近年来，我国奶牛养殖业规模化程度不断提高，奶牛养殖业稳步推进升级转型，并取得了良好的效果。然而随着全球变暖问题日益加剧，环境气候因素成为限制奶牛养殖业发展的重要核心问题之一，特别是夏季奶牛热应激对奶牛生产性能与健康的影响引起广泛关注。由于奶牛的被毛和体组织保温效果好、汗腺机能极不发达，高温易造成体温失调。当环境温度升高到一定程度时，奶牛产热大于散热，就会出现体温升高、食欲减弱、呼吸急促、产奶量和乳脂率降低、激素分泌失调[1-2]、新陈代谢异常和身体机能下降，进而引发繁殖疾病等[3]一系列变化。刘琦[4]研究发现，持续高温下机体会发生严重的氧化应激损伤，导致免疫功能受损。围产初期的奶牛由于生理的应激反应，以及乳腺组织中相关防御细胞和细胞因子、乳汁中免疫活性物质的变化等因素使乳腺防御能力下降，使其乳腺感染的机会增加。所以，提高奶牛抵抗氧化应激能力对于预防奶牛疾病的发生尤为重要，但目前仍然缺乏有效的防治手段和方法。因此，如何科学有效缓解氧化应激对奶牛机体造成损伤逐渐成为研究的重点。
网络药理学借助计算机技术、系统生物学、多向药理学等多学科的交叉融合，形成了以网络靶标为核心的技术体系。不仅可应用于新药的研发，也适用于分析天然药物多成分、多靶点、多通路的复杂功能等特点，科学地阐明“中药-靶点-疾病”关系，因此，网络药理学在中药现代研究中显示了巨大的潜力[5]。网络药理学从药物和疾病之间互作的整体性和系统性出发，进行潜在药效物质、作用靶点及通路互作网络预测，为中药药效相关物质的基础研究提供参考，是发展创新药物的重要途径。
青蒿是菊科植物黄花蒿的干燥地上部分，味苦、辛，性寒，可通过靶向作用途径，表现出抗氧化等多种药理作用[6-7]。据报道，中药青蒿中倍半萜、黄酮和香豆素等成分具有解热、抗炎、抗病原微生物、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性[8]，特别是黄花蒿，作为青蒿素的唯一天然来源，是目前最常用的抗疟特效药[9]。此外，青蒿提取物能够通过清除自由基、提高抗氧化酶活性起到抗氧化作用[10]。近年来研究发现，青蒿在奶牛养殖中发挥了较好抗氧化作用，能够显著降低隐性乳房炎奶牛所产牛奶的体细胞数，提高了奶牛的生产性能[11]。侯伟[12]研究表明，将青蒿提取物与牛奶混匀后饲喂给犊牛，可以提高犊牛采食量和日增重，增加血液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，提高免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)的浓度并提高犊牛机体的免疫力。余诗强等[13-14]在饲粮中添加青蒿提取物，显著提高了奶牛的产奶量，有效降低奶牛血浆中丙二醛(MDA)浓度，提高还原型谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低瘤胃内乙酸浓度以及乙酸和丙酸比值，总挥发性脂肪酸、丙酸和丁酸显著升高，且发现青蒿提取物的最适添加水平为100 g·d－1，虽然青蒿提取物的添加在奶牛上显示出了抗氧化、抗炎、提高免疫力等作用，但关于青蒿是否可缓解奶牛氧化应激损伤及其主要有效成分如何发挥调节作用的机制尚未阐明。因此，本研究应用网络药理学方法对青蒿缓解奶牛氧化应激损伤的作用靶点和分子机制进行探索，以期为青蒿在奶牛生产中的进一步应用提供理论基础，从营养角度缓解奶牛氧化应激损伤提供新策略。
1 材料与方法 1.1 青蒿化学成分的筛选和靶点预测本文以“青蒿”为关键词, 在Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[15]中筛选药物的有效成分。TCMSP筛选青蒿的有效成分时以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为标准[16]。在Universal Protein(Uniprot)数据库(https://www.uniprot.org/)[17]中输入蛋白名称后设置“Bos taurus”“Reviewed”得到转化为对应UniProt数据库的基因名称，去重后得到青蒿活性成分的对应靶点基因。
1.2 氧化应激疾病靶点的获取通过Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)(http://www.omim.org/)[18]、GeneCards(https://www.genecards.org/)[19]和Comparative Toxicogenomics Database(CTD)(http://ctdbase.org/)[20]数据库检索“Heat stress”和“Oxidative stress”，获得氧化应激疾病的靶点基因，去重后即得疾病的对应靶点基因。用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)[21]对青蒿活性成分作用靶点的基因与氧化应激疾病的靶点取交集并作韦恩图。利用Cytoscape 3.9.1[22]软件进行可视化分析，构建青蒿的活性成分-交集靶点网络图。
