2. 农业农村部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测实验站，成都 611130;
3. 四川农业大学国家级动物类实验教学示范中心，成都 611130
, CHEN Rui1, SONG Daili1, ZHANG Luwen1, XIAO Dai1, LI Shiqian1, WEN Yiping1, WU Rui1, ZHAO Qin1, DU Senyan1, YAN Qigui1, WEN Xintian1, CAO Sanjie1,2,3, HUANG Xiaobo1,2,3
2. Sichuan Science-observation Experimental Station of Veterinary Drugs and Veterinary Diagnostic Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Chengdu 611130, China;
3. National Animal Experiments Teaching Demonstration Center, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
丁型冠状病毒(deltacoronavirus)是新发现的冠状病毒科(Coronaviridae)，丁型冠状病毒属(Deltacoronavirus)成员，可以感染哺乳动物和禽类[1]。2009年，Woo等[2]发现3种禽丁型冠状病毒：夜莺冠状病毒HKU11、画眉冠状病毒HKU12和文鸟冠状病毒HKU13。2012年，Woo等[3]在猪和鸟群中鉴定出7种新型丁型冠状病毒，对猪冠状病毒HKU15-44和HKU15-155毒株NSP13、S和N基因序列分析显示其与亚洲豹猫冠状病毒相似性高达99.8%，说明PDCoV在野生小型哺乳动物和猪之间可能存在跨种传播。2014年，美国暴发猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)感染[4]。随后，韩国、加拿大、泰国、越南、日本和中国等国家也报道PDCoV引起的仔猪腹泻性疾病[5-6]。当前，已报道的PDCoV毒株全基因组序列相对保守，序列分析表明，PDCoV可能起源于麻雀丁型冠状病毒(sparrow deltacoronavirus，SpCoV)[7]。此外，美国报道的4种新型SpCoV与PDCoV亲缘关系更为密切，表明PDCoV在猪和禽类之间也可能发生跨种传播[8]。
PDCoV是引起猪肠道疾病的主要病原，可感染各年龄阶段的猪，感染仔猪出现呕吐、腹泻、脱水和死亡等临床症状，影响全球养猪业的健康发展[9]。人工接种PDCoV还可感染牛、鸡和火鸡等多种动物[10-12]。体外试验证实，病毒也可感染猪源细胞(LLC-PK、PK15、ST、IPEC和IPI-2I)、人源细胞(Huh7和Hela)、禽源细胞(LMH和DF-1)、牛源细胞(PBK和PBH)、猴源细胞(Vero-CCL81)和犬源细胞(MDCK)等多种细胞，显示PDCoV具有广泛的跨宿主传播风险[7, 13-14]。
氨基肽酶N(aminopeptidase N，APN)，又称CD13，是一种膜结合的金属蛋白酶，可与冠状病毒S蛋白结合，介导病毒入侵宿主细胞[15]。甲型冠状病毒中，传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猫冠状病毒(feline coronavirus，FCoV)、犬冠状病毒(canine coronavirus，CCoV)和人冠状病毒229E(human coronavirus 229E，HCoV-229E)被鉴定出以APN作为功能受体[16-19]。此外，APN作为冠状病毒受体具有种属特异性。有研究表明，HCoV-229E以hAPN作为受体，而不能以猪APN(porcine APN，pAPN)作为受体[20]。猫APN(feline APN，fAPN)可与TGEV、CCoV、HCoV-229E和FCoV结合[17]。但是，APN在PDCoV入侵宿主细胞的过程中是否发挥受体功能存在争议。Li等[21]构建APN基因敲除细胞证明APN是PDCoV感染多种动物细胞的功能受体，病毒可通过S蛋白的S1B结构域与APN的催化区域发生互作。Wang等[22]也证明，pAPN在PDCoV入侵细胞中发挥受体功能。与之相反，部分研究结果却证明，APN不是PDCoV的受体[23-24]。也有研究显示，APN虽不是PDCoV的关键受体，但其能影响PDCoV的早期感染和增殖过程[25]。另外，Stoian等[26]却认为APN是PDCoV感染细胞的一个非必需细胞受体。
为验证hAPN在PDCoV复制中的作用，本研究首先证实PDCoV可感染HEK293细胞，再进一步构建hAPN基因敲除细胞系和hAPN过表达质粒，验证hAPN在PDCoV复制中的作用。通过同源建模和分子对接模拟PDCoV S蛋白与hAPN蛋白的相互作用，为阐述PDCoV的细胞入侵机制和跨种传播提供新的理论依据。
1 材料与方法 1.1 细胞、病毒和主要试剂HEK293、HEK293T和ST细胞由本实验室冻存；PDCoV四川分离株CHN-SC2015(GenBank收录号：MK355396.1)由本实验室分离、鉴定和保存。pCMV-SPORT6-ANPEP质粒由本实验室构建保存；兔抗ACTB多克隆抗体(AC026)，HRP-羊抗兔IgG(AS014)，HRP-羊抗鼠IgG(AS003)：武汉Abclonal公司；鼠抗ANPEP单克隆抗体(sc-166105)：Santa Cruz公司；兔抗PDCoV N多克隆抗体由本实验室制备保存。
