嵴病毒(Kobuvirus, KoV)属于小RNA病毒科嵴病毒属^[1]，目前, KoV有Aichivirus A~ Aichivirus F 6个不同的种以及3个未分类的KoV^[1]，研究表明，Aichivirus A成员人爱知病毒、Aichivirus B成员牛嵴病毒和Aichivirus C成员猪嵴病毒为腹泻相关病原^[2-3]。

目前，在绵羊中鉴定了2个种的KoVs：Aichivirus B和Aichivirus D，绵羊嵴病毒(ovine kobuvirus, OKoV)早期被归纳为Aichivirus B成员，2010年，首次在匈牙利健康绵羊的粪便样本中检测到Aichivirus B OKoV^[4]；随后在巴西健康、腹泻绵羊的粪便样本和爱尔兰绵羊肠系膜淋巴结中都检测到Aichivirus B OKoV^[5-6]。本研究前期在四川腹泻绵羊粪便样本中获得了一个完整的OKoV基因组，研究发现该基因组与牛源Aichivirus D毒株基因组遗传关系最近，证明是Aichivirus D的一个成员^[7]，表明宿主绵羊可能存在多种成员的KoVs病毒。

GenBank基因库目前只录入了2个OKoV基因组序列，其中，1个来自匈牙利毒株(GenBank登录号为GU245693)，系Aichivirus B的成员^[4]，另外一个来自本实验室前期发现的中国毒株(GenBank登录号为MW296158)，系Aichivirus D的成员^[7]。KoV基因组主要由5′端非编码区(5′UTR)、开放阅读框(ORF)以及3′端非编码区(3′UTR)构成^[1]。

目前，常用的KoV RT-PCR检测方法的靶基因均为3D^[4-6]。关于OKoV的分子检测方法只有一篇RT-PCR方法的报道^[8]，本研究旨在根据我国绵羊源Aichivirus D最保守的3D基因序列设计引物，建立特异性检测绵羊源Aichivirus D的荧光RT-PCR方法，调查分析该病毒在国内的流行情况及其3D基因的分子特征。

1 材料与方法 1.1 病毒(菌)株核酸和临床样本

绵羊源Aichivirus D、山羊嵴病毒、绵羊肠道病毒、A群羊轮状病毒、羊星状病毒、牛冠状病毒、牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛嵴病毒、绵羊源产肠毒素大肠杆菌、绵羊源沙门菌、绵羊源志贺菌、粪肠球菌、枯草芽胞杆菌、奇异变形杆菌核酸样本均由西南民族大学动物医学实验室-20 ℃保存。

50份绵羊(3月龄以内)腹泻粪便样本，于2019年1月―2020年4月采自四川阿坝3个绵羊养殖场，用于检测方法比较；253份绵羊(3月龄以内)粪便样本(健康羊的133份，腹泻羊的120份)于2020年4月―2021年5月分别采自阿坝、红原和若尔盖共6个养殖场，用于流行病学调查，所有粪便样本均由西南民族大学动物医学实验室-80 ℃保存。

1.2 引物的设计与合成

根据GenBank数据库的绵羊源Aichivirus D 3D基因序列，采用Primer Premier 6.0软件设计引物，引物序列为F: 5′-AAGCCCTTGCTCTTTACACTTCTACCC-3′, R: 5′-CACGGGACAGCCCCTTCTTCAC-3′，位于绵羊源Aichivirus D毒株SWUN/AB18/2019基因组序列的7 118—7 423 nt(GenBank登录号：MW364797)，由擎科生物有限公司合成。

1.3 核酸提取

用TRIzol法提取样本总RNA，按照Prime Script TMRT试剂盒说明书的步骤反转录成cDNA^[9]，-20 ℃保存备用。

1.4 阳性标准品的制备

以绵羊源Aichivirus D SWUN/AB18/2019毒株cDNA为模板，阳性标准品的制备同文献[9]。

1.5 反应条件及体系的优化

退火温度和引物浓度的优化同文献[9]。

1.6 熔解曲线分析和标准曲线的建立

用本试验建立的荧光RT-PCR方法分别对10^-1~10^-10递增稀释的标准品进行检测，建立标准曲线^[9]。

1.7 检测绵羊Aichivirus D荧光RT-PCR方法的评价

评价指标主要包括特异性、稳定性、敏感性和准确性。用本试验所建立的方法对“1.1”中其他羊腹泻病原的核酸样本进行荧光RT-PCR检测，对照组用等量RNase Free ddH₂O替代，以评价该方法的特异性。方法的批内和批间稳定性评价、敏感性测定同文献[9]。采用本试验所建立的检测绵羊源Aichivirus D荧光RT-PCR方法和常用于检测OKoV的RT-PCR方法分别对50份绵羊腹泻粪便样本进行检测以评价准确性。

