2. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009
, WANG Li1,2, ZHANG Wenhua1,2, XU Mingchang1,2, ZOU Hui1,2, GU Jianhong1,2, LIU Xuezhong1,2, BIAN Jianchun1,2, LIU Zongping1,2, YUAN Yan1,2
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
镉是一种有毒重金属，由于工业活动的增加和日常生活中含镉产品的广泛使用，镉对公共健康构成了严重威胁。长期镉暴露会造成机体多系统和多器官损伤，其中脑是镉毒性作用的重要靶器官之一[1-2]。大量研究表明，镉可通过多种机制诱导神经毒性，包括氧化应激、凋亡和自噬等[3-4]。其中，细胞自噬在镉致神经细胞毒性损伤过程中扮演重要角色。自噬是细胞通过自噬溶酶体途径降解细胞内容物的过程。体内外研究表明，镉可诱导神经细胞自噬发生[4-5]。
Fas是肿瘤坏死因子受体家族的重要一员，通过与其配体结合在镉致神经细胞凋亡过程中起关键作用[6]。但是，Fas在镉致神经细胞自噬中的作用和调控机制尚不清楚。本试验利用RNA干扰技术建立Fas基因沉默大鼠模型，并用镉进行处理，通过透射电镜、Western blot等方法从体内探究Fas在镉暴露致大鼠大脑皮质细胞自噬中的作用及潜在分子机制，为揭示镉的神经毒性机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物21日龄清洁级健康雄性封闭群SD大鼠24只，体重(70±5) g，由江苏大学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂醋酸镉、微管相关蛋白1轻链3(LC3)兔单克隆抗体购自Sigma公司；跨血脑屏障的Fas基因沉默腺相关病毒(Fas shRNA，靶序列：5′-GATC- CGGTGCGTGTCAAGCTTTAATCTTCAAG AG- AGATTAAAGCTTG ACACGCACCTTTTTTA-3′) 和插入非特异性序列的对照病毒(NC shRNA)购自汉恒生物科技有限公司；细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)、p-Erk1/2、自噬相关蛋白7(ATG7)、自噬相关基因(Beclin-1)、β-actin兔单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购自CST公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 主要仪器脱水机购自DIAPATH公司；包埋机购自武汉俊杰电子有限公司；病理切片机、激光共聚焦显微镜购自Leica公司；透射电镜购自Philips公司；5810R型低温高速冷冻离心机购自Eppendorf公司；高速组织研磨器购自天根生化科技有限公司；电泳仪、转膜仪购自BIORAD公司。
1.4 动物分组与处理将24只21日龄的健康雄性SD大鼠于清洁、干燥、室温(23±2)℃的环境下预饲1周后随机分为4组，每组6只，分别为对照组(Control组)、镉组(Cd组)、镉与对照病毒共处理组(Cd+NC shRNA组)、镉与Fas基因沉默病毒共处理组(Cd+Fas shRNA组)。试验期间，对照组大鼠自由饮用纯净水，病毒处理组大鼠于第1天以每只1.4×1011vg的剂量通过尾静脉注射相应病毒，4周后镉染毒组大鼠自由饮用镉水(50 mg·L-1)，持续90 d。试验结束后，用2%戊巴比妥钠按3 mL·kg-1剂量肌肉注射麻醉大鼠，剥离脑组织，一部分固定于4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，一部分分离大脑皮质于冻存管内，于-80 ℃保存待用。
1.5 透射电镜观察自噬体取1 mm3大脑皮质组织块于2.5%戊二醛中4 ℃固定过夜，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，每次15 min；1%锇酸避光室温固定2 h，PBS漂洗3次，每次15 min；经30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇进行梯度脱水，再用100%丙酮于室温下浸透12 min；用树脂包埋组织块，于60 ℃烘箱内放置48 h；切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察大脑皮质自噬体数量。