1.2 PDCoV感染HEK293细胞将PDCoV以MOI=0.1接种60 mm培养皿中的HEK293细胞，37 ℃吸附1 h，PBS洗2遍，加维持液继续培养。于0、12、24、36和48 h取样，通过RT-qPCR和Western blot检测PDCoV感染HEK293细胞后的病毒含量；将PDCoV感染HEK293细胞24 h后的细胞培养物冻融3次后，连续传至4代，通过RT-PCR检测PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况，TCID50检测不同代次的病毒滴度。
1.3 hAPN基因敲除细胞系的构建与鉴定参考hAPN基因(NC_000015)序列，利用网络在线工具(http://chopchop.cbu.uib.no/)设计一对sgRNA(表 1)。合成的sgRNA经退火处理，连接到BsmB Ⅰ酶切的线性化载体lenti CRISPR v2，构建同时表达Cas9和sgRNA的慢病毒转移质粒。用Lipofectamine 3000将质粒按重组质粒∶psPAX2∶pMD2.G=5∶3∶2的比例共转染至HEK293T细胞中，48 h后收上清。待T25细胞瓶中HEK293细胞长至50%时，感染慢病毒，36 h后，用含1 μg·mL-1嘌呤霉素(puromycin)的完全培养基进行抗性筛选；有限稀释法挑选hAPN基因敲除细胞系，将其命名为hAPNKO。通过测序、RT-qPCR和Western blot鉴定hAPN在HEK293细胞上的敲除情况。
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表 1 相关引物序列 Table 1 Primer sequences |
按照105·孔-1的细胞数将野生型细胞(hAPNWT) 和敲除细胞(hAPNKO)接种96孔细胞板，24 h后，避光条件下，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育1 h，测定450 nm的吸光度。计算细胞存活率，细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，As：试验孔(hAPNKO细胞孔)；Ac：对照孔(hAPNWT细胞孔)；Ab：空白孔(培养基)。
1.5 敲除hAPN对PDCoV复制的影响待60 mm细胞培养皿中hAPNWT和hAPNKO长满单层后，PBS洗2遍，将PDCoV以MOI=0.1的剂量感染细胞，37 ℃孵育1 h，弃病毒液，每孔加入4 mL维持液，于24 h收集细胞悬液和蛋白，细胞悬液用RT-qPCR检测M基因转录水平；蛋白样品用Western blot检测N蛋白表达水平。
1.6 过表达hAPN对PDCoV复制的影响针对hAPN基因的CDs区设计引物，经PCR扩增后连接到载体pIRES2-EGFP，构建hAPN过表达真核载体(命名为pIRES2-EGFP-hAPN)。待HEK293细胞长至50%时，用Lipofectamine 3000分别转染4 μg质粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN至HEK293细胞；转染24 h后，观察绿色荧光蛋白表达情况；收集细胞和细胞蛋白，分别用RT-qPCR和Western blot检测hAPN表达。以MOI为0.1的PDCoV感染转染pIRES2-EGFP-hAPN的HEK293细胞，同时设转染pIRES2-EGFP空载的HEK293细胞为对照，24 h后，收集细胞悬液和蛋白，细胞悬液通过RT-qPCR检测M基因转录水平；蛋白样品通过Western blot检测N蛋白表达水平。
1.7 同源建模与分子对接hAPN蛋白(PDB ID：4FYQ)、PDCoV S蛋白(PDB ID：6B7 N)和HCoV-229E S(PDB ID：6U7H)的整体结构从蛋白质数据库获取(https://www.rcsb.org)[27]。用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)手动构建PDCoV S蛋白和HCoV-229E S蛋白的单体结构和受体结构域(receptor binding domain，RBD)，用PyMOL对hAPN、PDCoV S和HCoV-229E S蛋白的三维结构进行可视化分析；用MEGA6、ESPrit 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)和PyMOL的align功能对PDCoV和HCoV-229E S蛋白的RBD进行序列和结构比对。用分子对接方法模拟PDCoV S1蛋白与hAPN蛋白的相互作用。
1.8 TCID50测定取100 μL病毒液，按照10倍梯度进行倍比稀释，共稀释7个梯度，每个稀释度设置8个重复，同时设置空白对照。待96孔细胞板中的ST细胞长满单层后，PBS洗2遍，加入100 μL稀释好的病毒液，37 ℃孵育1.5 h，弃病毒液，加入150 sμL含5 μg·mL-1胰酶的维持液，37 ℃继续培养。每日观察细胞病变，连续观察4 d，按照Reed & Muench方法计算TCID50。
