2. 西藏阿里地区中等职业技术学校, 阿里 859000
2. Secondary Vocational and Technical School in Ali Prefecture of Tibet, Ali 859000, China
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种接触传染性肠道病毒病,以仔猪的水样腹泻、高死亡率和发病率为特征[1-2]。PED的病原猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种单股正链RNA病毒,基因组大小约28 kb,编码16个非结构蛋白(non-structural protein, nsp),4个结构蛋白(S、E、M和N) 和1个辅助蛋白ORF3[3]。在结构蛋白中,S蛋白根据功能划分为S1和S2,S1结构域有助于受体识别、引发肠致病性和免疫原性,因为它包含显性中和表位。S2结构域锚定在病毒膜上,触发膜融合[4]。S1蛋白中的中和表位分别为COE(499—638 aa)、SS2 (748—755 aa)和SS6(764—771 aa),(1 368—1 374 aa) 位于S2结构域中[5-7]。除此之外,S1蛋白的N端(34—230 aa) 含有比较重要的抗原表位,可以诱导保护性反应,负责与细胞表面唾液酸受体结合[8]。此外,S蛋白是PEDV的一个主要的毒力基因[9-10],也是分析PEDV遗传变异和分子流行病学的重要靶标[11],这使得S蛋白成为研发疫苗和诊断试剂的候选者。
20世纪90年代,一群比利时学生尝试纯化单峰骆驼血清中的蛋白,无意中发现了除传统抗体之外,还有一种缺少轻链,仅由重链组成的抗体,这种抗体后来被称为重链抗体[12]。随后,在羊驼和鲨鱼等动物外周血中也发现了这种特殊抗体的存在。其重链可变区组成的单域抗体称为VHH (variable domains of Camellidae heavy chain-only antibodies,VHH)。VHH的形状为扁长型,类似于橄榄球状,相对分子质量约为15 ku,直径约为2.5 nm,高约4 nm,VHH是已知最小的具有完整抗原结合位点的抗体,因此被称为纳米抗体(nanobody,Nb)[13]。与常规抗体相比,Nb稳定性高,可溶性好、亲和力强、免疫原性小及易在大肠杆菌中表达和纯化,且具有高表达产量等特点[14-15]。因此,这使得Nb被应用到许多医学、生物技术、诊断和治疗中[16-17]。
目前,还没有报道针对PEDV S蛋白纳米抗体用于PED的治疗和诊断中,本研究拟通过噬菌体展示技术筛选出PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,为PED的治疗、诊断及研究PEDV的致病机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料E. coli Trans5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞均购自上海唯地生物技术有限公司;pCANTAB 5E噬菌体载体购自美国GE公司;HRP-Goat@Mouse IgG抗体和Anti-His Mouse mAb均购自于Jackson immuoresearch公司。Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液购自Greiner bio-one公司;辅助噬菌体M13K07和限制性内切酶购自美国NEB公司;RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit和Prime STAR HS DNA polymerase购自日本TaKaRa公司;质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司。
1.2 方法1.2.1 重组S1蛋白原核表达载体的构建 用RNAiso Plus从PEDV(GenBank序列号: No MT787025)阳性的组织病料中提取RNA,用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA, 用表 1引物以cDNA为模板扩增S1基因(66—1 515 bp),通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点克隆到pET32a载体中,得到质粒pET32a-S1, 测序正确后, 用于后续试验。使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit进行pET32a-S1的质粒提取,检测质粒浓度,置于-20 ℃保存。
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表 1 构建重组S1蛋白原核表达载体的引物序列 Table 1 Primer sequence of S1 gene |
