畜牧兽医学报  2023, Vol. 54 Issue (3): 966-975. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2023.03.011    PDF    
北京黑猪FABP3和SCD基因多态性与肉品质性状关联分析
苏艳芳, 杨曼, 牛乃琪, 侯欣华, 张龙超     
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
摘要:旨在研究脂肪酸结合蛋白-3(fatty acid binding protein 3,FABP3)和硬脂酰基辅酶A脱氢酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)基因的多态性及其与肉品质性状的关联,从而能够在分子水平上指导北京黑猪的育种工作。本研究以413头北京黑猪为材料,收集肉品质性状数据并提取DNA和RNA,根据FABP3和SCD基因序列设计20对引物进行PCR扩增及测序,运用DNAStar软件分析测序结果,对FABP3和SCD基因进行不同基因型与北京黑猪肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量的关联分析并运用荧光定量PCR对其进行基因表达差异分析。结果发现,FABP3基因存在1个错义突变(c.681A>G),SCD基因存在1个错义突变、2个同义突变以及2个3'UTR区突变。使用Duncan’s多重检验统计分析发现,SCD基因内的SNPs与肉品质性状关联均不显著;FABP3基因错义突变位点c.681A>G与肉色L*和IMF含量显著关联(P < 0.05)。该错义突变导致FABP3蛋白第51位氨基酸残基由异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T)。利用qPCR开展FABP3 c.681A>G两种纯合基因型(AA和GG)个体表达量差异分析,发现该突变位点两种纯合基因型个体间基因表达量差异不显著,说明FABP3 c.681A>G错义突变位点可能通过影响蛋白功能来调控肌内脂肪含量和肉色L*性状。上述两个基因中只有1个位点与肉色L*和IMF含量关联显著,可以作为北京黑猪肉品质性状的候选基因功能位点,也能为北京黑猪肉品质育种提供了新的分子标记。
关键词北京黑猪    FABP3    SCD    肉品质    关联分析    
Association Analysis of FABP3 and SCD Gene Polymorphisms with Meat Quality Traits in Beijing Black Pigs
SU Yanfang, YANG Man, NIU Naiqi, HOU Xinhua, ZHANG Longchao     
Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
Abstract: The study aimed to investigate the polymorphism of fatty acid binding protein 3 (FABP3) and stearoyl-CoA desaturase (SCD) genes and their association with meat quality traits. It can guide the breeding of Beijing black pigs at molecular level. In this study, meat quality and trait data of 413 Beijing black pigs were collected, DNA and RNA was extracted. According to FABP3 and SCD gene sequences, 20 pairs of primers were designed for PCR amplification and sequencing. DNAStar software was used to analyze the sequencing results. The correlation between FABP3 and SCD genotypes and intramuscular fat content of Beijing black pigs was analyzed and the gene expression difference was analyzed by fluorescence quantitative PCR. FABP3 gene was identified a missense mutation (c. 681 A>G), SCD gene was identified a missense mutation, two synonymous mutations and two 3'UTR region mutations. Duncan's multiple test statistical analysis showed that all SNPs in SCD gene were not significantly associated with meat quality traits. FABP3 missense mutant c.681A>G was significantly associated with carnation L* and intramuscular fat (IMF) content (P < 0.05). The missense mutation resulted in the mutation of amino acid residue 51 of FABP3 from isoleucine (I) to threonine (T). qPCR was used to analyze the differences in individual expression levels of two homozygous genotypes of c.681A>G (AA and GG) of FABP3, and it was found that there was no significant difference in gene expression levels between the individuals with two homozygous genotypes at the mutation site. These results suggested that the missense mutation site of FABP3 c.681A>G may regulate the intramuscular fat content and carnation L* traits by affecting the protein function. Only one locus of the FABP3 and SCD genes was significantly associated with carnation L* and intramuscular fat content, which could be used as a candidate gene functional locus for meat quality traits of Beijing black pigs and also provide a new molecular marker for meat quality breeding of Beijing black pigs.
Key words: Beijing black pigs    FABP3    SCD    meat quality    association analysis    

