2. 山西农业大学动物科技学院，太谷 030801
2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
血吸虫病是仅次于疟疾的全球第二大寄生虫病，广泛分布于亚热带与热带的76个国家和地区，对人畜健康造成严重危害[1-2]。血吸虫虫体呈线形，雌雄异体，在感染过程中，虫体不会对宿主造成明显的病理损害，而成熟雌虫所产虫卵不仅造成宿主严重病理损害，还引起疾病的再传播。在全球广泛流行的三种感染人类的血吸虫中(日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫)，日本血吸虫(Schistosoma japonicum)产卵量最大[3]。日本血吸虫所产虫卵主要沉积于肝与肠道[4]，沉积于肝的虫卵分泌的可溶性虫卵抗原(soluble egg antigens，SEA)刺激宿主免疫系统，导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积，进而引发肉芽肿和继发性肝纤维化等病理变化[5]。日本血吸虫病肝纤维化若治疗不当或不及时可发展为慢性血吸虫病。日本血吸虫病晚期患者即使进行了彻底的杀虫治疗，宿主体内未成熟虫卵仍可继续发育，导致虫卵肉芽肿反应持续进行[6]。尽管已去除诱因，但当肝纤维化发展到一定程度时，病症往往不可逆转，而当发展为肝硬化、肝细胞癌时，患者将出现肝脾肿大、门脉高压等症状，最终可因上消化道出血等严重并发症致死[6-7]。
高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是高迁移率族蛋白家族成员，广泛分布于哺乳动物组织中，参与众多生物学功能，例如DNA复制、转录、修复以及细胞增殖、分化、运动等[8]。当肝细胞受损时，HMGB1可作为一种炎性因子，由损伤坏死的肝细胞被动释放，通过与糖基化晚期终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和Toll样受体结合，进一步诱导机体炎症反应[8]。近年来研究表明，HMGB1与各类纤维化疾病也密切相关，如肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化以及心肌纤维化等[9]。此外，在曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)病肝纤维化患者的血清和肝中均可检测到高水平HMGB1表达，证实HMGB1参与血吸虫致肝疾病[10]。然而，HMGB1在日本血吸虫病肝纤维化的致病过程中扮演何种角色却鲜有研究。
日本血吸虫虫卵分泌物引起的免疫反应是导致宿主肝病变的主要原因[11]。本研究构建了日本血吸虫肝病模型，并在虫卵发育早期给予小鼠甘草甜素(glycyrrhizin，GL，HMGB1抑制剂)，观察GL能否通过抑制HMGB1对血吸虫虫卵导致的宿主肝病变起保护作用，初步探究了HMGB1与宿主肝炎症和纤维化的相关性，为进一步阐明日本血吸虫病肝纤维化的致病机理奠定基础，同时也为慢性日本血吸虫病治疗药物靶点的选择提供重要参考。
1 材料与方法 1.1 虫株和实验动物SPF级雄性BALB/c小鼠25只，6周龄，购自上海杰思捷实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2018-0004]。每天12 h光照，12 h黑暗循环，饲养过程中给予全价饲料，自由饮水。中国大陆株日本血吸虫尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所血吸虫课题组钉螺室提供。本试验通过了中国农业科学院上海兽医研究所实验动物福利与伦理管理委员会审查(SV-20210709-02)。
1.2 主要试剂与仪器HMGB1抑制剂甘草甜素(glycyrrhizin，GL)，羧甲基纤维素钠(中国Abmole)；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix，Hifair II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit，Masson染色试剂盒(上海翊圣生物科技)；TRIzol(北京天根生化科技)；血细胞分析仪(深圳迈瑞BC5300)；全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技)；NanoDrop 2000核酸测定仪(美国Thermo)；Abi 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABi)；光学显微镜(日本尼康Eclipse80)。
