畜牧兽医学报  2022, Vol. 53 Issue (9): 3107-3120.
DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2022.09.025 |
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, ZHANG Senhao1, ZHANG Liu1, LI Jiaxuan1,2, WANG Xiaona1,2, CUI Wen1,2, JIANG Yanping1,2, ZHOU Han1,2, WANG Li1,2, QIAO Xinyuan1,2, LI Yijing1,2, TANG Lijie1,2
禽白血病病毒[avian leukemia (leukosis) virus，ALV]隶属反转录病毒科、α反转录病毒属成员，其基因组为单股、正链、线性RNA的二聚体，具有经典的C型反转录病毒基因组结构(5′LTR-5′UTR-gag-pol-env-3′UTR-3′LTR)，可引起禽类的多种肿瘤性疾病[1]。目前，根据宿主感染范围、中和抗体交叉反应和gp85基因同源性比对等方法[2]，可将ALV分为11个亚群(A-K)。其中，外源性病毒包含A、B、C、D、J和K亚群，均可自然感染鸡群；而内源性病毒主要有E、F、G、H和I亚群，除E亚群分离于鸡外，其余亚群多见于野生鸟类[3]。感染ALV后的鸡，一方面表现为直接发病，病鸡体表或内脏出现肿瘤，最终导致死亡；另一方面还会出现发育迟缓，免疫力低下，产蛋率降低等亚临床症状，并易受到外界各种病原体的侵害，增加混合感染的概率[4]，给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。
近年来，随着ALV多个亚群混合感染情况在各地鸡群中不断出现，加上RNA病毒本身具有遗传多样性的特点，以致ALV基因组极易发生变异或重组，并使病毒有效逃避宿主防御机制、扩大感染宿主的范围并表现出更为复杂的致病特征[5-6]。例如，Li等[7]在江苏某鸡场分离出1株由ALV-K gp85基因、ALV-E gp37基因和ALV-J LTR基因组成的JS15SG01株，感染该毒株的SPF鸡表现出严重的病毒血症现象且病毒脱落能力也显著增强，并伴有明显的嗜神经症状，给ALV的防控带来新的挑战。因此，ALV的分离鉴定及基因组序列分析对于了解该病毒的致病机制、遗传进化状况以及制定ALV有效防控措施至关重要。本研究从RT-PCR检测为ALV阳性的病死鸡组织样品中分离、鉴定到1株E亚群禽白血病病毒，命名为HLJE2020，通过对其全基因组序列进行分析，分析其遗传演变趋势，为黑龙江地区禽白血病病毒的净化提供参考和依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 样本与细胞 2020年8月，黑龙江省某鸡场的海兰白病死鸡，无明显临床症状。取病死鸡的心、肝、肺、肾和法氏囊，各组织眼观无异常。原代鸡胚成纤维细胞(CEF)由SPF级鸡胚制备，DF-1细胞系、大肠杆菌DH5α感受态细胞和BL21(DE3)感受态细胞均由东北农业大学兽医微生物与免疫学实验室保存。
1.1.2 主要试剂 禽白血病病毒ELISA抗原检测试剂盒购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司；ExTaq DNA聚合酶、反转录酶RRI和RT-ace、Oligo(dT)18 Primer、DL2000 DNA Marker、pMD-19T(Simple)质粒等购自大连宝生物工程公司；ALV P27单克隆抗体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠；山羊抗小鼠FITC-IgG购自Sigma公司。
1.2 样本的检测将采集的心、肝、肺、肾和法氏囊进行研磨处理，采用TRIzol法提取RNA并反转录为cDNA，同时使用DNA提取试剂盒提取DNA，利用参考文献中的禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性贫血病病毒(CAV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)的特异性引物[8-16]进行PCR检测(表 1)，引物均由吉林吉林省库美生物科技公司合成。
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表 1 鸡常见传染性病毒的检测引物 Table 1 Primers for detection of common infectious viruses in chicken |
使用液氮将检测为ALV阳性的组织研磨至粉状，依照1∶5的比例加入灭菌PBS，置于－80 ℃反复冻融3次后，4 ℃ 12 000 r·min－1离心10 min，收集上清液并过滤一次后接种于生长密度达70% CEF和DF-1细胞中，吸附作用3 h，补加维持液培养7 d后反复冻融2次，收集上清液，按照上述方法盲传3代，病毒液于－80 ℃保存。
1.4 病毒的鉴定1.4.1 病毒亚群的鉴定 取P3代CEF细胞和DF-1细胞上清液提取RNA，采用参考文献中ALV-A-E、ALV-J和ALV-K的引物[17-18]进行RT-PCR扩增(表 2)，从而进行ALV亚群的鉴定。
