2. 黑龙江省猪种质与生产技术集成创新工程技术研究中心, 哈尔滨 150030;
3. 黑龙江省农业科学院畜牧研究所, 哈尔滨 150086
2. Engineering Research Center of the Heilongjiang Province for the Integration and Innovation of Pig Breeds and Production Technology in Northern China, Harbin 150030, China;
3. Institute of Animal Husbandry, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China
近年来，哺乳动物卵母细胞体外成熟体系的优化取得了显著进展，体外成熟的卵母细胞能够保持较好的发育潜能，但是其质量相对体内成熟的卵母细胞仍存在差距，在一定程度上限制了体外胚胎的生产效率[1-3]。在卵母细胞成熟过程中，通过线粒体氧化磷酸化产生ATP，不可避免的在线粒体电子传递链中形成活性氧(reactive oxygen species, ROS)分子，ROS累积超过生理范围后引起氧化应激，导致细胞周期阻滞，造成卵母细胞质量下降[4]。而在体外成熟培养时，卵母细胞脱离了母体氧化还原系统的精细调控，并由于氧气浓度、可见光、粒子辐射等外界因素的影响，导致ROS水平进一步增加，是造成体外成熟卵母细胞质量低于体内成熟卵母细胞的关键因素[5]。因此，在卵母细胞体外成熟培养体系中常添加抗氧化物质，以缓解ROS的过度累积，维持体外培养微环境中氧化还原平衡，提高卵母细胞的成熟质量[5-7]。
N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一种广泛应用的抗氧化剂，可通过将胱氨酸还原为半胱氨酸促进细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)的合成[8]，缓解氧化应激过程中GSH的消耗[9]，增强细胞抗氧化损伤的能力。此外NAC还可以直接与OH-、二氧化氮(NO2)和巯等自由基发生反应，减少ROS产生[10-12]。目前已有多项将NAC应用于动物卵母细胞体外成熟培养体系的研究报道，但是研究结果并不一致。Sun等[13]的研究表明，在卵母细胞体外成熟培养液中添加NAC可增加GSH的生物合成、降低ROS的产生，促进猪、牛等动物卵母细胞的核成熟，提高成熟质量和后期发育能力。Whitaker等[2, 14]的研究表明，在猪卵母细胞体外成熟培养体系中添加NAC可以减少DNA碎片化，进而提高体外受精后的囊胚发生率。Wang等[15-16]的研究表明，在小鼠卵母细胞体外成熟培养体系中添加NAC可以缓解纺锤体缺陷的发生，同时可通过合成半胱氨酸降低细胞内过氧化氢浓度，减少ROS含量，提高ATP水平，避免线粒体的异常分布，改善卵母细胞的质量，从而提高囊胚发生率。然而，也有研究表明添加NAC对猪卵母细胞的核成熟、受精能力以及卵裂率没有显著影响[17]。推测，这种现象出现的原因可能是由于体外成熟培养时卵母细胞来源于卵巢上不同直径的卵泡，不同大小腔卵泡来源的卵母细胞所处的发育阶段不同，因而对体外培养微环境中氧化还原平衡的敏感程度存在差异，进一步导致这些卵母细胞对NAC处理的反应不一致。
因此，本研究分别以猪卵巢上不同直径卵泡来源的卵母细胞作为试验材料，揭示NAC处理对卵母细胞体外成熟效果的影响，解析其对氧化还原平衡的调控作用，以期为提高卵母细胞体外成熟质量提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器猪卵母细胞培养基(TCM-199)购自Gibico公司；NAC以及其它培养试剂均购自Sigma-Aldrich公司；ROS检测试剂盒(S0033S)和GSH检测试剂盒(S0052)均购自Beyotime公司；反转录试剂盒(ABI kit following the instructions)购自Life Technologies公司；体式显微镜(SZX7)和倒置荧光显微镜(IX71)均购自Olympus公司；二氧化碳培养箱(Heracell I50i)购自Thermo公司。