1.3 动物模型构建及分组将25只BALB/c小鼠随机分为空白对照组(n＝10)，感染后4周组、6周组和HMGB1抑制剂组(n＝5)。小鼠腹部去毛，在解剖镜下计数日本血吸虫尾蚴，除空白对照组外，其余各组小鼠通过腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴，每只小鼠感染(20±2)条尾蚴[12]。将GL溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，配制成6.25 mg·mL－1的溶液，HMGB1抑制剂组每只小鼠自感染后24 d起连续4 d灌胃0.2 mL GL溶液(即每只小鼠50 mg·kg－1)，4周空白对照组与感染组则连续4 d灌胃等体积生理盐水。尾蚴感染4、6周后，分别对各组小鼠进行眼眶静脉采血，采集肝右叶置于4%多聚甲醛固定，用于病理切片制作，采集肝左叶置于液氮速冻后－80 ℃保存，用于提取肝组织总RNA。
1.4 血常规及血清生化检测用含180 μL稀释液的1.5 mL离心管收集100 μL血液，吹打混匀，室温放置2 min后用血细胞分析仪检测白细胞(white blood cell，WBC)、嗜中性粒细胞(neutrophils，Neu)、单核细胞(monocytes，Mon)和嗜酸性粒细胞(eosinophil，Eos)。剩余全血于4 ℃静置30 min，400×g离心15 min，收集上层血清用全自动生化分析仪检测AST和ALT。
1.5 肝组织病理学检查将采集的肝样品，置于4%多聚甲醛中溶液中，固定48 h后取出，流水冲洗12 h；进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明及浸蜡后包埋于石蜡中；常规切片，采用苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片后镜检。用Image J软件测量每张切片中由单个虫卵形成的虫卵肉芽肿面积，并计算每张切片中的所有虫卵肉芽肿的总面积与每张肝切片面积的比值。此外，每张切片任选5个视野，根据肝纤维化病理Ishak评分标准进行评分，评分标准见表 1 [13]。
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表 1 肝纤维化病理Ishak评分标准 Table 1 Ishak index score of liver fibrosis |
将小鼠肝切片按Masson染色试剂盒说明书进行染色，中性树胶封片后镜检。每张切片任选5个视野，用Image J软件计算蓝色胶原纤维面积，胶原面积的百分比越高，肝纤维化程度越高。
1.7 荧光定量PCR检测HMGB1相关炎性因子及纤维化因子的表达用TRIzol法提取肝组织总RNA[14]。随后采用NanoDrop 2000核酸测定仪测定总RNA浓度，总RNA经Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录得到cDNA。自NCBI GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)获得高迁移率族蛋白B1(HMGB1，No. NM_010439.4)，白细胞介素-1β(IL-1β，No. NM_008361.4)，肿瘤坏死因子α(TNF-α，No. NM_013693.3)，白细胞介素-6(IL-6，No. NM_031168.2)，干扰素γ(IFN-γ，No. NM_008337.4)，α平滑肌肌动蛋白(α-SMA，No. NM_007392.3)，Ⅰ型胶原α1(Col1α1，No. NM_007742.4)，转化生长因子β1(TGF-β1，No. NM_011577.2)，Smad蛋白2(Smad2，No. NM_010754.5)，Smad蛋白3(Smad3，No. NM_016769.4)及内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH, No. NM_008084.3)的序列，设计引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列见表 2。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix进行荧光定量RT-PCR。反应体系为5 μL Hieff qPCR SYBR Green Master Mix，正反向引物各0.5 μL，2 μL cDNA模板，补去离子水至10 μL。反应程序为95 ℃预变性2 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 5 s；95 ℃ 50 s。各基因mRNA转录水平采用相对定量方法(2-ΔΔCt)[15]。
