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引用本文
李亚军, 茹毅, 郝荣增, 蒋成辉, 王伟, 张越, 张贵才, 刘华南, 卢炳州, 杨洋, 陶世宇, 杨锐, 宋向东, 陈娇, 余四九, 郑海学. CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及免疫原性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2022, 53(12): 4315-4324.  
LI Yajun, RU Yi, HAO Rongzeng, JIANG Chenghui, WANG Wei, ZHANG Yue, ZHANG Guicai, LIU Huanan, LU Bingzhou, YANG Yang, TAO Shiyu, YANG Rui, SONG Xiangdong, CHEN Jiao, YU Sijiu, ZHENG Haixue. Expression of Bovine Viral Diarrhea Virus E2 Protein in CHO Cells and Immunogenicity Analysis[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2022, 53(12): 4315-4324.  
CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及免疫原性分析
李亚军1,2, 茹毅2, 郝荣增2, 蒋成辉2, 王伟2, 张越2, 张贵才2, 刘华南2, 卢炳州2, 杨洋2, 陶世宇2, 杨锐2, 宋向东2, 陈娇2, 余四九1, 郑海学2     
1. 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070;
2. 中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室/国家口蹄疫参考实验室，兰州 730046
收稿日期：2022-03-10
基金项目：甘肃省科学技术厅-科技重大专项计划(21ZD3 NA001)；中国农业科学院兰州兽医研究所基本科研业务费(1610312021013)
作者简介：李亚军(1989-)，男，甘肃秦安人，博士生，主要从事动物新型疫苗研发，E-mail: liyajun073@163.com.
通信作者：余四九，主要从事兽医产科学研究，E-mail: sjyu@163.com; 郑海学，主要从事动物传染病学与流行病学研究，E-mail: zhenghaixue@caas.cn.
摘要：旨在利用悬浮培养CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)E2蛋白，并鉴定纯化E2蛋白的免疫原性。本研究以BVDV-1 NADL株基因序列为基础，构建BVDV E2蛋白的重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2，转染经悬浮培养的CHO细胞进行分泌表达，收集细胞培养上清，进行亲和层析法纯化，SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达和纯化，Western blot鉴定与His抗体和BVDV阳性血清反应性，利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔，用细胞间接免疫荧光(IFA)和ELISA鉴定E2蛋白的反应活性。纯化E2蛋白经BCA蛋白定量试剂盒检测后表达量高达1.228 mg·mL-1；Western blot结果显示，利用His抗体和BVDV阳性血清均可检测到目的蛋白的特异性条带；新西兰大白兔一免后第7天利用间接ELISA可检测到血清抗体阳性，并持续至免疫后第28天，血清抗体效价水平达到1∶1 024 000；IFA试验结果显示，该血清抗体可检测到BVDV感染MDBK细胞中E2蛋白的表达，进一步证实纯化的E2蛋白具有良好的免疫原性和特异性。本研究成功利用CHO悬浮培养真核表达系统制备了纯化的BVDV E2蛋白，该蛋白具有良好的免疫原性，为BVDV的诊断方法及其新型亚单位疫苗研制奠定了基础。
关键词：牛病毒性腹泻病毒    E2蛋白    真核表达    CHO悬浮培养    免疫原性    
Expression of Bovine Viral Diarrhea Virus E2 Protein in CHO Cells and Immunogenicity Analysis
LI Yajun1,2, RU Yi2, HAO Rongzeng2, JIANG Chenghui2, WANG Wei2, ZHANG Yue2, ZHANG Guicai2, LIU Huanan2, LU Bingzhou2, YANG Yang2, TAO Shiyu2, YANG Rui2, SONG Xiangdong2, CHEN Jiao2, YU Sijiu1, ZHENG Haixue2     
1. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/National Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, 730046, China
Corresponding author: YU Sijiu, E-mail: sjyu@163.com; ZHENG Haixue, E-mail: zhenghaixue@caas.cn.
Abstract: This experiment was conducted to produce E2 protein of bovine viral diarrhea virus (BVDV) by using suspension cultured CHO cell expression system, and to identify the immunogenicity of purified E2 protein. In this study, the recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-BVDV-E2 was constructed based on the gene sequence of BVDV-1 NADL strain. The recombinant plasmid pcDNA3.1-BVDV-E2 was transfected into CHO cells in suspension culture, and the E2 protein was secreted and expressed in cells supernatant. The expression and purification of the E2 protein was determined by SDS-PAGE electrophoresis, and the reactivity was determined with anti-His antibody and BVDV positive serum by Western blot. Analysis of immunogenicity was determined after immunizing New Zealand white rabbits with E2 protein, and the antibodies of the E2 protein were tested by indirect ELISA and indirect immunofluorescence (IFA). The concentration of purified E2 protein was 1.228 mg·mL－1 by BCA protein quantification kit. Western blot results showed that specific bands of the E2 protein could be detected with His antibody and BVDV positive serum. Serum antibody could be detected by indirect ELISA in the 7th day after prime immunization, and serum antibody was maintained at a high level until the 28th day after immunization. The antibody titer was up to 1:1 024 000. The result of IFA indicated that the expression of the E2 protein could be detected by the immunized rabbit serum in BVDV-infected MDBK cells. These results demonstrated that the purified E2 protein with good immunogenicity and specificity. In this study, BVDV E2 protein was produced using CHO suspension culture system successfully, which has a superior immunogenicity. This result will lay the foundation for the development of diagnosis method and novel subunit vaccine of BVDV.
Key words: bovine viral diarrhea virus    E2 protein    eukaryotic expression    CHO suspension culture    immunogenicity    

牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的以腹泻、繁殖障碍、免疫机能障碍等为主要特征的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]，该病发病率高，死亡率低[2]，防治的难点在于BVDV进入机体后可造成免疫抑制和持续性感染，降低机体免疫力，易诱发其他病原的混合感染或继发感染，是全球最重要的牛传染病之一[3]。该病在我国20多个省、市及自治区广泛流行且呈扩大趋势[4]，导致我国的BVDV防控和净化状况不容乐观。

BVDV属于黄病毒科(Flaviviridea)瘟病毒属(Pestivirus)，基因组由一个长度约12.3 kb的单链正义RNA分子组成[5]。BVDV有3种生物型，通常基于5′-UTR序列、基因组氨基端自身蛋白酶(Npro)或包膜糖蛋白(E2)区域分为BVDV-1型和BVDV-2型[6]，第3种遗传物种BVDV-3型被描述为非典型的BVDV。目前，中国主要流行8个亚型：1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p和1q[7]。BVDV基因组含有4个结构蛋白，分别是P14(C)、gP48(E0)、gP25(E1)、gP53(E2)，其他的均为非结构蛋白[5, 8]。其中，E0、E1、E2组成了病毒的囊膜结构，位于病毒的表面，而E2蛋白位于病毒的外表面，也是构成病毒的主要免疫保护性抗原，可诱导机体产生保护性的中和抗体[9]。动物机体在感染BVDV或者接种灭活疫苗后，体内主要产生针对结构蛋白E2的抗体[10]，对于病原的检测应用，由E2蛋白产生的多克隆抗体可以快速检测BVDV的变异[11]。E2蛋白包括1个疏水序列和5个糖基化位点[12]，但由于E2蛋白的基因突变率高，不同的毒株之间的免疫原性不同，容易导致疫苗免疫失败[13]。

有报道显示，E2蛋白在细胞周期的维持中扮演着重要角色，它主要参与病毒和宿主的吸附、识别以及结合过程，还参与病毒的免疫逃逸[14]。吴桐忠等[15]构建了表达E2蛋白的重组乳酸菌，结果表明，口服表达BVDV E2蛋白的重组乳酸菌可诱导机体产生特异性的体液免疫反应；何金科等[16]完成了E2蛋白多表位疫苗的筛选以及生物信息学验证等，为多表位疫苗的设计提供了一种新的方法；张忠辉等[17]利用原核表达系统表达制备E2蛋白，并免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体；吴立君等[18]利用昆虫表达系统表达E2蛋白，为诊断试剂盒的研制和亚单位疫苗的制备奠定了基础。以上研究表明，BVDV E2蛋白已成为BVD基因工程疫苗和诊断试剂开发研制的重要靶标蛋白，而利用不同表达系统制备的E2蛋白免疫动物后，可诱导机体产生不同程度的细胞免疫或体液免疫应答，因此，E2蛋白成为BVDV DNA疫苗和亚单位疫苗开发的首选抗原蛋白[19]。

目前，控制BVDV的传播主要有两种方法：消灭持续感染动物和疫苗接种。改良活疫苗或灭活疫苗主要用于BVDV疫苗接种计划，但这些疫苗分别存在安全风险或免疫保护不足等问题[20]。灭活疫苗对怀孕牛安全，但其免疫期短；而弱毒疫苗虽免疫期长，但对怀孕牛存在安全风险[21]。基于以上科学问题，本研究以研制BVD亚单位疫苗为目标，成功利用哺乳动物细胞表达系统制备了BVDV结构蛋白E2，实现了该蛋白在哺乳动物表达系统CHO细胞中高水平瞬时表达，通过免疫动物评价其免疫原性，为BVDV的基因工程亚单位疫苗的研发奠定良好的基础。

