2. 西南大学医学研究院免疫学研究中心, 重庆 402460
, ZHAO Shasha1, JIANG Songhong1, TONG Zhizi1, HUANG Danni1, GUO Jianhua1,2, WU Junwei1, ZHOU Yang1,2
2. Immunology Research Center, Medical Research Institute, Southwest University, Chongqing 402460, China
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，简称金葡菌)是革兰阳性菌，广泛存在于动物皮肤和黏膜以及环境中，生存能力强，易产生耐药性，释放如肠毒素A、α-溶血素、凝集因子A和杀白细胞素等多种毒素，可引起多种感染性疾病，严重者可导致脓毒血症、败血症或肺炎，危及生命[1]。
IFN是宿主防御时生成的细胞因子，在免疫监视和启动对病原的免疫应答过程中发挥重要作用。IFN分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，与其受体相互作用后刺激细胞内和细胞间信号转导网络，调控天然免疫和获得性免疫，触发抗感染活性。Ⅰ型IFN最初作为干扰病毒增殖的可溶性因子发现，由天然免疫细胞合成[2]。Ⅰ型IFN家族包括多个结构相似的成员，基因存在于人的9号染色体和小鼠的4号染色体，IFN-α主要由白细胞生成，如淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，巨噬细胞源自单核细胞，因此白细胞称为天然的IFN生成细胞，IFN-α称为白细胞IFN[3]。IFN-α有13个亚型，研究非常广泛[4]，其中，IFN-α4直接受IFN调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)调控[5]，是微生物感染后最早生成的IFN[6]。Ⅰ型IFN的生成受到TANK结合激酶1(Tank-binding kinase 1，TBK1) /IRF3通路的调控。位于内质网的干扰素基因刺激蛋白(stimulator of IFN genes，STING)识别胞内双链DNA，募集并磷酸化TBK1，TBK1激活后与IRF3相互作用，导致IRF3磷酸化[7]和NF-κB通路激活[8]，促进Ⅰ型IFN的生成。静息状态下，NF-κB与NF-κB抑制剂α(inhibitor of κBα，IκBα)结合处于失活状态，细胞受到刺激时，IκBα发生磷酸化和泛素化，NF-κB与其脱离后激活[9]。金葡菌感染后促进树突状细胞[10]和呼吸道上皮细胞[11]生成Ⅰ型IFN。金葡菌可入侵猪[12]和人[13]的中枢神经系统引起脑部感染，如脑膜炎，但该菌感染小胶质细胞后对Ⅰ型IFN通路的影响尚不清楚。本研究表明，金葡菌感染小鼠小胶质细胞BV2后促进IFN-α生成，该过程依赖于TBK1和NF-κB通路。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器BV2细胞和金葡菌由本实验室保存。
DMEM高糖培养基(C11995500BT)购自Gibco，胎牛血清(P30-3302)购自PAN，胰酶(T8150)和总RNA提取试剂盒(R1200)购自北京索莱宝生物科技有限公司，Mueller-Hinton肉汤(MHB，HB6231)和Mueller-Hinton琼脂(MHA，HB6232)购自青岛海博生物技术有限公司，化学发光液检测试剂盒(WBKlS0100)购自millipore，BX-795(14932)、IMD-0354(17290)和amlexanox(14181)购自Cayman，反转录试剂盒(R312)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，小鼠IFN-α ELISA试剂盒(SEKM-0149)购自Thermo Fisher。TBK1(ab235253)、p-TBK1(ab109272)抗体购自Abcam，β-actin(66009)、IκBα(10268)和IRF3(113112)抗体购自proteintech，p-IκBα(AP0614)和p-IRF3(AP0623)抗体购自Abclonal，辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZB-2301)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
垂直电泳仪购自Bio-Rad，化学发光成像仪购自Vilber。
1.2 细胞、细菌培养和感染BV2细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基置于二氧化碳培养箱培养，二氧化碳浓度5%，细胞汇合度到90%左右时传代，2 d传代一次。金葡菌在MHA平板划线，挑取单克隆接种到MHB 37 ℃过夜培养，50倍稀释培养2.5 h，12 000 r·min－1离心2 min，PBS洗涤3次，根据试验中指定的MOI加入一定体积的完全培养基，重悬后加入到细胞中，感染后30 min用37 ℃预热PBS洗涤3次，加入含100 μg·mL－1庆大霉素的完全培养基继续培养至收样。