1.6 Western blot检测相关蛋白的表达取各组大鼠大脑皮质50 mg于预冷的PBS中剪碎，在4 ℃条件下2 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液，匀浆后置于冰上裂解30 min，每隔5 min震荡1次，细胞超声破碎仪超声20 s，在4 ℃条件下12 000 r·min-1离心10 min，收集上清，即为组织总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度并将各组浓度调成一致，按照1∶4加入5 × SDS Loading Buffer，混匀后沸水煮10 min，蛋白保存于-80 ℃。
取等量样品进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜上，5%脱脂乳室温封闭2 h，4 ℃孵育相应一抗(Erk1/2、p-Erk1/2、ATG7、Beclin-1、LC3、β-actin抗体按1∶1 000稀释)过夜，室温孵育二抗(1∶3 000)1 h，ECL显影检测蛋白表达情况。使用Image J软件分析条带灰度值，目的蛋白与β-actin灰度值的比值即为目的蛋白的相对表达水平。
1.7 免疫荧光染色检测LC3表达大脑皮质石蜡切片脱蜡至水后进行抗原修复，PBS洗涤3次；将切片放入3%牛血清白蛋白中，室温封闭30 min，弃去封闭液；4 ℃孵育LC3抗体(1∶100)过夜，PBS洗涤3次；避光室温孵育Cy3标记山羊抗兔荧光二抗(1∶200)1 h，PBS洗涤3次；滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min，PBS洗涤3次；滴加抗荧光淬灭剂，封片，激光共聚焦显微镜观察并拍照。
1.8 数据分析数据采用SPSS 26.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，再经LSD法进行多重比较，统计结果以“平均值±标准差”表示，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 Fas基因沉默对镉致大鼠大脑皮质自噬体形成的影响透射电镜观察大鼠大脑皮质中自噬体数量，结果如图 1所示，与对照组相比，Cd组和Cd+NC shRNA组大脑皮质中自噬体明显增多；与Cd组相比，Cd+Fas shRNA组自噬体减少。
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箭头指示自噬体 The arrows point to autophagosomes 图 1 大鼠大脑皮质中自噬体数量变化 Fig. 1 Changes in the number of autophagosomes in cerebral cortex of rats |
Western blot检测大鼠大脑皮质中Erk1/2和p-Erk1/2蛋白表达水平，结果如图 2所示，与对照组相比，Cd组和Cd+NC shRNA组大脑皮质Erk1/2磷酸化水平极显著升高(P < 0.01)；与Cd组相比，Cd+Fas shRNA组Erk1/2磷酸化水平极显著降低(P < 0.01)。
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与对照组比较，**表示P < 0.01，*表示P < 0.05；与镉组比较，##表示P < 0.01。下同 Compared with control group, ** indicates P < 0.01, * indicates P < 0.05; compared with Cd group, ## indicates P < 0.01. The same as below 图 2 Fas基因沉默对镉致大鼠大脑皮质Erk1/2磷酸化的影响 Fig. 2 Effects of Fas silencing on the phosphorylation of Erk1/2 induced by cadmium in cerebral cortex of rats |
Western blot检测大鼠大脑皮质中Beclin-1和ATG7蛋白表达水平，结果如图 3所示，与对照组相比，Cd组和Cd+NC shRNA组大脑皮质Beclin-1和ATG7表达水平极显著升高(P < 0.01)；与Cd组相比，Cd+Fas shRNA组Beclin-1和ATG7表达水平极显著降低(P < 0.01)。
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图 3 Fas基因沉默对镉致大鼠大脑皮质ATG7和Beclin-1蛋白表达变化的影响 Fig. 3 Effects of Fas silencing on changes of the expression of ATG7 and Beclin-1 induced by cadmium in cerebral cortex of rats |