1.3 蛋白质相互作用网络构建及分析在Search Tool for the Retrieval of Interaction Gene/Proteins(STRING)(https://cn.string-db.org/)[23]数据库中选择“Multiple proteins”, 输入药物成分靶点与疾病靶点的交集基因，限定物种为“Bos taurus”，获得交集蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络，设定“highest confidence(0.900)”和“hide disconnected nodes in the network”，其余参数保持默认。将获得的网络导入Cytoscape 3.9.1进行可视化处理, 应用“Network Analyzer”功能进行网络拓扑分析，计算筛选靶点及有效成分的网络拓扑参数，筛选关键靶点。
1.4 GO功能分析和KEGG信号通路富集分析通过Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery(DAVID)数据库(https://david.ncifcrf.gov/)[24]，对活性成分与热应激靶点交集进行基因本体(Gene ontology，GO)功能分析和KEGG通路富集分析，物种设定为“Bos taurus”。GO功能分析包括生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)分析。将P值从小到大排序，选取排名靠前的富集结果进行作图，用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)作直方图和气泡图，分析青蒿缓解氧化应激的作用机制。
1.5 青蒿成分-靶点-通路网络构建将青蒿的有效成分、交集靶点基因和分析得到的相关KEGG通路信息导入Cytoscape 3.9.1软件中，构建成分-靶点-通路互作的网络图。
2 结果 2.1 青蒿活性成分及其靶点TCMSP数据库中输入“青蒿”，以OB≥30%、DL≥0.18筛选得到22种活性成分；选择“Ingredients”，去除没有对应靶点的青蒿烯(artemisitene)、维采宁-2(vicenin-2_qt)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin)，得到活性成分19种和作用靶点共510个(表 1)。Uniprot数据库将靶点蛋白名称转化为基因名称，去重后共得到217个对应基因靶点。
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表 1 青蒿主要活性成分 Table 1 The main active ingredient of Artemisia carvifolia |
在OMIM、GeneCards和CTD三个数据库中检索“heat stress”和“oxidative stress”，分别得到130、8 873和5 980个相关基因，去重后共获得11 442个对应靶点基因。使用Venny 2.1软件对青蒿活性成分靶点和氧化应激靶点取交集做韦恩图(图 1)，获得136个潜在作用靶点，即为青蒿缓解氧化应激损伤的关键靶点。
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图 1 青蒿作用靶点与氧化应激疾病靶点韦恩图 Fig. 1 Venn diagram of Artemisia carvifolia action target and oxidative stress disease target |
将136个青蒿活性成分与氧化应激交集作用靶点和对应的活性成分导入Cytoscape 3.9.1软件，构建药物-成分-靶点-疾病相互作用网络图(图 2)。结果发现，构建的网络中共有159个节点和486条边将成分相连接。单一成分与多基因相连线，单个基因与多成分连接，表明青蒿通过多成分、多靶点的方式发挥缓解氧化应激疾病的作用。经计算，分别选取连接度高于平均数的活性成分和靶点，最终得到5种关键活性成分和33个关键靶点，其中槲皮素的化合物度值最高(表 2)；靶点为PTGS2的化合物包含了除脱氧青蒿素、青蒿黄素、谷甾醇外的所有化合物。
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绿色代表药物，紫色代表活性成分，红色代表靶点，黄色代表疾病 Color green represents drugs, purple represents active components, red represents target, and yellow represents disease 图 2 青蒿-成分-靶点-氧化应激的拓扑分析网络图 Fig. 2 Topology analysis network diagram of Artemisia carvifolia-component-target-oxidative stress |