肌内脂肪含量(intramuscular fat,IMF)是影响肉类口感和质地等感官属性的主要品质特征之一[1-2]。肌内脂肪含量是猪脂质沉积特征的主要成分[3],由肌内脂肪细胞的数量和大小决定[4],并与肉的多汁性、嫩度、系水力及大理石纹评分直接相关[5-7]。脂肪酸是构成肌内脂肪的重要化学物质[8],因此许多调控脂肪酸的基因成为了肌内脂肪含量重要候选基因。

FABPs是脂质结合蛋白超家族成员,在猪中该基因被认为是脂肪沉积性状的候选基因[9],广泛存在于动物的脂质中[10-11],负责通过不同组织的细胞膜摄取脂肪酸[12]。脂肪酸结合蛋白-3(fatty acid binding protein 3,FABP3)位于6号染色体的一个区域[13],是脂肪酸结合家族成员之一,其主要在心肌和骨骼肌中表达[14-15],在棕色脂肪组织、神经系统和胎盘中表达较少[13]。主要负责运载脂肪酸的酯化和氧化,促进其快速进入能量代谢体系,最终使脂肪酸氧化分解生成ATP,为生命活动提供大量能量,并参与维持机体的能量平衡,调节肌肉脂肪含量和脂肪组织发育[16]。相关研究证明,FABP3基因多态性与水份、嫩度、肌肉评分[5]及肌内脂肪含量存在显著相关[17-19]。因此,FABP3基因的多态性近年来已成为研究动物肌内脂肪含量的热点。另外,有研究进行了位置候选基因分析,结果表明硬脂酰基辅酶A脱氢酶(stearoyl-CoA desaturase,SCD)基因的单倍型对脂肪的脂肪酸组成有很大的影响,SCD是脂肪酸组成的候选基因之一[20-21],位于猪的SSC14位点上,SCD基因由于其位置和生理功能,被认为是该QTL位置的候选基因[16-17],该基因主要存在于动物的乳腺和脂肪组织中,位于内质网和膜细胞中[17],在催化饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸中发挥重要作用[22],与猪脂肪酸的形成密切相关[17-18]。因此,SCD是脂肪组成相关的主要候选基因之一[19],在调节脂肪沉积和脂质代谢中起到了关键作用。受广泛报道的基因主要是FABP3和SCD基因,因此本研究就FABP3和SCD两个基因多态性进行讨论。

北京黑猪起源于20世纪60年代,是由中国自主培育的猪种,发源于京郊各国营猪场,是由巴克夏、大白猪和地方优良猪种杂交形成的[23]肌内脂肪高及肉味浓郁[24],有着丰富遗传背景的猪种[25],在很大程度上综合了国内外猪种的优良特性,尤其是肌内脂肪含量可达3%以上,这正是北京黑猪肉质口感鲜美的主要因素之一,因而在北方市场上广受人们的喜爱。虽然上述2个基因已经被认为是影响肌内脂肪含量等肉质性状的候选基因,但是与北京黑猪的多态性及性状的关联分析尚未见报道。本研究旨在通过对FABP3和SCD这2个基因的外显子和UTR区域进行PCR突变位点检测及开展基因型与肉质性状的关联分析,探索调控性状变异的候选基因功能位点,为下一步阐释性状变异的遗传机理奠定基础。

1 材料与方法 1.1 组织样品的采集及表型数据

收集(210±7)日龄的413头北京黑猪组织样并记录肉品质性状,动物均饲养于北京黑六牧业科技有限公司。

1.2 DNA提取

采用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)在组织样品中进行DNA的提取,并使用超微量分光光度计(IMPLEN)进行DNA浓度、OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm的测定,并用2%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA的质量评估,并在-20 ℃冰箱中存放符合质量要求的DNA样品。

1.3 引物设计及合成

利用Primer Premier 5.0对FABP3(NM-001099931.1)和SCD(NM-213781.1)基因共设计20对引物,部分引物见表 1,设计好的引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成。

表 1 引物信息 Table 1 Information of primers
1.4 聚合酶链式反应(PCR)及基因分型

使用96孔板对413头北京黑猪采用以下程序进行PCR扩增,25 μL的反应体系(Code:P505-d1,Vazyme)如下:2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,0.5 μL聚合酶,0.5 μL dNTP,1 μL上游引物,1 μL下游引物,8.5 μL无菌水,1 μL模板。PCR程序如下(ABI, Singapore):95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,57~62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30~90 s,35个循环;72 ℃延伸2 min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳反应后,在北京六合华大基因科技有限公司平台进行双向Sanger测序。对PCR扩增得到的产物测序后使用DNAStar中的SeqMan进行基因分型。随后利用Microsoft Excel 2016软件进行各位点的等位基因频率和基因型频率的统计。

