2. 扬州大学 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009
, WANG Lele1,2, WANG Feiyan1,2, LIU Yue1,2, PENG Yuemei1,2, SU Shijie1,2, HOU Zhaofeng1,2, XU Jinjun1,2, TAO Jianping1,2, LIU Dandan1,2
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
鸡球虫病(coccidiosis)是由艾美耳球虫(Eimeria spp.)引起的一种寄生于鸡肠道黏膜内的寄生性原虫病，严重危害养鸡业。其中，毒害艾美耳球虫(E. necatrix)是引起鸡小肠球虫病的主要病原之一。近80年来，鸡球虫病的防治主要依赖化学药物，导致了耐药虫株的出现，降低了抗球虫药物的使用效果，再加上全球消费者对兽药残留肉蛋等公共卫生问题的关注[1-2]，迫切需要寻找新的方法来防控鸡球虫病。卵囊是球虫类寄生虫在宿主间的传播阶段，而囊壁是抵抗外界不良环境、保有卵囊活力的重要屏障。卵囊壁主要由蛋白质组成，是由位于配子体内的成壁体蛋白经酶解加工而成，其中酪氨酸交联、二硫键的形成等氧化还原反应在此过程中发挥重要作用。OXIO(oxioreductase)为具备催化电子转移功能的一系列氧化还原酶的总称。已有报道，在刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)[3]和柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)[4]中鉴定到OXIO，预测其亚型OXIO1参与了CH-OH基团释放氢离子的氧化还原反应，从而参与了卵囊壁的形成，可以通过免疫阻断作用阻断卵囊发育。毒害艾美耳球虫主要危害8~18周龄的鸡[5-6]，由于鸡群饲养方式以及饲养周期的改变，导致临床上毒害艾美耳球虫病多发，并引起严重的小肠球虫病，死亡率可达30%。本研究在课题组前期研究成果的基础上，通过对毒害艾美耳球虫配子体蛋白和卵囊壁蛋白的差异蛋白组学数据分析，获得差异表达的氧化还原酶EnOXIO1编码基因，并对表达产物的抗原性进行分析与定位，同时对其功能进行初步鉴定，旨在为研制新型球虫亚单位疫苗奠定基础。
1 材料与方法 1.1 虫株与实验动物毒害艾美耳球虫扬州株，由扬州大学兽医学院寄生虫学教研室经单卵囊分离建株，定期经无球虫污染的鸡传代保种[7]。BALB/c小鼠购自扬州大学实验动物中心，自由采食和饮水。黄羽鸡购自中国农业科学院家禽研究所育种中心。雏鸡出壳后即运回经严格消毒、无球虫的实验室中饲养，自由采食和饮水。
试验过程中参照扬州大学实验动物福利伦理审查表[编号：202103210(鸡)和202103058(小鼠)]对鸡和小鼠实施安乐死，动物尸体高压灭菌消毒后密封交扬州大学动物尸体处理中心集中处理。
1.2 主要仪器和试剂pGEM-T easy克隆载体购自Promega公司；克隆菌DH5α和表达菌BL21(DE3)、表达载体pET-28a(+)均由扬州大学兽医学院寄生虫教研室保存。TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，TaKaRa RNA LA PCRTM Kit(AMV)Ver.1.1，Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR，T4 DNA Ligase，Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、Not Ⅰ等限制性内切酶等均购自TaKaRa公司；Ni-NTA亲和层析介质购自金斯瑞生物科技公司；QuickAntibody-Mouse3 W小鼠快速免疫佐剂购自Biodragon公司；NanoDrop2000/2000c型超微量核酸蛋白测定仪购自Thermo公司；LEICA RM2235石蜡切片机、DM2500型正置荧光显微镜、超高分辨率激光共聚焦显微镜(TCS SP8 STED)均购自Leica公司。
1.3 毒害艾美耳球虫配子体分离纯化及总RNA提取20日龄无球虫感染黄羽肉鸡，每只经嗉囊接种0.7×104个毒害艾美耳球虫孢子化卵囊，153 h后从鸡盲肠黏膜组织中分离纯化配子体，参照贾传礼等[8]的方法，采用Percoll密度梯度离心法分离纯化配子体，保存于液氮备用。
