454-4468. DOI:10.1128/JVI.02836-15 |
| [20] |
BEN-SHABAT S, YARMOLINSKY L, PORAT D, et al. Antiviral effect of phytochemicals from medicinal plants: applications and drug delivery strategies[J]. Drug Deliv Trans Res, 2020, 10(2): 354-367. DOI:10.1007/s13346-019-00691-6 |
| [21] |
SUN C, ZHAO W W, WANG X M, et al. A pharmacological review of dicoumarol: an old natural anticoagulant agent[J]. Pharmacol Res, 2020, 160: 105193. DOI:10.1016/j.phrs.2020.105193 |
| [22] |
WISHART J H, CHAPMAN C B. Dicumarol therapy in congestive heart failure[J]. N Engl J Med, 1948, 239(19): 701-704. DOI:10.1056/NEJM194811042391902 |
| [23] |
徐梦娴, 李明凯, 涂忠忠, 等. 香豆素化合物体内外抗狂犬病病毒的效果[J]. 中国兽医学报, 2019, 39(2): 250-259. XU M X, LI M K, TU Z Z, et al. Inhibition of rabies virus by coumarin in vitro and in vivo[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2019, 39(2): 250-259. (in Chinese) |
| [24] |
陈绪林, 安利伟. 双香豆素在制备治疗或预防流感病毒感染的药物中的应用: 中国, 103720687A[P]. 2014-04-16. CHEN X L, AN L W. Application of bicoumarins in the preparation of drugs for the treatment or prevention of influenza virus infection: CN, 103720687A[P]. 2014-04-16. (in Chinese) |
(编辑 孟培)