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表 2 荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primers used for RT-PCR |
数据处理采用SPSS 17.0软件，使用单因素方差分析(One-way ANOVA), *表示差异显著(P < 0.05), **表示差异极显著(P < 0.01)。
2 结果 2.1 感染4周后小鼠各项指标检测感染4周后，对小鼠各项指标进行检测，结果表明，4周空白对照组、感染组的血常规检测未见异常指标(结果未展示)；血清生化检测可见4周感染组小鼠ALT数值极显著高于4周空白对照组(图 1A)(P < 0.01)；各组小鼠肝形态学和组织病理学检查未见明显异常(结果未展示)；各组小鼠肝切片Masson染色未见明显胶原纤维沉积(结果未展示)；RT-PCR检测感染4周后小鼠肝内炎性因子及纤维化因子表达显示，肝组织中TGF-β1的mRNA相对表达量显著高于4周空白对照组(图 1B)(P < 0.05)，HMGB1、α-SMA、IL-6及TNF-α的mRNA相对表达量则极显著高于4周空白对照组(图 1B)(P < 0.01)。以上结果表明，在感染日本血吸虫尾蚴4周后，肝功能部分指标异常，提示小鼠肝功能已受到一定程度的损伤。
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A. 小鼠血清谷丙转氨酶检测；B. 小鼠肝炎症和纤维化基因mRNA相对表达量。*或**表示4周空白对照组与4周感染组相比差异显著(P < 0.05)或极显著(P < 0.01)；虚线表示正常范围 A. Serum ALT content of mice; B. The mRNA expression of inflammatory and fibrotic cytokines. * or ** indicates that the difference between week-4 control and week-4 infected group are significant (P < 0.05) or extremely significant (P < 0.01); the dotted lines indicate the normal range 图 1 感染4周后小鼠各项指标检测 Fig. 1 Indexes detection of mice after 4 weeks infection |
血常规检测结果显示，6周感染组小鼠WBC、Eos和Mon数值显著高于6周空白对照组小鼠(图 2A~D)(P < 0.05)，Neu数值极显著高于6周空白对照组(图 2B)(P < 0.01)；6周空白对照组小鼠各项血常规指标均在正常范围内。血清生化检测结果显示，6周感染组小鼠ALT和AST数值极显著高于6周空白对照组小鼠(图 2E、F)(P < 0.01)；6周空白组小鼠各项血液生化指标均在正常范围内。血常规及血清生化检测结果表明，在感染日本血吸虫尾蚴6周后，小鼠机体产生炎症反应，且肝功能受到严重损伤。
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A~D. 小鼠血常规WBC、Neu、Mon、Eos检测；E~F. 小鼠血清生化ALT、AST检测。*或**表示6周空白对照组与6周感染组相比差异显著(P < 0.05)或极显著(P < 0.01)；虚线表示正常范围 A-D. Blood routine test of WBC, Neu, Mon and Eos in mice; E-F. Blood biochemical tests of ALT and AST in mice. * or ** indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group are significant (P < 0.05) or extremely significant (P < 0.01); the dotted lines indicate the normal range 图 2 感染6周后小鼠血常规及血液生化检测 Fig. 2 Blood routine test and blood biochemical test of mice after 6 weeks infection |