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表 2 青蒿缓解奶牛氧化应激的关键成分 Table 2 Key components of Artemisia carvifolia response to oxidative stress of dairy cow |
将青蒿成分作用靶点与氧化应激疾病靶点的136个交集蛋白导入STRING数据库，得到PPI网络(图 3A)。图中有135个节点，176条边，平均节点度为2.61。将相互作用关系导入Cytoscape3.9.1软件，获得PPI网络(图 3B)，该网络共涉及95个节点，176条边。“Analyze Network”插件分析网络的拓扑属性，得到连接度、介度和紧密度。节点大小和颜色表示Degree大小，节点越大、颜色越深，度值就越大。筛选连接度高于平均数的靶点进行可视化，共35个；与“2.3”结果中的关键靶点取交集得到共同靶点有PTGS2、NCOA2、AR、TOP2A、RELA、ESR1、NCOA1、CCNA2、AKT1、CASP3和PPARG(表 3)。
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A.将136个交集蛋白导入STRING数据库建立PPI网络；B.将互作关系导放Cytoscape 3.9.1软件获得PPI网络 A. Struction of PPI network by importing 136 intersection proteins into STRING database; B. Cytoscape 3.9.1 software was applied for visual processing of the PPI network 图 3 蛋白互作网络 Fig. 3 Protein-protein interaction network |
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表 3 青蒿缓解奶牛氧化应激的关键核心靶点 Table 3 Key targets of Artemisia carvifolia response to oxidative stress of dairy cow |
利用DAVID数据库将青蒿活性成分靶点与氧化应激相关蛋白的交集共136个交集蛋白进行GO功能富集分析，共获得462个条目。其中，BP富集分析得到320个条目，包括细胞迁移正向调控(positive regulation of cell migration)、MAPK级联的正向调控(positive regulation of MAPK cascade)、细胞内类固醇激素受体信号通路(intracellular steroid hormone receptor signaling pathway)；CC富集分析得到37个条目，表明青蒿缓解氧化应激的药效机制涉及核质、细胞溶质、染色质等细胞组分；MF富集分析得到105个条目，包括蛋白质异二聚活性(protein heterodimerization activity)、细胞因子活性(cytokine activity)、蛋白酶结合(protease binding)等。本研究选取BP、CC、MF中排名前10位的富集结果进行可视化作图(图 4)。
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X轴代表所占百分比，Y轴代表条目名称，柱形长度代表富集数量，柱形越长富集条目越多 The x-axis represents the percentage, the y-axis represents the item name, the column length represents the enrichment amount, and the longer the column, the more enrichment items 图 4 GO功能富集分析 Fig. 4 GO function enrichment analysis |
利用DAVID数据库将氧化应激相关蛋白的靶点进行KEGG通路分析，筛选排名前20位的富集结果(P＜0.01)进行可视化(图 5)。由图可知，青蒿与氧化应激有关的重要通路有流体剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、PI3K-AKT信号通路(PI3K-AKT signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、C型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)等。图中气泡越大，表示富集到此通路的基因越多。将P值从小到大排序，其中排序越靠前，越可能是青蒿缓解氧化应激的主要生物学功能及作用机制。