1.9 统计学分析数据用“平均数±标准差(x±s)”表示，使用GraphPad Prism 5.0软件统计处理，以T检验比较hAPNWT和hAPNKO两组数据间差异，P < 0.05为有统计学意义。
2 结果 2.1 PDCoV在HEK293细胞中的增殖情况将PDCoV以MOI=0.1感染HEK293细胞，收取0、12、24、36和48 h的样品，RT-qPCR检测病毒含量。结果发现，病毒感染细胞12~36 h时，病毒快速增殖，36 h达到顶峰；36~48 h，出现下降趋势(图 1A)；此外，在0~24 h，病毒N蛋白表达水平也迅速增加(图 1C)。将PDCoV在HEK293细胞上连续传至4代，RT-PCR检测发现当传至第3代时，只能检测到很弱的条带，而传至第4代时，检测不到条带(图 1B)；Western blot检测发现，PDCoV传至2代时，仍可检测到很弱的病毒N蛋白表达水平(图 1D)；TCID50结果表明，PDCoV在HEK293细胞上第1代滴度约为4.36 lg TCID50·mL-1，传至2代时，病毒滴度稍微下降，约为3 lg TCID50·mL-1 (图 1E)，表明PDCoV可感染HEK293细胞，但是不能在HEK293细胞上稳定传代。
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A. RT-qPCR检测PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况；B. RT-PCR检测PDCoV在HEK293细胞上的传代；C. Western blot检测PDCoV感染细胞不同时间点的N蛋白表达水平；D. Western blot检测PDCoV感染HEK293细胞不同代次的N蛋白表达水平；E. TCID50检测PDCoV感染HEK293细胞不同代次的病毒滴度 A. The proliferation of PDCoV on HEK293 cells was identified by RT-qPCR; B. Detection of PDCoV from different passages on HEK293 cells; C. N protein expression in PDCoV infected cells at different time points was detected by Western blot; D. N protein expression level at different passages from PDCoV infected cells was detected by Western blot; E. Virus titer at different passages from PDCoV infected cells was analyzed by TCID50 assay 图 1 PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况 Fig. 1 Propagation of PDCoV on HEK 293 cells |
用CRISPR/Cas9技术构建hAPN基因敲除细胞系，通过测序、RT-qPCR和Western blot检测hAPN在HEK293细胞上的敲除情况。测序结果显示，hAPNKO细胞系在PAM序列前出现明显的重叠峰，且存在23个碱基的连续缺失(图 2A)；RT-qPCR和Western blot结果显示，在hAPNKO细胞上几乎检测不到hAPN基因表达(图 2B、C)，表明hAPN在HEK293细胞上缺失成功。细胞活性检测发现，hAPNKO和hAPNWT的活性无差异(图 2D)，表明敲除hAPN对HEK293细胞活性无影响。
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A. hAPNWT和hAPNKO细胞中hAPN基因的序列测定；B. RT-qPCR检测hAPNKO细胞的hAPN基因mRNA水平(***.P < 0.001)；C. Western blot检测hAPNKO细胞的hAPN蛋白表达水平；D. CCK-8检测hAPNWT和hAPNKO细胞的细胞活性(ns.P>0.05) A. Sequencing of hAPN gene in hAPNWT and hAPNKOcells; B. The relative mRNA level of hAPN gene in hAPNKO cells was confirmed by RT-qPCR(***. P < 0.001); C. The protein expression level of hAPN in hAPNKO cells was confirmed by Western blot; D. Cell viability of hAPNWTand hAPNKO cells was analyzed by CCK-8 (ns. P>0.05) 图 2 hAPN基因敲除细胞系的构建与鉴定 Fig. 2 Construction and identification of hAPN knockout cell lines |
为验证hAPN敲除对PDCoV复制的影响，将PDCoV以MOI=0.1感染hAPNWT和hAPNKO细胞，24 h后，测定M基因转录水平和N蛋白表达水平。结果表明，hAPN基因敲除后，导致M基因mRNA水平下调约75%(图 3 A)，N蛋白表达水平下降约66%(图 3 B)，证实hAPN敲除能够显著抑制PDCoV复制。