1.8 临床样本中绵羊源Aichivirus D的检测

利用本试验建立的方法对253份绵羊腹泻粪便样本进行绵羊源Aichivirus D的检测。

1.9 绵羊源Aichivirus D完整的3D基因序列扩增

自行设计2对特异性引物分段扩增绵羊源Aichivirus D完整的3D基因，引物信息：F1: 5′- CATTCCGTGGGCTCTGTGGTG-3′, R1: 5′-GCAAC -CAACCGCACTGCCATACT-3′; (6 748—7 533 nt, GenBank登录号：MW296158); F2′: 5′-AAGGGGCTGTCCCGTGCTG-3′; R2: 5′-GAGACCAACACCATTACAAAGAGCCTAAC-3′ (7 426— 8 378 nt, GenBank登录号：MW296158)，对“1.1”检测到的阳性样本，进行绵羊源Aichivirus D完整的3D基因分段克隆，并用生物软件分析3D基因序列^[9]。

2 结果 2.1 引物的特异性

用自行设计的特异性检测绵羊源Aichivirus D引物从SWUN/AB18/2019毒株cDNA中扩增出大小为306 bp目的片段，与GenBank中绵羊源Aichivirus D 3D基因的相似性为100%。

2.2 优化的荧光RT-PCR反应体系及条件

优化的20 μL反应体系：TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，模板1.5 μL，F、R引物各0.5 μL，ddH₂O 7.5 μL。反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s, 56 ℃ 30 s，共40个循环；熔解段95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s，反应结束。

2.3 标准曲线及熔解曲线

标准品的浓度为83 ng·μL^-1，换算拷贝数为2.53×10¹⁰copies·μL^-1。本研究建立的方法在标准品浓度为2.53×10³~2.53×10⁸ copies·μL^-1线性关系良好(图 1)，标准曲线为y=-3.553 7x+ 40.65，相关系数R²值为0.999 6，扩增效率为91.2%，PCR产物在86.5 ℃左右均呈现单一波峰，无非特异扩增峰和引物二聚体(图 2)。

2.4 方法的评价

2.4.1 特异性 　　本试验所建立的方法仅对绵羊源Aichivirus D具有良好的扩增曲线，对其他无关病原无扩增曲线。

2.4.2 稳定性 　　本试验所建方法的批内和批间变异系数均小于1%。

2.4.3 敏感性 　　本试验所建方法所能检出的最低拷贝数为25.3 copies·μL^-1。

2.4.4 准确性 　　50份绵羊腹泻粪便样本中KoV的检测结果表明，本试验所建荧光RT-PCR方法的检出率为30%，已有RT-PCR方法的检出率为6%，且荧光RT-PCR方法检出的阳性样本包含RT-PCR方法检出的全部阳性粪便样本。

2.5 绵羊腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D的检出率

本研究所建方法对253份绵羊粪便样本的检测结果见表 1，绵羊源Aichivirus D平均阳性率为8.7%，平均场阳性率66.7%。其中, 腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(17.5%)显著高于非腹泻粪便样本中绵羊源Aichivirus D阳性率(0.75%，P < 0.001)，阳性PCR产物经测序证实均为3D目的基因。

2.6 绵羊源Aichivirus D 3D完整基因的克隆结果

从阿坝、若尔盖和红原共4个绵羊养殖场的绵羊源Aichivirus D阳性粪便样本中成功克隆出大小为1 422 bp的13个完整的3D基因(GenBank登录号: MZ558247~MZ558259)。这13个3D基因间的核苷酸相似性为99.4%~100.0%，与GenBank中国外仅有的1个Aichivirus B OKoV完整的3D基因核苷酸相似性为62.3%~62.9%，与GenBank中前期本研究上传的1个绵羊源Aichivirus D完整3D基因核苷酸相似性为99.4~100.0%，与GenBank中仅有的2个牛源Aichivirus D毒株的3D基因核苷酸相似性为71.0~82.5%。