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表 2 ALV亚群鉴定引物 Table 2 ALV subgroup identification primer |
1.4.2 病毒的间接免疫荧光(IFA)鉴定 以ALV P27单克隆抗体(1∶100稀释)为一抗，山羊抗小鼠FITC-IgG(1∶100稀释)为二抗，利用间接免疫荧光试验(IFA)检测CEF细胞中病毒增殖情况，并设立未感染的CEF细胞为阴性对照。
1.4.3 病毒的形态学鉴定 取细胞病毒液200 mL，4 ℃ 6 000 r·min－1离心20 min，再取上清，用超速离心机4 ℃ 35 000 r·min－1高速离心2 h后，弃上清，用100 μL灭菌的去离子水重悬沉淀。吸取25 μL滴于铜网上作用15 min，用2%磷钨酸负染色1 min 30 s，自然晾干，置于透射电子显微镜观察。
1.4.4 病毒传代的鉴定 收集P3至P11代细胞病毒液，依照禽白血病病毒抗原ELISA检测试剂盒说明书步骤进行ALV P27抗原检测，同时提取P3至P11代细胞病毒液RNA，使用ALV A-E鉴定引物进行RT-PCR检测，利用以上两种方法检测病毒传代稳定性。
1.5 病毒全基因组的测定1.5.1 病毒全基因组序列扩增与测序鉴定 参照GenBank中ALV-E参考毒株ev-1株(GenBank登录号：AY013303)全基因组序列，分段设计并合成用于扩增分离株全基因组序列引物(表 3)。提取细胞培养上清液RNA进行RT-PCR扩增，PCR产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段与pMD-19T(Simple)载体进行连接、转化，挑选菌株提取质粒后进行PCR鉴定，鉴定结果为阳性的质粒送吉林省库美生物科技公司测序。
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表 3 ALV-E全基因组序列扩增引物 Table 3 Amplification primer of ALV-E whole genome sequence |
1.5.2 病毒全基因组序列分析 应用DNAStar Lasergen 7.0软件对测序后各片段序列进行剪切、拼接和同源性比较；利用MEGA 7.0软件对分离株的env、gp85和LTR基因序列进行遗传进化分析；利用RDPv.4(Recombination Detection Program 4)软件[19]中7种重组检测算法(RDP、GENECONV、BootScan、Max Chi、Chimaera、SiScan、3Seq) 对分离株gp85基因进行潜在重组分析。之后利用SimPlot(v3.5.1)软件验证分离株gp85基因中是否存在重组情况。用于序列比对分析的28株ALV各亚群参考毒株(国内外最初和近些年最新发现且具有代表性的ALV参考毒株)详细信息见表 4。
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表 4 用于序列比对的参考毒株信息 Table 4 Reference strains information for sequence alignment |
以病料提取的RNA为模板，经RT-PCR扩增获得ALV P27基因，结果显示，各组织均在约674 bp处出现特异性条带，与预期结果相符(图 1a)，表明该病料中含有ALV；而病料各组织提取RNA或DNA后，均未扩增到REV、IBDV、IBV、NDV、AIV、ARV、MDV、CAV和ILTV的目的基因(图 1b)。
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a.病死鸡病料的ALV P27检测；b.病死鸡病料的鸡常见病毒检测；M. DNA相对分子质量标准；1、7.阴性对照；2.心；3.肝；4.肺；5.肾；6.法氏囊；8.禽白血病病毒；9.禽网状内皮组织增生症病毒；10.传染性法氏囊病毒；11.传染性支气管炎病毒；12.新城疫病毒；13.禽流感病毒；14.禽呼肠孤病毒；15.马立克病毒；16.传染性贫血病病毒；17.传染性喉气管炎病毒 a. Detection of ALV P27 in sick materials of dead chickens; b. Detection of common viruses in sick materials of dead chickens; M. DL2000 DNA marker; 1, 7. Negative control; 2.Heart; 3.Liver; 4.Lungs; 5.Kidney; 6.Bursa; 8. ALV; 9. REV; 10. IBDV; 11. IBV; 12. NDV; 13. AIV; 14. ARV; 15. MDV; 16. CAV; 17. ILTV 图 1 病死鸡病料的RT-PCR鉴定结果 Fig. 1 The identification results of sick materials of dead chickens by RT-PCR |
2.2.1 病毒的亚群鉴定结果 对盲传3代后的CEF和DF-1细胞上清提取RNA后进行RT-PCR鉴定。结果显示，经CEF细胞培养的上清液可扩增到约300 bp条带，而由DF-1细胞培养的上清液及阴性对照均未扩增出目的条带(图 2)。由于除E亚群ALV外，A~D亚群ALV均可在DF-1细胞传代培养[20-23]，初步表明该分离株可能为E亚群禽白血病病毒。