1.5 RNA的提取

进行FABP3基因定量分析的个体是按照基因型和肌内脂肪含量高、低各挑选5头猪:即先将肌内脂肪含量按照AA、GG、AG基因型分开,再将GG基因型按照肌内脂肪含量的高、低排序后挑选出5头肌内脂肪含量低的个体;AA基因型按照肌内脂肪含量的高、低排序后挑选出5头肌内脂肪含量高的个体。进行SCD基因定量分析的个体是按照肌内脂肪含量的高、低排序后,挑选出肌内脂肪含量高的5头个体和肌内脂肪含量低的5头个体。

取黄豆粒大小的组织样品于离心管中,并在研磨仪中对组织样品进行研磨,参照说明书的步骤,使用RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)进行RNA的提取,并通过超微量分光光度计(IMPLEN)对RNA浓度、OD260 nm/OD230 nm及OD260 nm/OD280 nm进行测定。将合格的RNA用反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit)进行反转录,并将符合质量要求的样品置于-20 ℃冰箱中保存备用。

随后在冰上配制反应液Master Mix:5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL, 1.0 μL g DNA Eraser,1 μL RNA,6 μL RNase Free dH2O,共计10 μL。

1.6 反转录反应

采用20 μL的反应体系:10 μL上述“1.5”的反应液,1 μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ, 1 μL RT Primer Mix, 4 μL 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time), 4 μL RNase Free dH2O。

1.7 荧光定量PCR(RT-qPCR)检测FABP3、SCD基因mRNA相对表达量

取反转录后的cDNA,以GAPDH基因为内参,通过实时荧光定量PCR检测FABP3基因的表达。采用20 μL反应体系:10 μL TB Green,0.4 μL PCR Forward Primer,0.4 μL PCR Reverse Primer,0.4 μL ROX Reference DyeⅡ,2 μL模板,6.8 μL无菌水。使用96孔板进行qPCR分析,PCR反应条件为:95 ℃,30 s为模板的预变性阶段;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40个循环为模板的扩增阶段;60 ℃~95 ℃,以每10 s缓慢升温0.5 ℃建立熔解曲线阶段。

1.8 数据统计分析

使用SAS 9.4软件进行表型与基因型的关联分析,采用Duncan’s多重检验评估不同基因型之间差异的显著性(P < 0.05),数据采用“平均值±标准差”表示,采用T检验评估不同基因型间实时荧光定量表达结果差异的显著性(P < 0.05)。

1.9 蛋白序列同源性比对

在NCBI数据库里选用不同物种FABP3基因的蛋白序列如下,随后用DNAMAN软件进行蛋白序列同源性比对。FABP3基因比对的序列取自以下品种:猪: >NP_001093401.1;马: >XP_023481921.1; 人: >NP_001307925.1;黑猩猩>XP_ 016813406.1;猕猴: >XP_014989199.1;褐家鼠: >XP_038966758.1。

2 结果 2.1 表型数据的描述

北京黑猪肉质性状统计见表 2。由测定结果可知,24 h的pH、24 h肉色L*、24 h肉色a*、24 h肉色b*、水份、24 h失水率、肌内脂肪、背膘厚1(肩部最厚)、背膘厚2(6~7肋)、背膘厚3(胸腰结合处)、背膘厚4(腰荐结合处)的均值分别为5.81、54.90、14.05、3.72、73.49%、0.45%、1.96%、3.81 cm、3.07 cm、2.59 cm、2.74 cm。性状的变异系数范围为1.82%~147.98%。

表 2 肉质的表型值统计 Table 2 Statistics of phenotypic values of meat quality
2.2 FABP3和SCD基因SNP位点基因型频率及等位基因频率

通过对FABP3和SCD基因进行PCR扩增后发现共6个突变(表 3),其中FABP3基因的错义突变位置为CDS区(c.681A>G),3个SCD基因的突变位置为CDS区(错义突变位点为c.923 G>C,同义突变位点为c.1000 C>T和c.1045 C>T),2个SCD基因的突变位置为3′UTR区(c.1847 G>A,c.3727 C>T)。这6个SNPs的基因型频率变化范围为0~91%,等位基因频率变化范围为5%~95%。