1.3 Western blot10 μL样品加入到SDS-PAGE电泳，蛋白转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，一抗(TBK1和p-TBK1抗体5 000倍稀释，其他抗体1000倍稀释)4 ℃孵育过夜，TBST(NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Tris base 3 g，Tween-20 1 mL，超纯水1 L，盐酸调pH7.4)洗涤5次，每次5 min，二抗(10 000倍稀释)37 ℃孵育1 h，TBST洗涤5次，每次5 min，滴加化学发光液，化学发光成像仪曝光。
1.4 实时荧光定量PCR按照说明书提取总RNA，反转录得到cDNA，实时荧光定量PCR体系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.4 μL，超纯水8.6 μL。引物序列如表 1所示，反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。β-actin作为内参，相对定量法(2-ΔΔCt)分析。IFN-α分别检测IFN-α4和IFN-αn(包括5个亚型，分别为IFN-α1、α2、α7、α11和α12)[6]。
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表 1 实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 Primer sequences of Real-time quantitative PCR |
细胞培养液上清1 000 ×g离心10 min，取上清，按照试剂盒说明书检测IFN-α浓度。
1.6 数据分析Image pro plus进行蛋白灰度分析。试验数据经Excel整理，t检验分析差异，*表示差异显著(0.01 < P < 0.05), **表示差异极显著(P < 0.01)，GraphaPad prism作图。
2 结果 2.1 金葡菌促进BV2表达IFN-α为探明BV2感染金葡菌后IFN-α表达水平的变化，首先检测了金葡菌感染后不同时间点IFN-α的转录水平。结果表明，感染后1 h，IFN-α转录水平没有变化，3~6 h转录水平逐渐上升，12 h降低(图 1A)。分别用MOI为8、40和200的金葡菌感染BV2时，IFN-α的转录水平上升呈现剂量依赖性(图 1B)。BV2感染金葡菌后ELISA法检测细胞培养液中IFN-α水平发现，感染后1~3 h，IFN-α水平没有变化，6~12 h释放进入培养液中的IFN-α逐渐上升(图 1C)。BV2感染不同MOI的金葡菌时，IFN-α的释放量随着MOI的升高而增加(图 1D)。
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NC表示阴性对照；S.A.表示金葡菌；*.0.01<P < 0.05；**.P < 0.01。下图同 NC indicates negative control, S.A. indicates S. aureus, *. 0.01<P < 0.05, and **. P < 0.01. The same as below 图 1 金葡菌促进BV2表达IFN-α Fig. 1 S. aureus promotes IFN-α production in BV2 cells |
为阐明金葡菌感染BV2细胞后是否通过该通路诱导IFN-α的生成，首先检测了TBK1和IRF3的转录水平。结果表明，BV2感染金葡菌后1~12 h范围内，TBK1和IRF3的转录水平没有发生变化(图 2A、B)。Western blot检测蛋白水平结果表明，感染后1~12 h，TBK1和IRF3的蛋白水平没有变化，但感染后1 h，TBK1和IRF3磷酸化水平开始升高，在1~6 h逐渐升高，12 h下降，但均高于阴性对照组(图 2C~E)。分别用MOI为8、40和200的金葡菌感染BV2细胞，6 h后TBK1和IRF3磷酸化水平的升高呈剂量依赖性(图 2F~H)。以上结果表明，金葡菌感染BV2细胞后激活TBK1/IRF3通路。
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图 2 金葡菌感染BV2细胞后激活TBK1/IRF3通路 Fig. 2 S. aureus activates TBK1/IRF3 pathway following infection in BV2 cells |
为探究TBK1在金葡菌诱导BV2细胞生成IFN-α中的作用，分别用2种TBK1抑制剂BX-795和amlexanox处理细胞后再感染金葡菌。结果表明，BX-795抑制TBK1磷酸化后(图 3A和3B)，IRF3蛋白水平没有变化，但其磷酸化水平降低(图 3A和3C)，同时，IFN-α释放量减少(图 3D)。aml- exanox处理BV2后，TBK1磷酸化水平没有变化(图 3E和3F)，p-IRF3蛋白水平下降(图 3E和3G)，IFN-α释放量减少(图 3H)。上述结果表明，TBK1参与BV2感染金葡菌后生成IFN-α。
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A~D. BX-795处理；E~H.Amlexanox处理 A-D. Treatment with BX-795; E-H. Treatment with amlexanox 图 3 金葡菌诱导BV2细胞生成IFN-α需要TBK1 Fig. 3 TBK1 is required for S. aureus-induced IFN-α production in BV2 cells |