将纯化的毒害艾美耳球虫配子体，参照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书提取总RNA。
1.4 引物设计及EnOXIO1基因的PCR扩增根据蛋白组学数据分析获得的毒害艾美耳球虫(Houghton株)氧化还原酶(EnOXIO1)基因序列(XM_013578370)，使用Primer 5.0和Oligo 7软件设计特异性引物扩增基因的全长序列，上游引物：5′-ATGCCAGTGCTTCCTCCATTC-3′；下游引物：5′-TTATTGCTCCCCTAGCATCATCTC-3′，预计扩增目的片段大小为2 535 bp。引物由华大基因科技股份有限公司合成。
以配子体RNA为模板，按照TaKaRa RNA LA PCRTM Kit (AMV)试剂盒说明书，RT-PCR法扩增EnOXIO1，第一步反转录，10 μL体系：MgCl2 2 μL，10×RNA PCR Buffer 1 μL，RNase Free ddH2O 4.25 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，Reverse Transcriptase 0.5 μL，Oligo dt-Adaptor Primer 0.5 μL，RNA 0.5 μL；反应条件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。第二步PCR，按照TaKaRa PrimeSTARⓇ Max DNA Polymerase说明书，50 μL PCR反应体系：PrimeSTAR Max Premix (2×) 25 μL，上下游引物(10 mmol·L-1)各2 μL，ddH2O 19 μL，配子体DNA 2 μL；PCR反应条件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，30个循环。PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 EnOXIO1基因的克隆与序列分析PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，经TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit试剂盒纯化回收，参照Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTARⓇ说明书对纯化的PCR产物3′端添加“A”碱基，克隆到pGEM-T easy载体，转化至DH5α，过夜培养，经蓝白斑筛选，随机挑选白斑，过夜培养，提取质粒，选取经EcoR Ⅰ双酶切鉴定为阳性的克隆，送华大基因科技股份有限公司测序。
将获得的EnOXIO1基因序列用在线分析软件SignalP-5.0预测信号肽，EditSeq7.1.0和MegAlign7.1.0进行序列分析，并与GenBank数据库中收录的毒害艾美耳球虫(Houghton株)(EnOXIO1)、柔嫩艾美耳球虫(EtOXIO1)、巨型艾美耳球虫(EmOXIO1)和堆型艾美耳球虫(EaOXIO1)基因进行核苷酸序列比对。
1.6 EnOXIO1基因的表达1.6.1 原核表达质粒的构建 设计特异性引物，上游引物添加保护性碱基和EcoRⅠ酶切位点：5′-TCGGAATTCATGCCAGT GCTTCCTCCATTC-3′，下游引物添加保护性碱基和Not Ⅰ酶切位点：5′-TATGCGGCCGCTTATTGCTCCCCTAGCATCA-TCTC-3′。以测序正确的阳性克隆质粒为模板，PCR扩增(方法同“1.4”第二步PCR)添加了酶切位点的EnOXIO1基因。EcoRⅠ和NotⅠ双酶切PCR产物和原核表达载体pET-28a(+)，取5 μL双酶切PCR产物(约500 ng)，3 μL载体双酶切产物(约150 ng)，1 μL 10×Buffer，1 μL T4 DNA Ligase，16 ℃连接过夜，构建原核表达载体pET-28a(+)-EnOXIO1，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，将经过EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定为阳性的质粒送由华大基因科技股份有限公司测序。