小鼠肝形态学观察可见6周空白对照组小鼠肝呈红褐色，表面光滑，质软而脆，肝叶边缘锐利；6周感染组小鼠肝呈深棕色，表面可见大小不一的白色虫卵肉芽肿，质地较硬，肝叶边缘粗糙(图 3A)。HE染色结果显示，6周空白对照组小鼠肝肝窦清晰，肝细胞未见变性、坏死、炎性细胞浸润等异常病理学变化；6周感染组小鼠肝内有虫卵聚积，虫卵周围存在大量炎性细胞浸润，肝细胞结构被破坏(图 3B)。根据肝纤维化病理Ishak评分标准对HE染色切片进行评分，结果显示，6周感染组Ishak评分极显著高于6周空白对照组(图 3C)(P < 0.01)。用Image J软件计算肉芽肿面积，结果显示，6周感染组小鼠肝肉芽肿面积以及每张切片肉芽肿面积占比均极显著高于6周空白对照组(图 3D、3E)(P < 0.01)。通过对肝进行形态学和组织病理学检查可知，在感染日本血吸虫尾蚴6周后，小鼠肝呈现肝纤维化症状。
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A. 小鼠肝形态学观察；B. 小鼠肝组织HE染色(200×)；C. 小鼠肝纤维化病理Ishak评分；D. 肝肉芽肿面积占比；E. 单个虫卵肉芽肿面积。扫文章首页OSID码可查看彩图。黑色箭头表示虫卵肉芽肿；**表示6周空白对照组与6周感染组相比差异显著极显著(P < 0.01) A. Morphology observation of livers; B. HE staining of livers (200×); C. Ishak index score of hepatic fibrosis; D. Percent of egg granulomas; E. Area of a single granuloma. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page. Black arrows indicate granuloma; ** indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group is extremely significant (P < 0.01) 图 3 感染6周后小鼠肝形态学和组织病理学检查 Fig. 3 Morphological and histopathological examination of liver in mice after 6 weeks of infection |
镜检可见6周感染组小鼠肝汇管区虫卵结节周围有蓝色纤维增生，有部分向肝小叶间延伸；6周空白对照组未见明显着色(图 4A)。用Image J软件对各组Masson染色切片进行分析，结果显示，6周感染组胶原纤维表达面积显著高于6周空白对照组(图 4B)(P < 0.01)。Masson染色结果表明，6周感染组小鼠肝严重纤维化。
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A. 小鼠肝Masson染色(200×)；B. 小鼠肝Masson染色着色面积。扫文章首页OSID码可查看彩图。黑色箭头表示Masson染色阳性区域；**表示6周空白对照组与6周感染组相比差异显著极显著(P < 0.01) A. Masson staining of livers (200×); B. Masson staining area. The color pictures can be found by scanning the OSID code on the front page. Black arrows indicate positive areas of Masson staining; ** indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group is extremely significant (P < 0.01) 图 4 感染6周后小鼠肝Masson染色 Fig. 4 Masson staining of liver in mice after 6 weeks infection |
RT-PCR结果显示，6周感染组小鼠肝组织中HMGB1、IL-1β、TNF-α、IL-6及IFN-γ mRNA相对表达量均极显著高于6周空白对照组(图 5)(P < 0.01)。结果表明，小鼠肝产生严重炎症反应。
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**表示6周空白对照组与6周感染组相比差异显著极显著(P < 0.01) **. indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group is extremely significant (P < 0.01) 图 5 感染6周后小鼠肝组织HMGB1等炎性因子的mRNA表达 Fig. 5 The mRNA expression of HMGB1 and other inflammatory cytokines in mice liver after 6 weeks infection |