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图 5 KEGG通路分析 Fig. 5 KEGG enrichment analysis |
将青蒿的关键成分、关键靶点和分析得到的P值最小的前20个KEGG通路信息导入Cytoscape 3.9.1软件中，构建出成分-靶点-通路相互作用的网络图(图 6)。图中共38个节点，117条边。节点形状越大，该通路或靶点的度值越大。从图中可知，度值最高的靶点是AKT1和RELA；度值最高的通路是脂质和动脉粥样硬化和IL-17信号通路。
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红色代表成分，黄色节点代表靶点，绿色节点代表通路 Color red represents components, yellow nodes represent target sites, and green nodes represent pathways 图 6 成分-靶点-通路拓扑分析网络图 Fig. 6 Topology analysis network diagram of component-target-pathway |
由于高产奶牛具有较高的营养和生理代谢水平，组织暴露在活性氧(ROS)中，引起一氧化氮(NO)等自由基在体内的过量积累，易使其处于生理氧化应激状态。在正常情况下，机体内自由基的产生、利用、清除三者处于动态平衡，当炎症发生时，特定的免疫细胞就会引入相当数量的自由基来援助这些细胞清除病原菌。这时机体内的自由基产生过多，清除自由基的能力减弱，进而引起机体的脂质过氧化发生，生物膜结构遭到破坏，使感染的严重程度增加，从而对奶牛的生产周期造成不利影响，降低了产奶量和经济价值。自由基的清除是由抗氧化系统来完成的，因此，为奶牛补充抗氧化剂是调节抗氧化系统、抑制氧化应激及炎症反应的有效途径。
热应激对奶牛生理机能和新陈代谢具有严重影响，降低采食量以及免疫性能，甚至可导致瘤胃酸中毒以及乳房炎等生理疾病的发生，成为危害奶牛养殖业发展的重要因素之一[25]。为缓解奶牛热应激，人们在奶牛日粮中通常采用调整日粮浓度、补充抗热应激添加剂、加强饲养管理以及改善生长环境等方式。特别是，中草药添加剂在饲料中可显著增强奶牛对高温的适应性、调节机体免疫功能、缓解热应激损伤[26]。据报道，青蒿有抗疟疾、抗癌、抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗氧化等作用以及较强的免疫活性，可以治疗暑邪发热、阴虚发热、夜热早凉等症状[27]。因此，本文应用网络药理学分析青蒿对奶牛氧化应激的保护作用及其作用机制，以期为青蒿在奶牛生产中的应用提供理论依据及为营养改善策略提供新选择。
本研究发现，青蒿缓解氧化应激损伤的主要活性成分是槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素和豆甾醇等。目前，已有大量研究表明，槲皮素能够通过提高奶牛乳腺上皮细胞的SOD、CAT、GSH活性以及NO浓度来提高抗氧化能力，提高细胞活性，促进细胞增殖[28]。此外，本研究发现，青蒿的活性成分山奈酚含有的作用靶点个数位居第二。有研究表明，山奈酚能够激活AMPK/Nrf2/HO-1信号通路降低氧化应激反应、缓解细胞活力损伤、降低细胞凋亡率[29]。山奈酚还可以促进肿瘤细胞凋亡表现出抗肿瘤作用，其机制可能与TLR-4/NF-κB信号通路及下游蛋白VEGF、CAPS3有关[30]。据报道，青蒿中的活性成分木犀草素，可以作为氢供体来还原自由基，增强生物体内抗氧化酶系统的活性，具有良好的抗氧化作用，降低细胞氧化损伤[31]。此外，异鼠李素能通过降低凋亡抑制基因BCL-2的表达，增加促凋亡蛋白BAX的表达来发挥诱导凋亡作用[32]。研究发现，异鼠李素不仅可以抑制表皮生长因子介导的环氧化酶COX2的表达，还能抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶MAPK/ERK途径的MEK1激酶[33]，从而发挥抗肿瘤的作用。
青蒿的抗氧化性能与活性成分豆甾醇密切相关。研究表明，豆甾醇可抑制A7r5细胞中活性氧的增加，提高细胞中SOD和CAT酶的活性，降低磷脂脂质氧化物和丙二醛的含量，表明豆甾醇具有抗氧化活性[34-35]。豆甾醇还可以通过干预雌激素信号通路以及降低结肠组织炎性因子白细胞介素1、白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1和环氧合酶2的mRNA表达发挥抗炎作用[36-38]。由此可见，青蒿中槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素和豆甾醇等的活性成分可提高奶牛抗氧化性能、降低细胞凋亡，为抗氧化应激药物的研发提供物质基础。这与本团队前期研究结果相一致，在奶牛饲粮中添加青蒿提取物可显著提高奶牛的泌乳性能、机体免疫力和抗氧化能力[13-14]。