系统发育分析表明，这13株绵羊源Aichivirus D 3D基因与中国绵羊源Aichivirus D毒株的3D基因共同聚为单独的一个大支(图 3)，并且与牛源Aichivirus D 3D基因遗传关系最近，而与Aichivirus B OKoV毒株3D遗传关系较远，说明本研究的毒株是Aichivirus D的一个新的成员。这14个中国绵羊源Aichivirus D毒株完整3D氨基酸序列与GenBank中仅有的1个国外Aichivirus B OKoV和2个牛源Aichivirus D 3D氨基酸序列相比，8个毒株(GenBank登录号：MZ558247-MZ558251，MZ558256-MZ558258)有2个共同的氨基酸突变在RNA的聚合酶区域。

3 讨论

目前，3D基因为KoV检测方法的主要靶基因^[4-6]，尽管该基因在嵴病毒属成员中较为保守，但同种基因型毒株遗传关系较为密切，具有遗传多样性^[3]。检测OKoV的方法目前只有1篇文献报道^[8]，这种RT-PCR方法能同时检测Aichivirus A、Aichivirus B和Aichivirus C 3个种的毒株核酸，其特异性需要测序验证。该RT-PCR方法的上游引物(23个碱基)扩增位点在国内唯一上传的1个完整绵羊源Aichivirus D 3D基因序列有6个核苷酸突变，在18-19位插入了14个核苷酸，而下游引物(22个碱基)扩增位点有9个核苷酸突变；另外该方法引物在其他Aichivirus A、Aichivirus B和Aichivirus C毒株3D基因上有不同程度的核苷酸突变，这些碱基突变很可能会影响PCR扩增效率。本研究根据绵羊源Aichivirus D流行毒株的3D基因建立了荧光RT-PCR方法，该方法特异性和重复性好，灵敏度高，与国外上述检测KoV的RT-PCR方法相比，大大提高了临床样本中绵羊源Achivirus D的检出率，为绵羊源Achivirus D检测和流行病学调查提供了新的检测方法。

KoV是人和多种动物腹泻的相关病原^{[2-3, 9]}，绵羊源Achivirus D作为绵羊新发病毒，其流行病学资料匮乏。本试验用建立的荧光RT-PCR方法对2020年4月-2021年5月阿坝、若尔盖和红原6个绵羊养殖场的253份绵羊粪便样本进行了检测，结果腹泻粪便样本中绵羊源Achivirus D阳性率(17.5%)显著高于非腹泻粪便样本中绵羊源Achivirus D阳性率(0.75%，P < 0.001)，场阳性率为66.7%，表明了绵羊源Aichivirus D可能是引起以上地区绵羊腹泻的病原。

遗传演化分析表明，已有的14个中国绵羊源Aichivirus D毒株其完整的3D基因共同聚为单独的1个小支，与2个牛源Aichivirus D毒株聚为单独的1个大支，而与国外Aichivirus B OKoV毒株遗传距离相对较远，说明了中国毒株具有独特的进化模式(图 2)，这可能是由环境、地域和自然选择模式等因素造成的^[3]。3D基因编码区包含高度保守的氨基酸基序，作为KoV依赖性RNA的聚合酶，参与调节病毒RNA复制^[8]，该区域氨基酸的突变可能会降低RNA聚合酶的活性^[8]。本研究14个中国绵羊源Aichivirus D毒株完整3D氨基酸序列与GenBank中仅有的1个国外Aichivirus B OKoV和2个牛源Aichivirus D 3D氨基酸序列相比，8个毒株有2个共同的氨基酸突变在RNA的聚合酶区域，这些独特的氨基酸替换是否会影响3D基因的功能需要进一步探讨。

4 结论

成功建立检测绵羊源Aichivirus D的荧光RT-PCR方法，与常见的其他无关病原无交叉反应，批内、批间变异系数均小于1%，最低检出拷贝数为25.3 copies·μL^-1，检出率高于已有的RT-PCR，该方法特异性和稳定性好，灵敏度高，为绵羊源Aichivirus D病原流行病学调查提供了新的检测方法。证明绵羊源Aichivirus D已在青藏高原腹泻绵羊中广泛流行，其3D基因具有独特的进化趋势。