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M.DNA相对分子质量标准；1.阴性对照；2.A-E亚群(P3代CEF细胞上清)；3.J亚群(P3代CEF细胞上清)；4.K亚群(P3代CEF细胞上清)；5.A-E亚群(P3代DF-1细胞上清)；6.J亚群(P3代DF-1细胞上清)；7.K亚群(P3代DF-1细胞上清) M.DL2000 DNA marker; 1.Negative control; 2.A-E subgroup (P3 generation CEF cell supernatant); 3.Subgroup J (P3 generation CEF cell supernatant); 4.K subgroup (P3 generation CEF cell supernatant); 5.A-E subgroup (P3 generation DF-1 cell supernatant); 6.Subgroup J (P3 generation DF-1 cell supernatant); 7.Subgroup K (P3 generation DF-1 cell supernatant) 图 2 ALV亚群RT-PCR鉴定结果 Fig. 2 RT-PCR identification results of ALV subgroup |
2.2.2 病毒的IFA鉴定结果 利用IFA法检测接种P3代细胞毒7 d的CEF细胞，结果显示，ALV P27单克隆抗体与接毒细胞呈阳性反应，细胞质中出现绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光，可见ALV在细胞质中获得增殖，而未接毒细胞仅细胞核呈蓝色荧光，细胞质无特异性荧光(图 3)。
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a~c.ALV-E感染的CEF细胞；d~f.CEF细胞阴性对照 a-c.ALV-E infected CEF cells; d-f.CEF cells negative control 图 3 间接免疫荧光检测结果(bar=100 μm) Fig. 3 Indirect immunofluorescence test results (bar=100 μm) |
2.2.3 病毒形态学鉴定结果 P3代CEF细胞培养上清液经超速离心和负染色后，通过透射电镜可观察到病毒粒子近似球形，具有明显的囊膜和纤突结构，整体直径约为80 nm (图 4)，与ALV形态大小相符，将该毒株命名为HLJE2020株。
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图 4 透射电镜下的ALV病毒粒子(150 000×) Fig. 4 ALV virus particles under transmission electron microscope(150 000×) |
2.2.4 病毒传代的鉴定结果 取HLJE2020株P3至P11代CEF细胞培养上清液，利用ELISA和RT-PCR法检测分离株的传代稳定性。ELISA结果显示，随着传代次数的增加，病毒液中P27抗原的S/P值逐渐下降，并于P10代呈阴性(表 5)。RT-PCR结果显示P3~P9代可检测到目的基因，但P10代后未检测到病毒核酸(图 5)。上述结果表明，该分离株无法长期有效于CEF细胞中进行连续传代培养。
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表 5 HLJE2020株各代CEF细胞培养上清液P27抗原检测结果 Table 5 P27 antigen detection results of supernatant of each generation HLJE2020 strain CEF cell culture |
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N. DNA分子质量标准；1. 阴性对照；2~10. P3~P11细胞毒 N. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2-10. P3-P11 cytotoxicity 图 5 HLJE2020株于CEF细胞传代的RT-PCR鉴定结果 Fig. 5 RT-PCR identification results of HLJE2020 strain passaged in CEF cells |
2.3.1 HLJE2020株全基因组序列扩增和测序结果 将HLJE2020株病毒液提取RNA后进行RT-PCR扩增，结果显示，各段均成功扩增出目的片段，与预期条带大小一致(图 6)。利用DNAStar软件将各段测序结果进行拼接，获得了HLJE2020株全基因组序列。结果显示，该分离株全基因组序列全长为7 524 bp，与经典的复制完整型C型反转录病毒结构相符，其中，3个编码蛋白的基因gag基因长2 106 bp，位于碱基位554—2 659；pol基因长2 688 bp，位于碱基位2 677—5 364；env基因长1 851 bp，位于碱基位554—571和5 252—7 084；两端完全相同，LTR基因全长274 bp，由U3、R和U5序列组成，长度分别为175、21和78 bp。将序列上传至GenBank，获得登录号为OK216743。