1.6.2 重组蛋白的诱导表达与可溶性分析 将鉴定正确的重组菌E. coli BL21(DE3) pET-28a(+)- EnOXIO1按1%的比例接种于含有卡那霉素(50 μg·mL-1)的LB培养基中，37 ℃ 220 r·min-1振荡培养至菌液浓度OD600 nm值为0.6~0.8，加入0.2 mmol·L-1 IPTG，16 ℃ 160 r·min-1过夜诱导表达；取诱导后重组菌3 mL，PBS洗涤，12 000 r·min-1离心10 min，沉淀悬浮于500 μL PBS中，冰浴超声(功率为30%，超声2 s，间隙3 s)裂解3 min，12 000 r·min-1离心20 min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。同时，设置pET-28a(+)空质粒转化BL21(DE3)表达菌和未转化的BL21(DE3)表达菌作为对照。
1.6.3 重组蛋白的HIS标签单抗鉴定 将诱导表达的阳性重组菌蛋白、pET-28a(+)空质粒转化菌蛋白进行12% SDS-PAGE电泳，并转移到NC膜上。转印结束后参照刘丹丹等[9]方法进行Western blot检测。其中，一抗为6×HIS标签单抗(用封闭液按1∶20 000倍稀释)，二抗为HRP标记的兔抗小鼠IgG(用封闭液按1∶10 000倍稀释)。ECL化学发光显色，天能5200成像系统观察显色结果并拍照保存。
1.6.4 重组蛋白的纯化与复性 取诱导后的重组菌100 mL，离心收集沉淀，经PBS三次洗涤后重悬于15 mL PBS中，冰浴超声(功率为30%，超声2 s，间隙3 s)15 min释放包涵体；4 ℃ 12 000 r·min-1离心20 min，弃上清，将沉淀重悬于8 mL LE Buffer (50 mmol·L-1 Na2HPO4，0.3 mol·L-1 NaCl，8 mol·L-1 Urea，pH9.0)，冰浴超声(功率为30%，超声2 s，间隙3 s)2 min加速包涵体溶解；4 ℃ 12 000 r·min-1离心20 min，将上清移入Ni-NTA亲和纯化层析柱中，4 ℃结合1 h；期间不断摇晃，使目的蛋白与层析柱充分结合。先用Washing Buffer (50 mmol·L-1 Na2HPO4，10 mmol·L-1 Tris·Cl，10 mmol·L-1 Imidazole，8 mol·L-1 Urea，pH9.0)洗涤缓冲液洗涤层析柱，再用Elution Buffer(50 mmol·L-1 Na2HPO4，10 mmol·L-1 Tris·Cl，250 mmol·L-1 Imidazole，8 mol·L-1 Urea，pH9.0) 洗涤缓冲液洗涤层析柱，收集Elution Buffer的洗脱液，分别在含有6、4、2、1 mol·L-1尿素透析液和0.1 mol·L-1 PBS中，4 ℃复性6~8 h，收集目的蛋白，并进行SDS-PAGE，检测蛋白纯化效果。
1.7 抗rEnOXIO1鼠多克隆抗体的制备6周龄BALB/c小鼠，取新鲜制备的纯化复性后的50 μg重组蛋白与QuickAntibody-Mouse3 W小鼠快速免疫佐剂按照体积比1:1，迅速混和均匀，腿部肌肉注射(100 μL·只-1)。两周后，加强免疫一次，第9周，小鼠眼球摘除采血，分离血清，即为抗rEnOXIO1鼠血清。采用间接ELISA法检测抗体效价，分装保存于-20 ℃备用。同时，参照刘丹丹[10]方法，将提取的毒害艾美耳球虫配子体总蛋白转印至NC膜上，以制备的鼠多抗为一抗，Western blot鉴定此多抗的特异性。
1.8 重组蛋白的反应原性和交叉反应原性鉴定参照“1.6.3”的方法，分别以毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清(由扬州大学兽医学院寄生虫学教研室制备保存)为一抗，以HRP标记的绵羊抗鸡IgG为二抗，对重组蛋白的反应原性和交叉反应原性进行Western blot检测。同时，设置pET-28a(+)空质粒转化菌体蛋白作为对照。
1.9 EnOXIO1基因表达产物的免疫荧光定位分别采集感染毒害艾美耳球虫后不同时间段的肠道组织，其中包括感染后136 h的小肠中段、156 h盲肠前段、168和180 h的盲肠中段，制成石蜡切片，经苏木素-伊红染色后，观察不同阶段虫体的生长发育情况。根据观察结果，选取不同时间段的小肠或盲肠组织进行激光共聚焦免疫荧光定位，具体步骤参照曹李琴[11]方法，其中，一抗为制备的鼠抗rEnOXIO1多抗，二抗为FITC标记的羊抗鼠二抗，最后滴加一滴抗荧光淬灭液(含DAPI)封片，超高分辨率激光共聚焦显微镜观察结果并拍照。