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A. RT-qPCR检测敲除hAPN后PDCoV M基因mRNA水平(***. P < 0.001)；B. Western blot检测敲除hAPN后PDCoV N蛋白表达水平 A. The relative mRNA level of PDCoV M gene was confirmed by RT-qPCR (***. P < 0.001); B. PDCoV N protein expression level was confirmed by Western blot 图 3 敲除hAPN降低PDCoV复制 Fig. 3 Knockout of hAPN reduce PDCoV replication |
为进一步验证hPAN过表达对PDCoV复制的影响，构建hAPN真核表达质粒pIRES2-EGFP-hAPN，转染至HEK293细胞中，24 h后，可以观察到明显的绿色荧光(图 4 A)。RT-qPCR和Western blot检测发现，hAPN在HEK293细胞中成功表达(图 4 B、C)。将pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-hAPN分别转染HEK293细胞24 h后，接种PDCoV，病毒感染24 h后，RT-qPCR和Western blot检测表明，过表达hAPN导致M基因mRNA水平上调2.7倍，N蛋白表达水平上调1.7倍(图 4 D、E)，表明过表达hAPN促进PDCoV复制。
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A. 荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达(标尺=100 μm)；B. RT-qPCR检测HEK293细胞转染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN基因mRNA水平(***. P < 0.001)；C. Western blot检测HEK293细胞转染pIRES2-EGFP-hAPN后hAPN蛋白表达水平；D. RT-qPCR检测过表达hAPN后M基因mRNA水平(***. P < 0.001)；E. Western blot检测过表达hAPN后N蛋白表达水平。扫描文章首页OSID码可查看彩图 A. The expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope (Bar=100 μm); B. hAPN gene mRNA level was confirmed by RT-qPCR (***. P < 0.001); C. hAPN protein expression level was confirmed by Western blot; D. The relative mRNA level of PDCoV M gene was confirmed by RT-qPCR (***. P < 0.001); E. PDCoV N protein expression level was confirmed by Western blot. The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article 图 4 过表达hAPN促进PDCoV复制 Fig. 4 Overexpression of hAPN enhance PDCoV replication |
为分析hAPN和PDCoV S蛋白的互作关系，从PDB数据库获取hAPN和PDCoV S的三聚体结构(图 5 A、G)；PDCoV S蛋白的单体结构及其主要结构域包括C-末端结构域(C-terminal domain，CTD)、N-末端结构域(N-terminal domain，NTD)、融合肽(fusion peptide，FP)、七肽重复序列(heptad repeat，HR)(图 5 B)。HCoV-229E和PDCoV S1 RBD，包含6个β-折叠和3个短而不连续的环组成的受体结合基序(receptor binding motifs，RBM)(图 5 C、D)。序列和结构比对发现PDCoV和HCoV-229E S1 RBD具有相似的空间结构，表明PDCoV RBD与hAPN的结合可能类似HCoV-229E RBD和hAPN的结合(图 5 E、F)。分子对接结果表明，PDCoV S1 RBD能够结合hAPN结构域Ⅱ，主要是S1蛋白的RBM1氨基酸残基TYR92、THR51、THR48、PHE16和MET14通过氢键与hAPN的氨基酸残基PHE490、GLN531、ARG528和SER529结合(图 5 G、H)。