表 3 北京黑猪FABP3和SCD突变位点的基因型频率及等位基因频率统计 Table 3 Statistics of genotype and allele frequencies of SNPs in FABP3 and SCD in Beijing Black pigs
2.3 FABP3和SCD共4个SNPs的数据统计分析

FABP3和SCD基因通过PCR扩增筛选出来的4个SNPs位点与北京黑猪的pH、肉色L*、肉色a*、肉色b*、水份、失水率、肌内脂肪含量、背膘厚1(肩部最厚)、背膘厚2(6~7肋)、背膘厚3(胸腰结合处)、背膘厚4(腰荐结合处)进行关联分析,结果见表 4

表 4 FABP3和SCD基因共4个SNPs与肉质性状的关联分析 Table 4 The association analysis of 4 SNPs of FABP3 and SCD genes with meat quality traits

FABP3上1个错义突变c.681 A>G与肉色L*和IMF显著相关,与其它性状均不显著相关,且肉色L*的值中AG基因型个体的表型值最高、其次是AA基因型、GG基因型的值最低,IMF含量AA基因型个体的值最高、AG基因型次之、GG基因型的值最低。SCD基因各位点与性状均不存在显著相关。

2.4 FABP3 c.681A>G突变两种纯合基因型个体间基因表达差异分析

利用RT-qPCR技术检测了FABP3基因在北京黑猪肌内脂肪含量中的表达情况。定量结果显示,FABP3(c.681A>G)基因的AA基因型和GG基因型在北京黑猪中的表达无显著差异,见图 1

图 1 FABP3基因相对表达量 Fig. 1 Relative expression of FABP3 gene
2.5 蛋白序列同源性比对结果

在ensembl中查找未找到FABP3基因错义突变的位点,通过蛋白序列比对发现FABP3基因的错义突变位点在图 2星号处。后续通过DNAMAN软件比对猪>NP_001093401.1, 马>XP_023481921.1, 人>NP_001307925.1, 黑猩猩>XP_016813406.1, 猕猴>XP_014989199.1,褐家鼠>XP_038966758.1六个物种的蛋白序列,发现比对的一致性为64.36%。且对这6个物种该蛋白结构域氨基酸进行比较,发现A到G的突变使得猪的第51位氨基酸由异亮氨酸(I)突变成了苏氨酸(T),因此被命名为FABP3-I51T,其它物种第51位氨基酸也均为苏氨酸(T),说明该位点的蛋白具有保守性,非保守性替换可能会改变FABP3基因的功能。

图 2 DNAMAN不同物种FABP3蛋白序列同源性比对 Fig. 2 Homology comparison of FABP3 protein sequences from different DNAMAN species
3 讨论

硬脂酰基辅酶A脱氢酶基因位于SSC14[17],是一种内质网结合酶,主要在脂肪和肝组织中表达,在骨骼及其他组织中也广泛表达[26]。SCD作为合成单不饱和脂肪酸的限速酶,不仅能够影响细胞分化和癌症发生等生理过程,在调节脂肪沉积和脂质代谢中也起到了关键作用,被认为是影响脂肪酸组成位置的候选基因[17]。研究SCD基因多态性以及与肉质的关联分析对家畜脂肪酸的组成以及人类能量代谢和肥胖具有重要意义。然而Wang等[19]在苏淮猪的研究中未见SCD(rs80912566)与肌内脂肪含量存在相关,Maharani等[17]在纯种杜洛克猪上的研究未见SCD(g.-353T>C)与背膘厚存在相互关联,这可能是因为SCD基因与脂肪组成有关,而与脂肪含量无关[19]。本研究使用413头北京黑猪对SCD基因进行多态性探索并对其与肉质的关联性进行分析,发现SCD上的SNPs位点与肉质性状均不存在显著相关。然而,本研究虽有UTR区突变及错义突变,但都未发现与肉质性状关联,因此该基因在北京黑猪群体中对肉质性状的影响应进行更进一步研究。