1.2 猪卵母细胞采集与培养猪的卵巢采集于哈尔滨市香坊区长江路屠宰场，置于含双抗(青霉素、链霉素)的37 ℃无菌生理盐水中，于3 h内送至实验室。用无菌一次性注射器抽取卵巢表面直径为1~2 mm、2~4 mm、4~6 mm卵泡的卵泡液，分别记作小腔卵泡来源组、中腔卵泡来源组、大腔卵泡来源组，置于50 mL离心管中，于37 ℃普通培养箱中静置15 min沉降，弃去上层液体后，使用洗卵液悬浮下层沉淀，并重复以上沉降步骤2~3次。将清洗后的沉淀倒入培养皿中，挑选卵丘包被3层以上、胞质黑色均一的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes, COCs)，将其移入提前平衡3 h以上的体外成熟工作液中，于39 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养42~44 h。猪卵母细胞体外成熟培养基组成为：超纯水、M199粉末(9.5 μg·mL-1)、NaHCO3(0.026 mol·L-1)、PVA(0.1%)、Na-pyruvate(0.91 mmol·L-1)、D-glucose(3.05 mmol·L-1)、Gentamicin(1 μg·mL-1)。向基础培养液中加入L-半胱氨酸(0.57 mmol·L-1)、FSH(0.5 μg·mL-1)、LH(0.5 μg·mL-1)、EGF(10 ng·mL-1)作为猪卵母细胞体外成熟工作液。本研究分别针对以上不同直径卵泡来源的猪卵母细胞，在体外成熟培养体系中添加1、2、4 mmol·L-1浓度的NAC作为处理组，以添加无菌水(NAC的溶剂)作为对照组，用于评价NAC处理对猪卵母细胞体外成熟效果的影响。
1.3 卵丘扩展指数分析在显微镜下观察体外培养24 h的COCs上卵丘细胞的扩散情况。卵丘细胞的扩散情况使用卵丘扩展指数衡量[18]。卵丘细胞扩散分为五个等级：0级是指外层卵丘细胞凋亡；1级是指卵丘细胞无任何扩散；2级是指外层卵丘细胞扩散；3级是指除放射冠外，其余卵丘细胞均扩散；4级是指包括放射冠在内的所有卵丘细胞均实现了最大程度的扩散。
1.4 活性氧检测收集培养44 h的COCs，去掉卵丘细胞后，选择胞质致密状态良好的卵母细胞移入DCFH-DA工作液(PBS稀释为浓度10 μmol·L-1的工作液)中，于37 ℃恒温培养箱中避光孵育30 min，PBS清洗2次，每次5 min。倒置荧光显微镜采集图像(每次试验保证曝光参数一致)，利用Image J软件对图像的荧光值进行分析[19]。
1.5 GSH含量检测收集培养44 h的COCs，去掉卵丘细胞后，每组选择50枚胞质致密状态良好的卵母细胞，PBS清洗3次，放入1.5 mL的离心管中，－80 ℃保存。严格参照总谷胱甘肽检测试剂盒说明书的具体操作步骤，检测不同组卵母细胞的GSH含量。
1.6 RT-qPCR检测收集培养44 h的COCs，去掉卵丘细胞后，每组选择70枚胞质致密状态良好的卵母细胞，PBS清洗3次，移入1.5 mL的离心管中，严格参照RNA提取试剂盒说明书的具体操作步骤，提取细胞总RNA。用反转录试剂盒进行总RNA反转录，得到cDNA并进行下游的Real-time PCR扩增。Real-time PCR扩增严格参照荧光定量试剂盒说明书具体操作步骤进行。采用2-ΔΔCT相对定量法，以YWHAG为内参基因，计算目的基因的相对表达水平[20]。引物序列见表 1。
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表 1 Real-time PCR引物序列 Table 1 Primers sequence for real-time PCR |
试验数据利用SPSS18软件进行统计分析。第一极体排出率利用卡方检验模块进行统计分析；卵丘扩展指数和ROS水平利用单因素方差分析模块进行统计分析；GSH水平和抗氧化基因表达量利用独立样本t检验模块进行统计分析。*和**分别表示当P < 0.05或P < 0.01时，存在统计学差异，数据采用“平均值±标准误(SEM)”表示。