1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂

1.1.1 实验动物 　　新西兰大白兔由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂和仪器 　　BVDV-1 NADL疫苗标准株(BVDV-1型毒株，购自中国兽医药品监察所-中国兽医微生物菌种保藏管理中心)、真核表达载体pcDNA3.1(+)、BVDV阳性血清由本实验室保存。ExpiCHO悬浮细胞表达系统、亲和层析Ni柱购自GE公司。XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶购自New England Biolabs(NEB)公司。

主要仪器：PCR扩增仪(Thermo)、台式超速冷冻离心机(Thermo)、紫外凝胶成像仪(GE)、纯化仪(AKTA PURE 150)、激光共聚焦显微镜(莱卡公司)。

1.2 蛋白生物信息学分析和表达设计

利用SignalP 4.1 Server和TMHMM Server v.2.0网站软件分析BVDV结构蛋白E2信号肽及跨膜区域。根据分析结果，设计E2蛋白的重组真核表达质粒。

1.3 重组表达质粒的构建与鉴定

参考BVDV-1 NADL疫苗标准株基因序列，设计扩增目的基因引物(如表 1所示)，利用病毒RNA提取试剂盒常规提取RNA，以提取的RNA为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒扩增E2蛋白的基因片段，扩增程序: 50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ (1 min·kb－1)，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，纯化回收DNA。pcDNA3.1载体和回收的基因片段用限制性内切酶XhoⅠ和HindⅢ双酶切，切胶回收纯化，使用T4 DNA连接酶连接，程序为16 ℃ 12 h，连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落增菌培养，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，重组质粒命名为pcDNA3.1-BVDV-E2。

表 1 引物信息 Table 1 Primer information

用XhoⅠ和HindⅢ对重组质粒进行双酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒均送生物公司进行测序鉴定，确定目的基因序列的正确插入，确保阅读框完全正确。

1.4 蛋白的表达与纯化

参照ExpiCHO表达系统试剂盒说明书方法，将重组质粒pcDNA3.1-BVDV-E2转染ExpiCHO悬浮细胞，转染的细胞置32 ℃、5% CO2、湿度90%条件下继续悬浮培养12 d，然后4 000 g离心10 min，经0.22 μm滤膜过滤后进行亲和层析Ni柱纯化。取纯化后的目标蛋白质进行SDS-PAGE鉴定，并使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。

1.5 蛋白印迹试验

将纯化后的蛋白经质量分数为12% SDS-PAGE电泳分离，通过半干式电转膜法将蛋白抗原转至硝酸纤维素薄膜上，分别使用抗小鼠His Tag单克隆抗体、BVDV阳性血清或BVDV-E2免疫血清为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG为二抗，对纯化的BVDV-E2蛋白或BVDV感染细胞内的病毒蛋白进行Western blot分析，用ECL化学发光显色后，高分辨率凝胶成像系统观察并拍照。

1.6 免疫荧光(IFA)试验

按照试验要求设置对照组和试验组；在激光共聚焦细胞培养皿中培养MDBK细胞，接种病毒感染后48 h将细胞用PBS进行洗涤；用4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗涤3次，每次5 min，分别加入1 mL用一抗稀释液按1∶100稀释的免疫血清，4 ℃，孵育12 h；1×PBS洗涤3次，每次5 min，分别加入500 μL用1×PBS按1∶1 000稀释的488标记的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；1×PBS洗涤3次，每次5 min，用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞内荧光并拍照分析。

1.7 动物免疫与抗体检测

选取健康新西兰大白兔6只，分为2组，每组3只，A组免疫纯化的E2蛋白，B组为PBS对照组，首次免疫用300 μg·只-1的纯化蛋白和等体积的弗式完全佐剂乳化，背部多点注射免疫兔；首次免疫第14天，按照300 μg·只-1的纯化蛋白和等体积的弗式不完全佐剂乳化，背部多点注射进行二免，分别采集首免后第0、7、14、21、28天取全血，分离血清用于抗体检测。