RT-PCR结果显示，6周感染组小鼠肝组织中α-SMA、Col1α1、TGF-β1及Smad3的mRNA相对表达量均极显著高于6周空白对照组(图 6)(P < 0.01)，Smad2的mRNA相对表达量则显著高于6周空白对照组(图 6)(P < 0.05)。结果表明, 小鼠肝产生纤维化反应。
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*或**表示6周空白对照组与6周感染组相比差异显著(P < 0.05)或极显著(P < 0.01) * or ** indicates that the difference between week-6 control and week-6 infected group are significant (P < 0.05) or extremely significant (P < 0.01) 图 6 感染6周后小鼠肝纤维化因子的mRNA表达 Fig. 6 The mRNA expression of fibrotic cytokines in mice liver after 6 weeks infection |
在感染日本血吸虫尾蚴24 d后，连续4 d灌胃HMGB1抑制剂GL 50 mg·kg－1，检测小鼠各项指标。结果显示，GL给药组小鼠ALT数值相比4周感染组小鼠显著下降(图 7A)(P < 0.05)；肝组织中HMGB1、α-SMA、TGF-β1、IL-6及TNF-α mRNA相对表达量相比4周感染组小鼠均呈下降趋势，其中，HMGB1与TNF-α mRNA相对表达量显著下降(图 7B)(P < 0.05)，α-SMA、TGF-β1与IL-6 mRNA相对表达量极显著下降(图 7B)(P < 0.01)。以上结果表明，在日本血吸虫虫卵发育早期给予GL可抑制HMGB1表达，进而引起肝炎症及纤维化相关指标下调。
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A. 小鼠血清谷丙转氨酶检测；B. 小鼠肝炎症及纤维化相关基因mRNA相对表达量。*或**表示4周空白对照组与4周感染组相比差异显著(P < 0.05)或极显著(P < 0.01)；#或##表示4周感染组与4周GL给药组相比差异显著(P < 0.05)或极显著(P < 0.01)；虚线表示正常范围 A. Serum ALT content of mice; B. The mRNA expression of inflammatory and fibrotic related cytokines. * or ** indicates that the difference between week-4 control and week-4 infected group are significant (P < 0.05) or extremely significant (P < 0.01); #or ## indicates that the difference between week-4 infected group and GL treated group are significant (P < 0.05) or extremely significant (P < 0.01); the dotted lines indicate the normal range 图 7 HMGB1抑制剂对感染4周小鼠各项指标的影响 Fig. 7 Effects of HMGB1 inhibitor on indexes of mice after 4 weeks infection |
慢性血吸虫病对宿主的损害主要以肝纤维化为特征，血吸虫虫卵聚积于宿主肝门脉系统并分泌SEA，形成肉芽肿继而引起ECM大量沉积[5]。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化并向肌成纤维细胞转变是肝纤维化发病机制的中心环节[16]。HSCs活化的过程伴随着多种促纤维化细胞因子的分泌增加，如α-SMA、Col1α1和TGF-β1等[16]。其中，α-SMA和Col1α1已被公认为是肝纤维化的标志物，在寄生虫、病毒、异常代谢、大量饮酒和过度免疫反应等各种病因引起的肝纤维化中均异常表达[17]。TGF-β1则是纤维化疾病的重要调控因子，可调控成纤维细胞向肌成纤维细胞转化并与下游转录因子Smad2、Smad3相互作用，通过TGF-β/Smad信号通路诱导胶原合成[18-19]。