2 结果 2.1 NAC处理对不同直径卵泡来源猪卵母细胞卵丘扩展的影响本研究从猪卵巢表面分别抽取大、中、小腔卵泡中的COCs，并在体外成熟培养液中分别添加不同浓度NAC(1、2、4 mmol·L-1)处理，于培养24 h时观察卵丘扩展情况。结果如图 1所示，随着卵母细胞来源卵泡直径的缩小，卵丘扩展指数逐渐降低(P < 0.05)；对于大腔卵泡来源的卵母细胞，添加不同浓度NAC(1、2、4 mmol·L-1)处理对卵丘扩展均无明显作用，卵丘扩展指数(3.22±0.08；3.23±0.18；3.04±0.11)与对照组(3.38±0.14)间无显著差异(P>0.05)；对于中、小腔卵泡来源卵母细胞，与对照组相比(2.63±0.10；2.31±0.14)，添加1 mmol·L-1 NAC处理对卵丘细胞扩展(2.69±0.13；2.50±0.15)无显著作用(P>0.05)，而添加2 mmol·L-1 NAC处理可以促进卵丘细胞扩展，卵丘扩展指数(2.98±0.07；2.83±0.10)显著高于对照组(P < 0.05)，但是添加4 mmol·L-1 NAC处理对卵丘细胞扩展(2.36±0.18；1.92±0.12)存在负向作用。
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A.体外成熟培养24 h的COCs代表图; B.NAC处理24 h时卵丘扩展指数统计。大、中、小腔卵泡来源组分别使用1 091、1 104、1 083枚卵母细胞用于统计。*表示在P < 0.05水平差异显著，**表示在P < 0.01水平差异极显著，下同 A.COCs representative diagram for 24 h in vitro maturation culture; B.Cumulus expansion index after 24 h NAC treatment. The1 091, 1 104 and 1 083 oocytes were used in the large, middle and small follicle-derived groups, respectively. * indicates significant difference at P < 0.05 level, ** indicates significant difference at P < 0.01 level, the same as below 图 1 NAC处理对不同直径卵泡来源卵母细胞卵丘扩展的影响 Fig. 1 Effect of NAC on oocytes cumulus expansion from follicles with different diameters |
为进一步探究NAC处理对不同直径卵泡来源猪卵母细胞体外成熟的影响，本研究在体外成熟培养44 h后检查各组卵母细胞第一极体排出情况。结果如图 2所示，随着卵母细胞来源卵泡直径的缩小，第一极体排出率也随之下降(P < 0.01)；与对照组相比，不同浓度NAC(1、2、4 mmol·L-1)处理对大、中腔卵泡来源卵母细胞的第一极体排出率无显著影响(P>0.05)；但2 mmol·L-1 NAC处理后可以将小腔卵泡来源卵母细胞的第一极体排出率由(42.22±1.04)%提高到(53.70±4.23)%(P < 0.05)。这一研究结果表明，适当浓度的NAC(2 mmol·L-1) 能够提高小腔卵泡来源猪卵母细胞的体外成熟效果。