免疫荧光染色法检测大鼠大脑皮质中LC3蛋白表达水平，结果如图 4所示，与对照组相比，Cd组和Cd+NC shRNA组大脑皮质LC3表达水平增加；与Cd组相比，Cd+Fas shRNA组LC3表达减少。Western blot检测大鼠大脑皮质中LC3蛋白表达水平，结果如图 5所示，与对照组相比，Cd组和Cd+NC shRNA组大脑皮质LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ比值极显著升高(P < 0.01)；与Cd组相比，Cd+Fas shRNA组LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ比值极显著降低(P < 0.01)。
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图 4 大鼠大脑皮质中LC3表达量变化 Fig. 4 Changes of the expression of LC3 in cerebral cortex of rats |
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图 5 Fas基因沉默对镉致大鼠大脑皮质LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ比值变化的影响 Fig. 5 Effects of Fas silencing on the change of LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ ratio induced by cadmium in cerebral cortex of rats |
死亡受体是一类细胞表面受体，属于肿瘤坏死因子受体超家族，在细胞凋亡过程中发挥关键作用。Fas是肿瘤坏死因子受体超家族的重要一员，通过与其配体相互作用调控多种细胞凋亡过程[7-8]。本实验室前期体内外研究发现，镉可通过激活死亡受体Fas诱导大鼠大脑皮质神经细胞凋亡[6, 9]。随着研究的不断深入，科研人员发现，除细胞凋亡外，Fas还参与了细胞自噬过程。Wang等[10]研究发现，Fas通过上调自噬相关蛋白ATG5-ATG12蛋白复合物、ATG7、ATG10、Beclin-1和LC3的表达水平诱导人肝癌细胞自噬发生。De Giorgio等[11]研究发现，抗神经元抗体通过Fas依赖途径激活人神经母细胞瘤细胞自噬。本研究结果显示，镉引起大鼠大脑皮质自噬体数量增多，Fas基因沉默抑制镉引起的自噬体增加。说明Fas参与镉致大鼠大脑皮质细胞自噬。
自噬是细胞内溶酶体降解受损的细胞器、蛋白聚集物及入侵的微生物的过程，主要包括自噬体的形成和成熟、自噬体对底物的识别、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体等过程[12]。细胞自噬的发生与多种自噬基因密切相关，包括Beclin-1、ATG7和LC3等。Beclin-1是首个被确认的参与自噬过程的哺乳动物基因，当细胞受到应激时，Beclin-1及其复合物启动自噬体形成[13]。LC3是自噬体标志蛋白，在自噬体形成过程中，LC3被半胱氨酸蛋白酶ATG4剪切形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ在ATG7和ATG3的催化下与磷脂酰乙醇胺发生作用形成膜结合形式的LC3- Ⅱ，并定位于自噬体膜上[14-15]。因此，Beclin- 1、ATG7和LC3- Ⅱ的表达水平与自噬呈正相关。自噬体的形成受多条信号通路调控，其中丝裂原活化蛋白激酶家族成员Erk1/2是其上游的重要信号分子[16-18]。付程凯等[19]研究发现，Erk1/2通过上调Beclin-1和LC3- Ⅱ表达水平促进蛛网膜下腔出血大鼠海马区神经细胞自噬。本实验室前期研究发现，利用Erk1/2抑制剂可显著抑制镉引起的大鼠大脑皮质神经细胞LC3- Ⅱ的表达水平升高[20]。另外，大量研究表明，Erk1/2的激活受死亡受体Fas调控[21-22]。本研究结果显示，镉暴露导致大鼠大脑皮质Erk1/2磷酸化水平、Beclin-1和ATG7表达水平及LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ比值极显著升高，Fas基因沉默极显著抑制镉激活的Erk1/2及镉引起的Beclin-1、ATG7表达水平和LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ比值升高。说明Fas通过激活Erk1/2参与镉致大鼠大脑皮质自噬体形成。
4 结论镉通过激活Erk1/2诱导大鼠大脑皮质自噬体形成，Fas基因沉默能够抑制镉激活的Erk1/2及镉诱导的自噬体形成，说明镉激活的Fas通过调控Erk1/2参与大鼠大脑皮质自噬体形成；这为揭示镉的神经毒性机制提供了新的理论基础。
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(编辑 范子娟)