2 结果 2.1 目的基因扩增PCR扩增得到的片段大小为2 535 bp左右(图 1)，与预期目的片段大小相一致。
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M. DNA相对分子质量标准；1. EnOXIO1基因扩增产物 M. 1 kb DNA marker; 1. PCR products of EnOXIO1 图 1 EnOXIO1 PCR扩增 Fig. 1 The PCR products of EnOXIO1 |
将所得序列与GenBank中收录的毒害艾美耳球虫(Houghton株)oxidoreductase基因(XM_013578370.1)、柔嫩艾美耳球虫oxidoreductase(XM_013377853.1)、巨型艾美耳球虫oxidoreductase(XM_013481852.1)、堆型艾美耳球虫oxidoreductase(XM_013396120.1)进行核苷酸序列比对，相似性分别为99.61%、96.65%、74.78%、74.98%。氨基酸序列分析显示，EnOXIO1基因共编码844个氨基酸，预测分子质量约为93.51 ku，等电点(PI)为5.917。抗原决定簇在线分析和SignalP-5.0显示，此蛋白共含有34个抗原决定簇，无信号肽。通过对其进行功能预测分析发现，在氨基端和羧基端各有1个GMC (Glucose-Methanol-Choline)结构域，其中，氨基端大小为47个(第158~204位) 氨基酸，羧基端大小为70个(第765~834位)氨基酸；在氨基酸内部有1个FAD/NAD结合域，预测此类结构域与氧化还原反应中氨基酸间二硫键的形成密切相关。
2.3 原核表达载体的构建将目的基因连接至原核表达载体pET-28a(+)，经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切(图 2)和测序分析，目的基因序列2 535 bp成功连接至原核表达载体，并命名为pET-28a(+)-EnOXIO1。
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M. DNA相对分子质量标准；1. EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切产物 M. 1 kb DNA marker; 1. recombinant plasmid digested by EcoR Ⅰ和Not Ⅰ 图 2 重组表达质粒酶切鉴定 Fig. 2 Recombinant plasmid digested by restriction enzyme |
将重组质粒pET-28a(+)-EnOXIO1转化BL21(DE3)大肠杆菌，诱导表达后进行SDS-PAGE分析与纯化。结果显示，重组蛋白大小约为100 ku，主要以包涵体的形式存在(图 3A)，最佳表达条件为IPTG 0.20 mmol·L-1，16 ℃诱导12 h。蛋白的表达量约为0.5 mg·mL-1。
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A. SDS-PAGE；B. Western blot；M. 蛋白质相对分子质量标准；1. BL21 IPTG诱导；2. pET-28a(+)/BL21 IPTG诱导；3. pET-28a(+)-EnOXIO1/BL21未诱导；4. pET-28a(+)-EnOXIO1/BL21 IPTG诱导；5. 重组菌诱导后的超声裂解液沉淀；6. 重组菌诱导后的超声裂解液上清；7. Ni-NTA亲和纯化后的目的蛋白 A. SDS-PAGE; B. Western blot; M. Protein molecular weight marker; 1. BL21 induced by IPTG; 2. pET-28a(+)/BL21 induced by IPTG; 3. pET-28a(+)-EnOXIO1/BL21 uninduced; 4. pET-28a(+)-EnOXIO1/BL21 induced by IPTG; 5. Sediments of bacterial sonicates; 6. Supernatant of bacterial sonicates; 7. Elution protein from Ni-NTA purification 图 3 重组蛋白的SDS-PAGE及HIS标签Western blot鉴定 Fig. 3 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant proteins |