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M. DNA分子质量标准；1~8. F1~F8扩增片段 M. DNA Marker DL2000; 1-8. F1-F8 amplified fragment 图 6 HLJE2020株全基因组序列扩增结果 Fig. 6 Amplification result of the whole genome sequence of HLJE2020 strain |
2.3.2 HLJE2020株全基因组序列分析结果 将HLJE2020株全基因组序列同选定的28株ALV各亚群参考毒株进行比对分析，结果显示(表 6)，HLJE2020株与28株参考毒株间的核苷酸相似性为83.6%~98.5%；gag和pol基因较为保守，二者与ALV各亚群参考毒株间的核苷酸相似性分别为94.6%~99.3%和94.9%~99.1%，氨基酸相似性分别为95.9%~99.3%和95.6%~98.9%；而env和LTR基因的核苷酸相似性与其他参考毒株间的差异相对较大，二者与ALV各亚群参考毒株间的核苷酸相似性分别为51.6%~97.4%和58.1%~98.2%，其中二者均与E亚群ALV参考毒株的核苷酸相似性最高，分别为95.6%~97.4%和94.9%~98.2%，而遗传进化分析结果也显示二者与E亚群ALV参考毒株隶属同一个进化分支，其中与含有内源性ALV LTR基因的参考毒株JS14CZ01株和JS13LY19株具有较近的亲缘关系(图 7)。
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表 6 HLJE2020株全基因组序列与ALV各亚群参考毒株的相似性比较 Table 6 Comparison of homology between the whole genome sequence of HLJE2020 strain and the reference strains of ALV subgroups |
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a.HLJE2020株env核苷酸序列遗传进化树；b. HLJE2020株LTR核苷酸序列遗传进化树 a.Phylogenetic tree of env nucleotide sequence of HLJE2020 strain; b. Phylogenetic tree of LTR nucleotide sequence of HLJE2020 strain 图 7 HLJE2020株与ALV各亚群参考毒株核苷酸序列遗传进化树 Fig. 7 Phylogenetic tree of nucleotide between HLJE2020 strain and reference strains of ALV subgroups |
2.3.3 HLJE2020株gp85基因序列分析结果 gp85蛋白是病毒囊膜蛋白env编码的主要蛋白之一，由于其能特异性结合靶细胞膜上的受体，因而决定了ALV感染宿主的范围以及亚群的特异性。将HLJE2020株gp85基因同选定的28株ALV各亚群参考毒株gp85基因进行比对，结果显示(表 6)，gp85基因与ALV各亚群参考毒株的核苷酸相似性为50.1%~94.1%，氨基酸相似性为37.3%~92.0%，其中, 与E亚群和B亚群ALV参考毒株的相似性均在90% 以上；而gp85核苷酸序列遗传进化分析结果显示该毒株gp85基因在B亚群和E亚群ALV之间出现一个单独的分支(图 8)，且该分离株gp85氨基酸序列的5个易变异区域中的Vr2、hr1和Vr3区域的氨基酸组成与B亚群参考毒株相似，Vr1、hr2以及其他区域的氨基酸组成与E亚群参考毒株相似(图 9)，推测该分离株gp85基因核苷酸序列在225—618 bp和810—840 bp处可能存在E亚群ALV与B亚群ALV的重组事件。
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图 8 HLJE2020株与ALV各亚群参考毒株gp85核苷酸序列遗传进化树 Fig. 8 Phylogenetic tree of gp85 nucleotide between HLJE2020 strain and reference strains of ALV subgroups |
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ALV各毒株gp85氨基酸序列中圆点表示氨基酸一致，破折号“—”表示氨基酸缺失，字母表示氨基酸突变 In the gp85 amino acid sequence of ALV strains, the dots represent consistent amino acids, the dashes "—" represent amino acid deletion, and the letters represent amino acid mutation 图 9 HLJE2020株与ALV参考毒株gp85氨基酸序列分析 Fig. 9 Amino acid sequence analysis of gp85 between HLJE2020 strain and ALV reference strain |