采用间接ELISA对E2蛋白免疫兔血清进行检测，分析其免疫原性。用50 mmol·L-1碳酸盐缓冲液将纯化的BVDV-E2蛋白(50 ng·孔-1)包被于ELISA酶标板中，4 ℃孵育过夜。用1%牛血清白蛋白(BSA)37 ℃，封闭2 h。将待检血清用血清稀释液按1∶2 000稀释并加入反应孔中，100 μL·孔-1，每个样品设3个复孔，37 ℃孵育1 h。HRP标记的山羊抗兔IgG抗体用血清稀释液按1∶5 000稀释后加入反应孔中，100 μL·孔-1，37 ℃孵育1 h。TMB显色，每孔50 μL，显色10 min后，加入50 μL终止液终止反应，读取OD450 nm值。

2 结果 2.1 E2蛋白分析与表达设计

软件分析结果显示，SignalP 4.1 Serve软件分析显示E2蛋白不存在信号肽(图 1A)；TMHMM Server v.2.0软件分析显示E2蛋白有一个跨膜区(第344—366位氨基酸)(图 1B)。本研究根据分析结果，删除E2蛋白跨膜区，在目标蛋白氨基端插入信号肽序列、羧基端为His-Tag，依次串联组成蛋白表达阅读框(图 1C)。

A.E2蛋白信号肽分析结果；B.E2蛋白跨膜区分析结果；C.BVDV-E2蛋白表达质粒示意图 A. Result of E2 protein signal peptide sequence analysis; B. Result of E2 protein transmembrane region analysis; C. Diagram of expression plasmid of BVDV-E2 protein 图 1 BVDV-E2蛋白分析与表达设计 Fig. 1 Analysis and expression design of BVDV-E2
2.2 E2重组表达质粒的鉴定

RT-PCR扩增结果经核酸凝胶电泳鉴定显示，基因扩增片段大小约为1 330 bp，与预期的目的条带大小相符(图 2A)。构建的重组表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2经XhoⅠ和HindⅢ双酶切后产生大小约5 109和1 358 bp的2条特异性条带，酶切产物大小与理论值相符，表明扩增的E2片段正确与载体连接，而基因测序结果也显示目的片段成功插入表达载体中(图 2B)。

A.RT-PCR扩增基因片段鉴定(M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.E2基因片段)；B.重组表达质粒双酶切鉴定(M. DL10000 DNA相对分子质量标准；1.未酶切E2表达质粒；2.E2表达质粒的酶切产物) A. Identification of gene fragments amplified by RT-PCR(M. DL2000 DNA marker; 1. E2 gene fragment); B. Identification of recombinant expression plasmid by double enzyme digestion (M. DL10000 DNA marker; 1. Undigested E2 expression product; 2.Digested E2 expression product) 图 2 重组表达质粒的鉴定 Fig. 2 Identification of recombinant expression plasmid
2.3 E2蛋白的表达与纯化

转染pcDNA3.1-BVDV-E2质粒的细胞培养上清在56 ku左右(图中箭头所示)位置处观察到特异性蛋白条带，蛋白大小与理论值相符(图 3A)。对BVDV-E2蛋白进行纯化，洗脱样品在56 ku左右位置处观察到特异性蛋白条带，BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后E2蛋白的质量浓度为1.228 mg·mL－1 (图 3B)。

A.E2蛋白表达的SDS-PAGE分析(M.蛋白质分子质量标准；1.空白对照；2.空载体对照；3.转染pcDNA3.1-BVDV-E2)；B.纯化后E2蛋白SDS-PAGE分析(M.蛋白质分子质量标准；1.过滤后细胞上清；2.流穿样品；3.洗脱样) A. SDS-PAGE analysis of the expression of E2 protein (M. Protein marker; 1. Blank control; 2. Empty plasmid control; 3. Transfected pcDNA3.1-BVDV-E2); B. SDS-PAGE analysis of E2 protein after purification (M. Protein marker; 1. Cell supernatant after filtration; 2. Flow through sample; 3. Elution sample) 图 3 重组蛋白的表达与纯化 Fig. 3 Expression and purification of recombinant protein
2.4 重组蛋白的鉴定

纯化后BVDV-E2蛋白能够与His-Tag标签抗体(图 4A)和BVDV阳性血清(图 4B)发生反应，都约在56 ku位置处显示一条特异性条带。

A.一抗为His-Tag单克隆抗体(M.预染的蛋白质分子质量标准；1.BVDV-E2)；B.一抗为BVDV多克隆抗体(M.预染的蛋白质分子质量标准；1.BVDV-E2)；C.E2蛋白免疫血清检测BVDV感染MDBK细胞的免疫印迹分析(M.预染的蛋白质分子质量标准；1.未感染细胞对照；2.BVDV感染MDBK细胞) A. Western blot identification with His Tag monoclonal antibody (M. Protein marker; 1. BVDV-E2); B. Western blot identification with BVDV polyclonal antibody (M. Protein marker; 1. BVDV-E2); C. Analysis of E2 protein expression in MDBK cells after BVDV infection by Western blot (M. Protein marker; 1. Uninfected cell control; 2. BVDV infected MDBK cells) 图 4 纯化后E2蛋白的免疫印迹分析 Fig. 4 Analysis of E2 protein after purification by Western blot