FABP是一种胞内蛋白,它能够将脂肪酸从细胞膜运输到脂肪酸氧化或磷脂或三酰甘油合成的位点[27]。脂肪酸结合蛋白-3(fatty acid binding protein 3,FABP3)(又称H-FABP)是脂质结合蛋白超家族成员之一,广泛存在于动物的脂质中[9, 11],主要在心肌和骨骼肌中表达[15, 26],在棕色脂肪组织、神经系统和胎盘中表达较少[13]FABP3负责通过不同组织的细胞膜摄取脂肪酸[12]、运载脂肪酸的酯化和氧化,防止细胞堆积游离脂肪酸[28],在细胞内的脂肪酸运输中发挥着核心作用[29],并参与维持机体的能量平衡,在调节肌肉脂肪含量和脂肪组织发育中起到重要作用。

Gerbens等[30]通过猪/啮齿动物细胞杂交面板的方法将H-FABP基因定位于第6号染色体上,并对猪的H-FABP基因编码区和内含子区进行了测序,共检测到3个位点,一个在基因上游区域(Hinf I),两个在第二个内含子区域(Hae III和Msp I)。随后Chen等[15]在延安、金华、杜洛克、地方品种和约克郡×杜洛克(DLY)等不同品种猪的研究中发现,DLY猪和延安猪的H-FABP/HinfⅠ位点对IMF有显著影响,且DLY猪的3个H-FABP位点(Hinf I、Msp I和Hae III)的adH单倍型具有最高的肌内脂肪含量,这一研究验证了Gerbens等[30]发现的3个位点。Shang等[13]比较了高IMF的藏猪(TP)和低IMF的大白猪(LW)H-FABP的mRNA和蛋白表达,发现H-FABP在背部脂肪、背最长肌和肝组织中的mRNA和蛋白表达均显著高于LW,且起始密码子上游区域的C-1375G位点可能是H-FABP表达的调节因子,C-1375G位点的G等位基因可能促进H-FABP基因表达的增加,从而提高猪体内脂肪沉积和肌内脂肪含量。Sweeney等[31]研究表明,FABP3基因的SNP位点仅与大白猪的肉质性状有显著相关,且g.-634C>A位点的肌内脂肪含量从AA基因型的1.34%下降到CC基因型的0.97%,g.-332G>A位点的肌内脂肪含量从GG基因型的1.14%增加到GA基因型的1.39%。对FABP3基因与肉品质关系的研究不仅局限于基因上游区域,还有研究在内含子区域发现了FABP3与肉品质的关系。例如,另一项Gerbens等[32]的研究表明,H-FABP基因位于内含子的Hae III位点在不同基因型的阉猪肌内脂肪含量之间存在显著差异,但是在母猪上并没有此现象;RFLP多态性与肌内脂肪含量和背膘厚也存在显著相关,且aaddHH基因型个体的肌内脂肪含量最高[29];在对梅山猪的研究中发现等位基因纯合个体的肌内脂肪含量比西方品种等位基因纯合个体平均高0.44%[27]。此外,Wang等[19]在对苏淮猪的研究中发现,FABP3基因(rs1110770079)与肌内脂肪含量有关,与背膘厚无关,且GG基因型个体的肌内脂肪含量显著高于TT基因型个体。然而,本研究在外显子区发现FABP3基因存在错义突变,c.681A>G导致第51位氨基酸残基发生了异亮氨酸到苏氨酸的改变,且该位点与肉色L*和IMF存在显著关联。进一步检测此位点纯合基因型个体间的基因表达差异发现,不同纯合子的基因表达差异不显著。因此,可以推测FABP3基因的错义突变可能通过影响脂肪酸的转运而调控IMF。

4 结论

利用413头北京黑猪开展FABP3和SCD基因多态性与肉品质性状的关联分析,共发现6个SNPs位点,其中SCD基因内发现5个SNPs,而FABP3基因内只发现1个SNP(c.681A> G)。关联分析结果表明,SCD基因内所有SNPs与肉品质性状均未发现显著关联。本研究发现,FABP3基因存在错义突变c.681A>G,其不同基因型与肉色L*和IMF显著关联。实时荧光定量PCR分析发现,FABP3 c.681A>G不同纯合基因型个体间基因表达差异不显著。本研究结果为猪FABP3基因调控肌内脂肪含量的分子机理提出了新见解,同时为北京黑猪肉品质性状育种提供了新的分子标记。

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(编辑   郭云雁)