随后利用RDPv.4软件中的RDP、GENE-CONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq进一步分析HLJE2020株gp85基因的重组事件，结果显示(判断依据：至少保证5种算法的P值< 10-5且Recombinant sequence identification graphs中第一个柱状图面积评分需>0.600)，该分离株gp85基因是由主要亲本毒株AF229株(美国2017年商品肉鸡分离株)与次要亲本毒株SDAU09C2株(中国2012年山东地方品系种鸡芦花鸡分离株)于核苷酸序列258—613 bp产生1处重组信号，形成了HLJE2020株重组gp85基因(表 7和图 10)；而SimPlot软件分析结果也进一步表明HLJE2020株的gp85基因确实存在重组现象(图 11)。
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表 7 HLJE2020株的RDPv.4重组分析数据 Table 7 RDPv. 4 recombination analysis data of HLJE2020 strain |
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图 10 HLJE2020株gp85基因重组分析结果 Fig. 10 Analysis of gp85 gene recombination of HLJE2020 strain |
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设置：窗口200 bp, 步长20 bp，间隙开启，Kimura两参数模型，T/t2.0 Settings: Window 200 bp, Step 20 bp, Gapstrip on, Kimura (2-parameter), T/t 2.0 图 11 HLJE2020株的SimPlot重组分析结果 Fig. 11 SimPlot recombination analysis results of HLJE2020 strain |
自1999年我国首次发现J亚群ALV以来，其在全国多地鸡场中的广泛分布严重阻碍了养鸡业的健康发展[24-25]。尽管我国从2008年起开始实行禽白血病根除计划(NEP)并取得一定成效，然而在某些采取净化措施不到位的地方品系鸡群中仍然存在着ALV多个亚群混合感染的情况[26]，导致鸡体在受到多个基因组不同的ALV病毒粒子感染时，就可能产生包含来自两个或多个亲本基因组序列的重组ALV[6]。因此，务必要引起国内养禽业的重视。
本研究通过对黑龙江省某养鸡场病料进行检测，将ALV阳性样品处理后接种于CEF细胞培养，利用RT-PCR、IFA和透射电镜方法对分离株进行鉴定，分离到一株E亚群ALV HLJE2020株。通过对该分离株的传代稳定性进行研究，发现随着传代次数的增加，P27抗原的S/P比值也随之下降，在盲传至第10代后的P27抗原检测结果均呈阴性，这与徐海鹏等[27]从种蛋中分离出的E亚群ALV在CEF细胞上连续传代培养后P27抗原S/P值不断下降的结果一致。同时，RT-PCR结果也显示, 在盲传至第10代后检测不到病毒核酸的存在。推测其原因可能是E亚群ALV基因组中LTR基因同外源性ALV相比其启动子活性较弱，而LTR启动子活性的强弱与病毒的复制能力、翻译以及致瘤性密切相关[4]，因而导致E亚群ALV的复制和感染能力很弱，无法长期连续传代培养，但具体原因仍需进行后续研究。
gp85基因是ALV env基因的重要组成部分，与敏感细胞的识别和黏附过程有关，它是决定ALV亚群分类的主要依据，其编码的蛋白也是病毒中和的主要抗原[2]，其核苷酸序列的改变，特别是某些位点的变化可能对病毒的抗原性、细胞趋向性等方面产生影响，甚至有可能经过长期的突变和重组而产生新的亚群，因此其在ALV的遗传演化中发挥着重要作用[28]。在本研究中，通过对HLJE2020株gp85基因进行核苷酸(氨基酸)同源性、遗传进化和重组分析，发现该分离株gp85基因的重组区域主要集中在gp85基因5个高变区(hr1、hr2、Vr1、Vr2和Vr3)中的hr1和hr2，且该区域的重组元件是由B亚群ALV提供，这与先前多项研究中发现重组ALV毒株基因组中的重组区域主要位于LTR基因、gag基因或gp37基因且均由E亚群ALV提供重组元件的情况有所不同[4, 29]。有研究表明，gp85基因高变区中的hr1和hr2是病毒糖蛋白三聚体和宿主蛋白受体之间的主要结合域[30]，当其受到外界环境或免疫反应的选择压力的干扰极有可能发生变异[31]，而这些区域的改变就会对细胞受体的结合以及宿主范围产生影响[32]，进而推测该分离株在此区域的改变可能使病毒感染、复制和传播的能力增强，并使其感染的宿主范围发生改变，同时也进一步表明我国ALV已发生新的变异趋势，这种新的变异现象的产生应当引起人们的高度重视。而有关该重组毒株的真实起源、形成过程等方面内容还有待后续研究。
4 结论本研究成功分离出1株E亚群ALV HLJE2020株，且该分离株基因组序列中的gp85基因可能存在E亚群ALV和B亚群ALV的重组现象，为今后ALV的变异趋势和致病机制的研究奠定基础。
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(编辑 白永平)
表 1(Table 1)
图 1(Fig. 1)