Western blot分析显示，重组蛋白能被抗6×HIS标签单克隆抗体特异性识别(图 3B)，在100 ku左右出现目的条带，而pET-28a(+)质粒转化菌蛋白对照组未见条带，证实EnOXIO1基因成功体外表达。
2.5 抗rEnOXIO1鼠多克隆抗体间接ELISA检测采用间接ELISA方法，将免疫小鼠制备的多克隆抗体倍比稀释，OD450 nm检测抗体效价为1∶102 400 (图 4)。
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图 4 间接ELISA法检测多克隆抗体效价 Fig. 4 Detection of polyclonal antibody titer by indirect ELISA |
Western blot分析显示，鼠抗rEnOXIO1多克隆抗体能够识别天然配子体蛋白(图 5)，且识别条带大小与预期相符，约100 ku。
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M. 蛋白质相对分子质量标准；1. 天然配子体蛋白 M. Prestained protein molecular weight marker; 1. Natural gametocyte proteins 图 5 鼠抗rEnOXIO1多克隆抗体对天然配子体蛋白的识别 Fig. 5 The gametocyte extracts were detected by the mouse anti-rEnOXIO1 antibody |
Western blot分析显示，重组蛋白均与毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫病康鸡复血清发生反应，同时能被小鼠抗重组蛋白多克隆抗体识别，而pET-28a(+)质粒转化菌蛋白未与抗体发生反应(图 6)。
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a. 毒害艾美耳球虫病鸡康复血清；b. 堆型艾美耳球虫病鸡康复血清; c. 柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清；d. 小鼠抗重组蛋白多克隆抗体；M. 蛋白质相对分子质量标准；1. pET-28a(+)-EnOXIO1/BL21 IPTG诱导；2. pET-28a(+)/BL21 IPTG诱导 a. The recovery serum from chickens infected with E. necatrix; b. The recovery serum from chickens infected with E. acervulina; c. The recovery serum from chickens infected with E. tenella; d. Mouse anti-recombinant proteins polyclonal antibody; M. Prestained protein molecular weight marker; 1. pET-28a(+)-EnOXIO1/BL21 induced by IPTG; 2. pET-28a(+)/BL21 induced by IPTG 图 6 重组蛋白抗原性检测 Fig. 6 Antigenicity analysis of the recombinant proteins |
根据石蜡切片的苏木素-伊红染色结果，选取感染后168和180 h盲肠中段组织切片进行激光共聚焦免疫荧光定位试验，结果显示，EnOXIO1蛋白主要分布在配子体内的成壁体上(图 7A~E)，且随着虫体的发育整合到了卵囊壁上(图 7F~J)。