本研究发现，青蒿发挥抗氧化应激作用的网络中核心靶点是PTGS2、NCOA2、AR、TOP2A、RELA、ESR1、NCOA1、CCNA2、AKT1、CASP3和PPARG。大量研究表明，受外界刺激产生的PTGS2基因突变会导致卵巢发育过程中的黄体缺乏、卵母细胞突变及第一极体无法排出，从而致使多种动物繁殖失败；PTGS2还与炎症和有丝分裂发生相关的前列腺素生物合成有关[39-40]。由此可见，PTGS2在氧化应激损伤调节中发挥了重要作用。ESR1基因与雌激素结合后可通过乳腺细胞分泌生长因子途径来影响乳腺发育情况，具有促进细胞分裂、繁殖和生长能力[41]，在奶牛生产中具有较大的应用潜力。PPARG属于核激素受体超家族，激活PPARG能够促进细胞凋亡，抑制细胞增殖和迁移[42]。核受体共激活因子-2(NCOA2)，参与生殖发育、骨形态发生、癌症等生物学过程，在脂代谢和能量平衡中起重要作用[43]。TOP2A蛋白催化超螺旋结构DNA双链的断裂和再连接反应，不仅影响DNA的结构和拓扑学，还与细胞分裂间期核基质、有丝分裂期染色体配对、染色体分离、基因重组和转录及DNA损伤与修复有密切关系[44]。
此外，本研究还发现，与凋亡调节密切相关的凋亡基因Caspase3也是关键核心基因之一。研究发现，激活的CASP3能使与细胞结构、细胞周期及DNA修复等相关的蛋白或激酶失活，引起细胞凋亡，是细胞凋亡的关键执行者，是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志[45]。AKT1即RAC-阿尔法丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在PI3K/AKT信号转导通路中，激活的AKT1发生磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，进而调节细胞的增殖、凋亡以及迁移等[46]。本团队前期研究青蒿素对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因表达影响中发现，青蒿素可以显著提高与乳脂合成密切相关的基因，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、胆固醇调节元件结合蛋白1-c(SREBP1-c)和脂肪酸合成酶(FASN)等基因的表达；而且，青蒿素可极显著提高丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等相关基因的表达，且对细胞增殖有一定的刺激作用[47]。综上所述，本文通过网络药理学方法得到的核心基因可从调节细胞凋亡、增殖以及乳脂合成相关基因表达等方面在抗氧化应激过程中发挥关键作用。
通过GO和KEGG富集分析发现，青蒿缓解氧化应激损伤的靶基因主要参与细胞迁移的正向调控、MAPK级联的正向调控、细胞内类固醇激素受体信号通路、细胞因子活性、蛋白酶结合等生物功能，而且相关核心靶基因主要富集在PI3K-AKT、IL-17和TNF等信号通路中。与先前的研究结果一致，PI3K-AKT-mTOR-Cyclin D1信号通路的转导主要调节奶牛乳腺上皮细胞增殖与生长[48-49]，从而缓解了氧化应激对奶牛乳腺组织的损伤。研究发现，PI3K(磷脂酰肌醇激酶)与生长因子受体结合后，能修改AKT的蛋白质分子结构并将之活化，从而使磷酸化效应兴奋或阻滞下游一系列底物，进而调节细胞的生长、分化、凋亡以及迁移等表型[50]。特别是PI3K/AKT/mTOR (mTOR) 信号通路作为奶牛免疫细胞激活与细胞炎症因子平衡的重要信号通路，对奶牛机体健康起到决定作用。据报道，TNF信号通路和IL-17信号通路是炎症反应中的重要通路，已有大量研究证实肿瘤坏死因子α以及其他炎性因子在奶牛炎症反应及免疫调节中发挥了关键作用[51]；此外，在MAPK信号通路中，P38 MAPK信号通路与细胞凋亡、炎症反应的调节有着密不可分的联系[52]。然而，青蒿是否通过以上关键通路调节奶牛机体抗氧化应激作用，还有待进一步的验证。这些通路及关键核心靶点为进一步阐明青蒿缓解氧化应激损伤提供了理论依据。
综上所述，本研究通过网络药理学的方法分析青蒿的潜在活性成分、作用靶点以及缓解奶牛氧化应激作用的生物学通路，构建青蒿多组分、多靶点、多途径的抗热应激作用机制，明确了青蒿对氧化应激奶牛具有抑制细胞凋亡、抑制细胞免疫监视和调控炎症应答等作用。
4 结论本研究基于网络药理学构建青蒿缓解氧化应激的复杂网络关系，从网络中可得到，青蒿治疗奶牛氧化应激的潜在活性成分是槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素和豆甾醇等，潜在作用的靶点是PTGS2、NCOA2、AR、TOP2A、RELA、ESR1、NCOA1、CCNA2、AKT1、CASP3、PPARG，缓解氧化应激的靶基因主要参与细胞迁移的正向调控、MAPK级联的正向调控、细胞内类固醇激素受体信号通路、细胞因子活性等生物功能，主要富集在PI3K-AKT、IL-17、TNF等信号通路。
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(编辑 范子娟)