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A.体外成熟培养44 h后去卵丘的卵母细胞代表图; B.NAC处理44 h后卵母细胞第一极体排出率。大、中、小腔卵泡来源组分别使用1 080、1 106、1 358枚卵母细胞用于统计 A.Representative images of denuded oocytes after 44 h in vitro maturation culture; B.The first polar body excretion rate of oocyte after NAC treatment for 44 h. The 1 080, 1 106 and 1 358 oocytes were used in the large, middle and small follicle-derived groups, respectively 图 2 NAC处理对不同直径卵泡来源卵母细胞第一极体排出率的影响 Fig. 2 Effects of NAC treatment on the first polar body excretion rate of oocytes from follicles with different diameters |
为研究NAC处理对不同直径卵泡来源卵母细胞中ROS水平的影响，本研究使用荧光探针DCFH-DA对卵母细胞进行染色，结果如图 3所示。与对照组相比，不同浓度NAC(1、2、4 mmol·L-1)处理对大腔卵泡来源卵母细胞的相对荧光强度无显著影响(P>0.05)；但2和4 mmol·L-1的NAC处理与对照组相比可以降低中腔卵泡来源卵母细胞的相对荧光强度(P < 0.05)；与对照组相比，2 mmol·L-1 NAC处理可以降低小腔卵泡来源卵母细胞的相对荧光强度(P < 0.05)。这一研究结果表明，添加适当浓度NAC(2 mmol·L-1)处理可以降低中、小腔卵泡来源卵母细胞中的ROS水平，但对大腔卵泡来源卵母细胞中的ROS水平无显著影响(P>0.05)。
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A.大腔卵泡来源组卵母细胞ROS水平; B.中腔卵泡来源组卵母细胞ROS水平; C.小腔卵泡来源组卵母细胞ROS水平 A. ROS levels of porcine oocytes from large follicle group; B.ROS levels of porcine oocytes from middle follicle group; C.ROS levels of porcine oocytes from small follicle group 图 3 NAC处理对不同直径卵泡来源卵母细胞中ROS水平的影响 Fig. 3 Effects of NAC on ROS levels in oocytes from follicles with different diameters |
为了探究NAC处理对猪卵母细胞内谷胱甘肽水平的影响，本研究利用总谷胱甘肽检测试剂盒分析不同直径卵泡来源卵母细胞中的总谷胱甘肽水平。首先测得标准曲线为：Y=0.031 9x+0.042 3，R2=0.996 6，如图 4所示，将412 nm波长处吸光值带入上述标准曲线方程中计算总谷胱甘肽含量。结果如图 5所示，随着卵母细胞来源卵泡直径的缩小，总谷胱甘肽含量逐渐降低(P < 0.05)；与对照组(0.51±0.03；0.44±0.01；0.34±0.01)相比，NAC(2 mmol·L-1)处理对大、中腔卵泡来源卵母细胞中的总谷胱甘肽含量(0.55±0.05；0.49±0.02)无显著影响(P>0.05)；但是NAC(2 mmol·L-1)处理可以显著提高小腔卵泡来源卵母细胞中的总谷胱甘肽含量(0.46±0.04，P < 0.05)。
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图 4 谷胱甘肽标准曲线 Fig. 4 The standard curve of GSH |
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图 5 不同直径卵泡来源卵母细胞中的平均GSH含量 Fig. 5 Average GSH content per oocyte from follicles with different diameters |