TBK1激活后介导NF-κB通路活化，促进Ⅰ型IFN的生成[14]。为探明BV2细胞感染金葡菌后生成IFN-α是否依赖于NF-κB通路，首先检测金葡菌感染后是否激活该通路。BV2感染金葡菌后1~12 h，IκBα蛋白水平没有升高，但感染后1 h，p-IκBα蛋白水平开始上升，在1~6 h逐渐升高，12 h略有下降(图 4A、B)。为阐明感染金葡菌后IFN-α生成与NF-κB通路激活的关系，用IMD-0354处理BV2后感染金葡菌。结果表明，该抑制剂处理细胞后，p-IκBα蛋白水平降低(图 4C、D)，同时伴随p-TBK1和p-IRF3蛋白水平降低(图 4C、E和F)，并且IFN-α生成减少(图 4G)。以上结果表明，BV2细胞感染金葡菌后促进IFN-α生成依赖于NF-κB通路。
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图 4 金葡菌促进BV2细胞生成IFN-α依赖于NF-κB通路 Fig. 4 S. aureus-induced IFN-α production is dependent on NF-κB pathway in BV2 cells |
巨噬细胞是细菌等微生物侵入机体后机体防御的第一道防线，在清除病原、维持机体稳态过程中发挥关键作用[15-16]。小胶质细胞是脑中常驻巨噬细胞，起源于骨髓单核细胞和骨髓造血干细胞，通过自我更新保持一定数量，不通过循环的血祖细胞分化[17]。BV2细胞是用携带致癌基因v-raf/v-myc的反转录病毒J2感染原代小鼠小胶质细胞获得的永生化细胞，常作为替代原代小胶质细胞研究的工具细胞[18-19]。金葡菌感染可引起人和动物中枢神经系统感染，如脑膜炎[12-13]，但金葡菌对小胶质细胞的作用尚没有报道，因此本研究通过探索BV2细胞感染金葡菌后Ⅰ型干扰素通路的变化阐明BV2在机体感染金葡菌后发挥的机体防御作用。
Ⅰ型IFN在机体防御细菌感染过程中发挥重要作用。机体感染嗜肺军团菌[20]、链球菌、肺炎双球菌和大肠杆菌[21]后，Ⅰ型IFN的生成增加，抑制细菌的增殖，促进细菌从体内清除。然而，金葡菌可通过操作宿主的免疫系统促进自身的增殖，如自噬和凋亡。金葡菌能入侵吞噬细胞并利用胞内环境促进自身存活和扩散[7]。在树突状细胞中，金葡菌通过Toll样受体9(toll-like receptor 9，TLR9)激活Ⅰ型IFN通路，与野生型小鼠比较，Ⅰ型IFN受体敲除小鼠感染金葡菌后，肺中载菌量下降约20倍[10]，支气管肺泡灌洗液中载菌量更低，死亡率降低70%[11]。本研究发现，金葡菌感染BV2后激活Ⅰ型IFN通路，IFN-α转录水平和释放量升高。
TBK1/IRF3通路介导Ⅰ型IFN的生成，TBK1和IRF3通过翻译后修饰——磷酸化激活。BV2感染金葡菌后1~12 h，TBK1和IRF3在mRNA和蛋白水平均没有发生变化，但感染后1 h发生磷酸化，IFN-α在感染后3 h mRNA水平升高，6 h释放量显著增加，表明金葡菌激活TBK1/IRF3通路介导IFN-α释放。与此一致的是，TLR4受体激动剂LPS和TLR3受体激动剂poly(I: C)处理小鼠骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)[22]，或水疱性口炎病毒感染HEK293T细胞[23]，TBK1和IRF3蛋白水平没有变化，但介导其发生磷酸化促进了IFN-α释放。
TBK1与ATP结合后促进IRF3磷酸化[24]。Amlexanox通过竞争性结合ATP抑制TBK1活性，但不降低TBK1磷酸化水平，p-IRF3水平下降[25]，是临床上用于治疗癌症的候选药物[26]。Amlexanox处理BV2后感染金葡菌，p-TBK1水平没有变化，p-IRF3水平降低，IFN-α生成减少，同时，BX-795处理细胞感染金葡菌后，p-TBK1和p-IRF3水平以及IFN-α生成量均下降，表明TBK1参与金葡菌促进BV2细胞生成IFN-α。
NF-κB在不同微生物激活Ⅰ型干扰素通路中的作用存在差异。一方面，小鼠巨细胞病毒感染成纤维细胞后，M35蛋白入核，抑制NF-κB活化，从而减少Ⅰ型干扰素的表达[27]。从敲除NF-κB相关蛋白(如RelA、RelB和c-Rel)的小鼠分离的成纤维细胞感染仙台病毒或新城疫细胞，IFN-β的生成下降较少，表明NF-κB在仙台病毒或新城疫细胞诱导I型干扰素生成中的作用较小[28]。另一方面，甲型流感病毒激活NF-κB，促进细胞因子信号转导抑制蛋白3(suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)表达，抑制Ⅰ型干扰素表达[29]。β-联蛋白(β-catenin)与p300转录辅因子互作，结合IFN-β启动子，促进IFN-β表达，甲型流感病毒通过激活NF-κB抑制过表达β-联蛋白诱导的IFN-β表达水平升高[30]。本研究发现，金葡菌诱导BV2细胞生成IFN-α需要NF-κB的参与。
4 结论BV2细胞感染金葡菌后，激活TBK1/IRF3和NF-κB通路，促进IFN-α的生成。
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(编辑 白永平)