将BVDV感染MDBK细胞24 h，利用BVDV-E2免疫兔血清检测细胞内的病毒蛋白表达，结果显示约在56 ku位置处显示一条特异性蛋白条带(图 4C)，表明该E2蛋白免疫血清可以特异性地与BVDV感染细胞内的E2蛋白反应。

2.5 细胞免疫荧光(IFA)试验

IFA鉴定结果显示(图 5)，BVDV感染MDBK细胞后，免疫血清可以特异性检测到细胞内的病毒蛋白表达，而对照组未检测到荧光；结果表明，本研究制备的E2蛋白免疫血清具有良好的免疫反应性和特异性。

图 5 IFA鉴定结果 Fig. 5 Identification of immunized serum by IFA
2.6 血清抗体水平

间接ELISA结果显示(图 6)，免疫后7 d，即可检测到针对E2蛋白的血清抗体，二免7 d后抗体水平显著升高，在免疫后28 d抗体保持较高水平且血清效价可达1∶1 024 000。结果证明了CHO细胞表达的E2蛋白具有良好的免疫原性。

NC. PBS免疫组；E2. BVDV-E2蛋白免疫组 NC. The group of immunized by PBS; E2. The group of immunized by purified E2 protein 图 6 间接ELISA分析血清抗体 Fig. 6 Analysis of serum antibodies by indirect ELISA
3 讨论

近年来，关于BVD基因工程疫苗研究在不断地进行，但仍无商品的亚单位疫苗可用[22]。E2蛋白作为BVDV囊膜上的重要结构蛋白，拥有突出囊膜表面的氨基端部分，决定了BVDV的抗原性[23]，其免疫原性最好，是亚单位疫苗研究的主要抗原蛋白[24-25]。

目前，在国内关于BVDV E2蛋白表达的相关研究中，大多数采用原核表达系统进行表达[10, 17, 26]，也有报道利用烟草等真核表达系统表达E2蛋白[18, 27]。BVDV E2蛋白为囊膜糖蛋白，含有多个糖基化位点，其翻译后修饰较为复杂，利用原核表达系统表达此类抗原蛋白存在一定的难度，且原核表达的产物抗原性一般较弱，并且大多数情况表达产物以不可溶形式存在，蛋白结构和翻译后修饰与真核表达存在较大差异[28]。通过真核表达系统表达的目的蛋白具有天然蛋白的构象和活性，与昆虫细胞杆状病毒表达系统相比，CHO细胞表达系统表达产量相对比较高，很少分泌自身内源性蛋白，利于外源产物的分离纯化；与细菌表达系统相比，CHO细胞表达系统可对蛋白进行翻译后加工，可胞外分泌表达，下游纯化工艺简单；与酵母表达系统相比，CHO细胞表达系统产物的免疫原性等生物活性与天然蛋白更相似，能够有效减少非特异性结合[29]。随着无血清悬浮培养技术、基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展，CHO细胞表达系统产物表达量得到大幅提升，生产成本不断降低，在兽用产品领域的应用也显现出良好前景[30]。本研究为了获得免疫原性良好的BVDV抗原蛋白，使用CHO悬浮细胞对目标抗原进行分泌表达，并通过亲和层析法进行纯化，通过一步亲和纯化即可获得较高纯度的抗原蛋白，并且蛋白表达量显著高于其他报道水平；为CHO细胞表达系统在兽用生物制品领域的应用提供了新的范例。

4 结论

本研究首次成功利用CHO细胞表达细胞制备了BVDV E2蛋白，鉴定结果显示，E2蛋白与BVDV阳性血清和His标签抗体有良好的反应性，同时免疫结果显示，制备的E2蛋白可诱导免疫动物产生强烈的体液免疫反应，免疫后第28天抗体水平仍保持较高水平；此外，利用动物免疫血清可特异性检测感染细胞内的病毒蛋白表达。本研究结果为BVD新型亚单位疫苗研制奠定了基础。

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(编辑   白永平)

CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及免疫原性分析
李亚军, 茹毅, 郝荣增, 蒋成辉, 王伟, 张越, 张贵才, 刘华南, 卢炳州, 杨洋, 陶世宇, 杨锐, 宋向东, 陈娇, 余四九, 郑海学