为了进一步探讨NAC处理对不同直径卵泡来源卵母细胞中抗氧化因子表达的影响，本研究利用Real-time PCR技术检测了抗氧化基因SOD、CAT、Prdx2、Prdx6的表达水平。结果如图 6所示，与对照组相比，NAC(2 mmol·L-1)处理对大、中腔卵泡来源卵母细胞中SOD、CAT、Prdx2、Prdx6等基因的表达水平无显著影响(P>0.05)；NAC(2 mmol·L-1) 处理对小腔卵泡来源组卵母细胞中Prdx2和Prdx6基因的表达水平无显著影响(P > 0.05)，但是可以显著提高SOD和CAT基因的表达水平(P < 0.05)。
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A.大腔卵泡来源组卵母细胞抗氧化相关基因的表达水平; B.中腔卵泡来源组卵母细胞抗氧化相关基因的表达水平; C.小腔卵泡来源组卵母细胞抗氧化相关基因的表达水平 A. Expression levels of antioxidant related genes in porcine oocytes from large follicle group; B. Expression levels of antioxidant related genes in porcine oocytes from middle follicle group; C. Expression levels of antioxidant related genes in porcine oocytes from small follicle group 图 6 NAC处理对不同直径卵泡来源卵母细胞抗氧化相关基因表达的影响 Fig. 6 Effect of NAC on the expression of antioxidant related genes in oocytes from follicles with different diameters |
卵母细胞体外成熟是体外胚胎生产的重要组成部分，为体细胞克隆、转基因等生物技术的研究和应用提供支撑，卵母细胞成熟质量对后期胚胎发育至关重要。卵母细胞成熟培养时由线粒体电子传递链形成ROS，其过度累积引起氧化应激，导致线粒体功能障碍、纺锤体异常、细胞凋亡、第一极体排出率降低[5, 21]，是造成卵母细胞体外成熟质量偏低的重要因素。因此，为了减少卵母细胞体外成熟培养时ROS的过度累积，常在培养体系中添加NAC等抗氧化物质，以缓解氧化应激过程中GSH的消耗，增强细胞抗氧化损伤的能力，进而提高卵母细胞的体外成熟质量。但是，本研究结果表明不同直径卵泡来源的卵母细胞对NAC处理的反应存在显著差异(P < 0.05)，整体上NAC仅对小腔卵泡来源卵母细胞的体外成熟效果起到促进作用，并且存在明显的剂量依赖性，具体表现在卵丘扩展指数、第一极体排出率、GSH水平和抗氧化基因表达量等相关指标上。
卵丘细胞紧密包裹在卵母细胞周围，可以通过间隙连接提供卵母细胞生长发育所需的营养物质，卵丘扩展程度越高越有利于物质和能量交换，因此卵丘扩展指数常被用作评价卵母细胞体外成熟效果的重要指标。有研究表明，体外成熟培养时卵母细胞的卵丘扩展程度与其来源卵泡的直径呈正相关[22]，小腔卵泡来源的卵母细胞卵丘扩展程度显著低于大腔卵泡来源的卵母细胞[23]，本研究结果也进一步证实了卵母细胞的卵丘扩展指数与其来源卵泡的直径之间存在密切联系。Zhang等[24]研究发现，氧化应激是抑制猪卵母细胞卵丘扩展的关键因素，在体外成熟培养基中添加NAC可通过减少ROS的产生降低氧化应激水平，进而提高卵丘细胞扩展程度[25]。本研究结果表明，适当浓度NAC(2 mmol·L-1) 处理降低了中、小腔卵泡来源卵母细胞中的ROS水平，进一步提高了卵丘扩展指数，但是对大腔卵泡来源卵母细胞的ROS水平和卵丘扩展指数均无显著影响(P>0.05)。