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A. PDCoV S蛋白整体结构；B. PDCoV S蛋白单体结构；C. HCoV-229E S1 RBD；D. PDCoV S1 RBD；E. HCoV-229E和PDCoV S1 RBD结构比对；F. HCoV-229E和PDCoV S1 RBD序列比对；G~H. 分子对接模拟PDCoV S1 RBD和hAPN蛋白的互作。扫描文章首页OSID码可查看彩图 A. The overall structure of PDCoV S protein; B. The monomer structure of PDCoV S protein; C. The receptor binding domain of HCoV-229E S1 protein; D. The receptor binding domain of PDCoV S1 protein; E. Structure alignment of HCoV-229E and PDCoV S1 RBD; F. Sequence alignment of PDCoV and HCoV-229E S1 RBD; G-H. Interaction of the PDCoV S protein RBD and hAPN modeled by molecular docking. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page of the article 图 5 hAPN和PDCoV S蛋白的互作分析 Fig. 5 Interaction of hAPN and PDCoV S protein |
PDCoV是近年来新发现的一种猪冠状病毒，人工接种PDCoV能够感染猪、牛、鸡和火鸡等多种动物。PDCoV感染仔猪后引起明显的腹泻症状[28]，而感染小鸡后腹泻症状较轻[12]，接种PDCoV的小牛甚至未出现腹泻和其他临床症状[10]。Lednicky等[29]在儿童血清样品中检测到变异的PDCoV，首次报道了PDCoV可感染人。鉴于PDCoV在猪群的广泛流行和跨宿主传播风险，研究宿主细胞蛋白在PDCoV复制中的作用具有重要意义。过表达hAPN、fAPN、pAPN、cAPN显著增加细胞对PDCoV的易感性[21]。APN在不同肠段中的差异表达与PDCoV肠道组织嗜性也密切相关[30]。本研究发现敲除hAPN降低PDCoV复制，而过表达hAPN促进PDCoV复制，表明hAPN是影响PDCoV复制的重要宿主细胞因子，丰富了PDCoV跨种传播和致病机制理论。
S蛋白是冠状病毒入侵宿主细胞的关键蛋白，在病毒感染宿主细胞的过程中，S蛋白构象的变化能促进病毒囊膜与宿主细胞膜的融合。此外，宿主细胞内的酸性环境和蛋白水解酶对S蛋白的活化也是病毒囊膜与宿主细胞膜融合所必需的[31-32]。胰蛋白酶可通过增强细胞与细胞之间的融合而促进PDCoV增殖，但在病毒入侵细胞的过程中不发挥关键作用[33]。此外，PDCoV通过胰蛋白酶介导的细胞膜表面入侵ST和IPI-2I细胞的效率明显高于内吞体途径[34]。HEK293细胞是由剪切过的5型腺病毒DNA转染的人胚肾细胞形成的细胞系[35]，HEK293 T细胞是能够稳定表达SV40 T抗原的HEK293衍生细胞系。PEDV可以感染HEK293细胞，且与Vero细胞上的增殖特点相似[36]。此外，黄病毒科成员，日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)和黄热病毒(yellow fever virus，YFV)也可感染HEK293T细胞[37]。由于HEK293细胞贴壁能力弱，对胰蛋白酶的耐受程度较弱，本研究在不添加胰蛋白酶的情况下，发现PDCoV可在HEK293细胞至少传至2代，表明PDCoV可不依赖于胰蛋白酶入侵HEK293细胞。
CRISPR/Cas9系统是新发现的一种基因编辑工具，广泛应用于研究宿主因子在病毒复制中的作用[38-39]。近年来，CRISPR/Cas9系统也被应用于筛选调节病毒复制的相关宿主因子[40-41]。关于APN是否为PDCoV入侵宿主细胞的受体存在争议。本研究为验证hAPN在PDCoV毒株CHN-SC2015复制中的作用，通过CRISPR/Cas9技术构建hAPN敲除细胞系，发现hAPN敲除导致PDCoV M基因mRNA水平下调约75%，N蛋白表达水平下降约66%。本研究还通过hAPN过表达验证其对病毒复制的影响，结果发现过表达hAPN可导致PDCoV M基因mRNA水平上调2.7倍，N蛋白表达水平上调1.7倍，证实hAPN可明显促进PDCoV复制。
冠状病毒S蛋白主要由S1和S2结构域组成，其中S1主要负责识别受体，而S2介导宿主细胞膜与病毒囊膜的融合[42]。有研究表明，冠状病毒S1 RBD可以与APN结合，介导病毒入侵宿主细胞。HCoV-229E与hAPN的胞外域Ⅱ结合[19]，而TGEV主要与pAPN的胞外域Ⅳ结合[43]。pAPN结构域Ⅶ(581—967 aa)在PEDV复制中发挥重要作用[44]。在PDCoV研究中，Zhu等[25]发现PDCoV S1-CTD蛋白可结合pAPN。本研究通过序列和结构比对发现PDCoV与HCoV-229E S1 RBD具有相似的空间结构，表明PDCoV可能与hAPN结合。因此，本研究通过分子对接方法模拟PDCoV S1 RBD与hAPN的结合，发现PDCoV S1 RBD能够通过RBM1与hAPN结构域Ⅱ结合。
4 结论PDCoV可以感染HEK293细胞，宿主细胞因子hAPN表达可促进PDCoV复制。此外，PDCoV S1 RBD可通过RBM1氨基酸残基TYR92、THR51、THR48、PHE16和MET14与hAPN蛋白的氨基酸残基PHE490、GLN531、ARG528和SER529结合，证实了hAPN是影响PDCoV复制的一个重要宿主细胞因子。
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(编辑 白永平)