严自助等[4]研究表明，小鼠感染日本血吸虫尾蚴第25天时，可首先在肝组织内发现初产期虫卵，从初产期至虫卵发育成熟需10 d左右。本研究在小鼠感染日本血吸虫尾蚴28 d时，用荧光定量PCR检测感染小鼠肝组织中炎性及纤维化相关因子的mRNA相对表达量，结果发现，HMGB1、α-SMA、IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA相对表达量显著升高，且血清ALT水平显著上升，提示肝中的初产期虫卵已使肝组织发生一定损伤。感染6周后虫卵已发育成熟，再次使用荧光定量PCR检测感染小鼠肝组织中纤维化标志物α-SMA、Col1α1、TGF-β1、Smad2及Smad3 mRNA相对表达量，结果显示，6周感染组小鼠肝组织中各基因的mRNA相对表达量均显著高于6周空白对照组小鼠。同时，结合肝病理学检查可证实，在感染日本血吸虫尾蚴6周后，虫卵肉芽肿周围已出现肝纤维化症状。
HMGB1作为一种多功能细胞因子，可由损伤的肝细胞被动释放[8]。Ge等[20]发现，在四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型中，HMGB1在肝组织中的表达与α-SMA、Col1α1的表达成正相关。此外，利用siRNA沉默体外HSC-T6细胞系中的HMGB1表达后，细胞中α-SMA、Col1α1的表达也得到抑制，证明HMGB1与HSC的活化密切相关。此外，Albayrak等[21]研究表明，在乙型肝炎病毒致肝纤维化患者的血清中可检测到高水平HMGB1。Vicentino等[10]则在S. mansoni致肝纤维化患者的血清检测中得到相似结果，说明HMGB1应该与肝纤维化有关，且有望成为肝纤维化的重要诊断指标。本研究中，4周与6周感染组小鼠肝组织内HMGB1 mRNA相对表达量均显著高于相应空白对照组小鼠，证实了HMGB1与日本血吸虫病肝纤维化的相关性，验证了前人的研究结果，但HMGB1如何调控肝纤维化仍需进一步研究。
在肝纤维化发展时，肝组织同时会分泌大量炎性因子，使HSCs在炎性因子的刺激下持续活化，进一步促进纤维化进程[22]。本研究中，4周感染组小鼠血常规检测无异常指标，6周感染组小鼠的血液WBC、Mon、Neu和Eos显著高于6周空白对照组，肝组织内炎性因子HMGB1、IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-γ mRNA相对表达量显著升高，提示感染日本血吸虫尾蚴6周后小鼠体内产生严重炎症反应。HMGB1作为炎性因子被动释放时，可与细胞膜表面受体RAGE/TLR结合，活化核转录因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)信号通路，使NF-κB磷酸化并向核内转移，诱导下游炎性因子转录[23]。He等[24]发现，在感染日本血吸虫的小鼠肝星状细胞中，NF-κB信号通路被激活。邢媛等[25]研究则表明，在四氯化碳肝纤维化小鼠模型中，除肝组织中HMGB1表达升高外，血清中TLR4/NF-κB信号通路下游的炎性因子IL-6、TNF-α的表达也随四氯化碳损伤的加剧而升高，也表明HMGB1与肝炎症的发展有关。
慢性血吸虫病继发的肝疾病涉及多条信号通路的参与，通过药物抑制关键信号通路的激活是目前主要的治疗原则，但临床上单一药物的治疗效果不足以完全逆转肝纤维化，故筛选潜在高效的药物作用位点至关重要[26-27]。GL是甘草中的重要生理活性物质，已被证实具有抗病毒、抗炎和保肝等功能[28-30]。同时，GL可与HMGB1的功能结构域A box和B box结合，从而抑制HMGB1的生物学功能，是HMGB1的一种天然抑制剂[31]。Vicentino等[10]通过口服GL抑制HMGB1表达来治疗S. mansoni致肝纤维化小鼠，结果显示，小鼠存活率升高、肝肉芽肿面积减小、肝炎症及纤维化因子表达下调，证实HMGB1有成为慢性血吸虫病治疗药物靶点的潜力。最新研究表明，通过口服丁酸钠抑制HMGB1表达，也可有效缓解日本血吸虫致小鼠肝纤维化[32]。本研究在日本血吸虫虫卵发育早期，自感染尾蚴后24 d起，连续4 d灌胃给予小鼠GL 50 mg·kg-1，结果显示，小鼠血清ALT水平和肝组织中HMGB1、α-SMA、IL-6、TNF-α及TGF-β1 mRNA相对表达量较4周未给药组显著下降，提示GL可抑制HMGB1表达，进而引起肝炎症及纤维化相关因子的表达下调，说明GL对宿主肝能起一定保护作用。然而，HMGB1调控肝炎症和纤维化的分子机制还有待深入研究。
综上所述，本研究通过构建日本血吸虫病肝纤维化模型，初步探索了HMGB1与宿主肝炎症和纤维化的潜在关系，为阐明日本血吸虫病肝纤维化的致病机理提供重要参考，同时也讨论了HMGB1作为慢性日本血吸虫病治疗药物靶点的可能性。
4 结论本试验证实HMGB1与日本血吸虫病肝炎症及纤维化具有一定相关性。此外，在病因形成早期给予HMGB1抑制剂GL能对宿主肝产生一定保护作用。
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(编辑 白永平)