在卵母细胞完成第一次减数分裂后会排出第一极体，随后进入第二次减数分裂并阻滞在第二次减数分裂中期，因此，第一极体的排出率是评价卵母细胞体外成熟效果的核心指标。Marchal等[26]研究发现，大、中腔卵泡来源的猪卵母细胞体外成熟培养后，第一极体排出率比小腔卵泡来源的卵母细胞高约30%~40%，本研究结果也证实，随着卵母细胞来源卵泡直径的缩小，第一极体排出率也随之降低。有研究表明，氧化应激是降低猪卵母细胞第一极体排出率的重要因素[24]，在体外成熟培养基中添加NAC可通过降低氧化应激水平提高第一极体排出率[6, 13]，促进猪、牛等动物卵母细胞的核成熟。本研究结果表明，适当浓度NAC(2 mmol·L-1)处理在降低卵母细胞中的ROS水平的同时，显著提高了小腔卵泡来源卵母细胞的第一极体排出率(P < 0.05)，而对大、中腔卵泡来源卵母细胞无显著影响(P>0.05)。与本研究结果相类似，Whitaker和Knight[17]对直径3~6 mm卵泡来源的猪卵母细胞进行体外成熟培养时发现，添加NAC对第一极体排出率也无显著影响，由此可见NAC处理对大、中腔卵泡来源卵母细胞的核成熟无显著促进作用。推测大、中腔卵泡来源卵母细胞中氧化/抗氧化体系比较完善[27]，可以较好的保持氧化还原动态平衡，因此外源性添加NAC对其核成熟效果无明显的促进作用；而小腔卵泡来源卵母细胞中氧化/抗氧化体系不够完善[28]，对体外培养微环境中氧化应激更加敏感，外源性添加NAC有利于ROS的清除，降低氧化应激水平，有助于提升其核成熟效果。
氧化应激是阻碍卵母细胞体外成熟的关键因素，ROS是导致卵母细胞氧化损伤的重要介质[3, 29]。已有多项研究表明，过量ROS诱导的氧化应激能够引起许多分子损伤，造成猪卵母细胞体外成熟能力下降[2, 30]。GSH作为一种小分子肽，在体内可以通过降低ROS水平保护卵母细胞和胚胎免受氧化损伤[6, 12, 31]。在卵母细胞体外培养过程中，GSH水平偏低会造成卵母细胞成熟质量变差，导致胚胎后续的发育能力下降[17, 32]。De Almeida Barros等[28]研究发现，虽然不同直径卵泡来源卵母细胞中ROS与GSH的比例相近，但是大腔卵泡来源卵母细胞中ROS与GSH的水平更高，更有利于维持氧化还原平衡，因此其后续发育能力也更强。本研究结果表明，适当浓度NAC(2 mmol·L-1)处理后，小腔卵泡来源卵母细胞中GSH含量升高的同时伴随着ROS水平降低，而大腔卵泡来源卵母细胞中的GSH含量和ROS水平均无显著变化(P>0.05)。与本研究结果相类似，Whitaker等[2]对直径3~6 mm卵泡来源的猪卵母细胞进行体外成熟培养时也发现，添加NAC对细胞内GSH含量无显著影响。因此，小腔卵泡来源卵母细胞体外成熟培养时添加NAC，可以促进GSH的合成，更好的维持氧化还原平衡。
在减数分裂期，ROS与酶抗氧化系统间的动态平衡对保证卵母细胞正常发育具有重要作用，其中SOD和CAT作为酶抗氧化系统的关键酶[16, 32]，可以通过缓解卵母细胞氧化损伤提高后续发育能力[33]，常被看作重要的抗氧化评价指标。有研究表明，氧化应激的发生与SOD和CAT基因表达水平的降低伴随出现[34]，而外源性添加NAC可上调SOD、CAT基因的表达水平[13]。本研究结果表明，NAC(2 mmol·L-1)处理后，大、中腔卵泡来源卵母细胞中SOD、CAT基因的表达水平无显著变化(P>0.05)，而小腔卵泡来源卵母细胞中SOD、CAT基因的表达水平则显著上调(P < 0.05)。结合El-Shahat和Kandil[35]的报道，小腔卵泡来源卵母细胞的SOD表达水平低于大腔卵泡来源卵母细胞，表明其酶抗氧化系统发育仍不够完善，可以通过外源性添加NAC等抗氧化物质增强抗氧化能力，提高体外成熟效果。
4 结论NAC处理对大、中腔卵泡来源卵母细胞的成熟效果无显著影响(P>0.05)，但可以显著提高小腔卵泡来源卵母细胞成熟效果(P < 0.05)。NAC处理对大腔卵泡来源卵母细胞中ROS水平无显著影响(P>0.05)，但可以显著降低中、小腔卵泡来源卵母细胞中的ROS水平(P < 0.05)。NAC处理对大、中腔卵泡来源卵母细胞内的总GSH含量和抗氧化相关基因的表达无显著作用(P>0.05)，但可以显著提高小腔卵泡来源卵母细胞内的总GSH含量和抗氧化基因SOD和CAT基因的表达水平(P < 0.05)。综上所述，适当浓度的NAC(2 mmol·L-1) 处理可以通过缓解氧化应激提高小腔卵泡来源卵母细胞的体外成熟效果。
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(编辑 孟培)