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A~E. 感染后168 h盲肠组织中配子体定位结果；F~J. 感染后180 h盲肠组织中早期卵囊的定位结果；A、F. HE染色；B、G. 明场；C、H. DAPI染色；D、I. 多克隆抗体荧光定位(FITC标记二抗)；E、J. DAPI和FITC叠加。MAG. 大配子体；O. 早期卵囊。切片厚度为6 μm；比例尺为10 μm A-E. Immunofluorescence localization of gametocytes in the caecal tissue at 168 h post infection; F-J. Immunofluorescence localization of the early stage of oocysts in the caecal tissue at 180 h post infection; A, F. HE staining; B, G. Bright field; C, H. DAPI staining; D, I. Immunofluorescence localization with FITC-conjuncted anti-mouse polyclonal antibodies; E, J. merge of DAPI and FITC staining. MAG. Gametocyte; O. Early stage of oocyst. Tissue thickness is 6 μm. Scal-bars represent 10 μm 图 7 EnOXIO1蛋白的免疫荧光定位分析 Fig. 7 Immunofluorescence localization analysis of the EnOXIO1 |
课题组前期对毒害艾美耳球虫成壁体和卵囊壁蛋白的差异蛋白组学分析显示，EnOXIO1在成壁体和卵囊壁中的表达量存在明显差异，其中在成壁体内高表达，在卵囊壁上低表达。为了进一步明确EnOXIO1的功能，本研究通过克隆与测序，成功获取毒害艾美耳球虫扬州株EnOXIO1序列，SDS-PAGE分析显示体外重组表达蛋白大小约为100 ku，理论分子质量大小约为93.51 ku，可能由于空间构象等原因导致电泳条带的大小高于理论值，这与之前其他球虫的配子体蛋白的研究结果相似[12-13]。氨基酸序列分析显示，EnOXIO1基因共编码844个氨基酸，共含有34个抗原决定簇，能被鼠抗6×HIS标签单抗特异性识别，同时能被鼠抗rEnOXIO1多抗、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫病鸡康复血清所识别，表明EnOXIO1能够成功体外诱导表达，且具有较好的反应原性和交叉反应原性。激光共聚焦免疫荧光定位结果证实，EnOXIO1蛋白同时存在于配子体内的成壁体和卵囊壁上。
酪氨酸交联、二硫键的形成等氧化还原反应在球虫卵囊壁形成过程中发挥重要作用[14-16]。通过对毒害艾美耳球虫EnOXIO1蛋白编码氨基酸进行功能预测分析发现，在其氨基酸两端各有1个GMC(Glucose-Methanol-Choline)结构域，其中，氨基端大小为47个(第158~204位)氨基酸，羧基端大小为70个(第765~834位)氨基酸，且高度保守；在氨基酸内部有1个FAD/NAD结合域，该区域涵盖了氨基和羧基端2个GMC结构域[3, 17-18]。而本文获得的EnOXIO1基因编码一种氧化还原酶蛋白，预测GMC结构域作为与FAD结构域结合的辅助因子，与氧化还原反应中H2O2的产生密切相关，而FAD/NAD结合域可以激活FAD/NAD(P)H作为供氢体的氧化还原反应，同时也可以激活二硫化物还原酶的活性[19-21]。此研究结果提示，EnOXIO1蛋白可能通过某种氧化还原机制参与了二硫键的形成，进而参与了卵囊壁的形成。
卵囊壁是由配子体内的前体蛋白经过一系列蛋白酶的水解加工形成[22-23]。作者通过免疫荧光定位试验证实EnOXIO1蛋白同时存在于配子体和卵囊壁上，进一步说明EnOXIO1蛋白确实通过某些机制参与了卵囊壁的形成，但具体机制有待进一步研究。EnOXIO1蛋白在配子体和卵囊壁上的表达量是否有差异，还需通过荧光定量PCR进一步分析。
综上可知，EnOXIO1蛋白作为一种主要存在于配子体内的氧化还原酶，其可能在氨基酸交联和二硫键形成中发挥关键性作用后参与了卵囊壁的形成，但体外重组表达的EnOXIO1蛋白对球虫卵囊壁形成的阻断作用和对鸡群的免疫保护效果有待进一步研究。
4 结论本研究克隆和表达了毒害艾美耳球虫EnOXIO1蛋白，并将其定位于配子体和卵囊壁上，为进一步解析其参与卵囊壁形成的分子机制奠定了基础，为研制新型免疫阻断型球虫亚单位疫苗提供重要靶抗原。
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(编辑 白永平)