1.2.2 重组S1蛋白的表达与纯化 将pET32a-S1质粒阳转到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,挑取阳性克隆到LB培养基中,于37 ℃恒温摇床中220 r·min-1震荡培养过夜,按照1∶100的比例接种于大的摇瓶中,培养至对数期,加入IPTG贮存液(1 mol·L-1)至终浓度为1 mmol·L-1,诱导5 h后收菌,SDS-PAGE鉴定蛋白是否表达。对诱导后的菌体138 kW超声3 s,暂停3 s,共超声40 min,收集上清和沉淀进行蛋白可溶性分析。用Ni-NTA纯化S1蛋白。
1.2.3 动物免疫 5 mg纯化的PEDVS1蛋白同弗氏完全佐剂和不完全佐剂乳化后免疫阿拉善双峰驼。免疫间隔为2周,4次后,采用间接ELISA测定骆驼血清中特异性PEDV S1抗体滴度,随后采集骆驼外周抗凝血,并分离淋巴细胞。间接ELISA的具体操作步骤:使用PBS作为包被缓冲液,将截短PEDV S蛋白稀释至10 μg·mL-1,100 μL·孔-1,加入酶标板,4 ℃条件包被过夜;次日,用PBS’T洗板4次,200 μL·孔-1加入2.5%脱脂奶粉,37 ℃恒温孵育1 h;弃去封闭液,用PBS’T洗板4次,对骆驼血清样品使用封闭液进行倍比稀释,各稀释比例100 μL·孔-1,置于37 ℃恒温孵育1 h;弃去倍比稀释的骆驼血清样品,PBS’T洗板4次,使用封闭液1∶2 000稀释Rabbit @ Camel IgG多克隆抗体,100 μL·孔-1,37 ℃恒温孵育1 h;弃去抗血清,PBS’T洗板4次,100 μL·孔-1加入稀释至工作浓度的Goat @ Mouse IgG HRP标记抗体,37 ℃恒温孵育1 h。弃去酶标二抗,用PBS’T洗板4次,100 μL·孔-1加入TMB显色底物,37 ℃避光恒温孵育15 min;50 μL·孔-1加入3 mol·L-1 H2SO4,使用分光光度计测量OD450 nm。
1.2.4 噬菌体展示文库的构建 提取外周血淋巴细胞RNA并反转录成cDNA. 采用巢式PCR扩增VHH基因,用表 2中CALL-1和CALL-2引物扩增出大小约700 bp的片段; 随后,用表 2中VHH-F和VHH-R进行第二轮的扩增,大小约400 bp, 对第二轮的产物回收, 对回收产物和pCANTAB 5E载体同时进行双酶切,酶切位点为PstⅠ和NotⅠ;随后将载体与目的片段连接并电转入E. coli TG1感受态细胞中,将转化的感受态细胞在37 ℃ 120 r·min-1恒温培养40~60 min。吸取200 μL培养物用于所构建文库质量的鉴定,将剩余培养物1.5 mL·板-1均匀涂布至LB/AMP-GLU方形培养皿,37 ℃恒温箱中培养6~8 h。刮下培养皿内菌落到2~3 mL LB/AMP-GLU培养基,保存备用。
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表 2 VHH片段PCR扩增引物 Table 2 The primers for amplification of VHH |
1.2.5 文库容量和多样性测定 将上述步骤中取出的200 μL培养物10倍梯度稀释,并涂布到AMP-GLU LB平板,37 ℃恒温培养过夜。统计转化子数量。挑取96个单菌落并菌液PCR鉴定阳性率,对阳性克隆测序;使用MegAlign软件对VHH序列进行比对,分析文库的序列多样性。
1.2.6 VHH噬菌体抗体展示文库的救援 取“1.2.4”步骤中构建的VHH噬菌体抗体展示文库,加入100 mL 2×YT/AMP-GLU培养基,37 ℃剧烈震荡培养至对数生长期。加入20 MOI辅助噬菌体M13KO7,37 ℃ 200 r·min-1震荡培养1~2 h,收集菌体沉淀。沉淀重悬后继续震荡培养12 h。离心,收集上清,加入1/5体积预冷的PEG/NaCl溶液,冰中孵育10~12 h。离心后用PBS重悬后即为重组噬菌体。
1.2.7 PEDV S1特异性重组噬菌体的淘选 用PEDV S1蛋白包板,100 ng·孔-1,同时设置对照孔,4 ℃包被过夜。弃包被液,2.5%脱脂奶粉封闭,37 ℃孵育1 h;1012pfu·mL-1加入步骤“1.2.6”救援的重组噬菌体,37 ℃孵育1 h。弃噬菌体溶液,洗板后加入0.1 mol·L-1的三乙胺,室温静置10 min,收集洗脱液,立即加入相同体积的1 mol·L-1 Tris-HCl (pH7.4),随后对所洗脱的重组噬菌体进行滴度的测定。取20 mL培养至对数期的TG1,加入洗脱的噬菌体溶液,37 ℃静置侵染60 min后加入80 mL 2×YT/AMP-GLU培养基,37 ℃ 200 r·min-1,震荡培养至对数期,按照上述步骤加入20 MOI辅助噬菌体进行救援后进行二轮淘选;按照上述步骤,对重组噬菌体总共进行3轮固相淘选。
1.2.8 PEDV S1特异性重组噬菌体富集 以PEDV S1包板过夜。封闭后将重组噬菌体溶液使用封闭液按1∶10稀释,37 ℃孵育1 h;弃去噬菌体溶液,PBS’T洗板4次,加入HRP标记Mouse @ M13噬菌体抗体,37 ℃孵育1 h。弃去抗体,PBS’T洗涤4次,加入TMB显色底物,37 ℃孵育15 min。50 μL·孔-1加入3 mol·L-1 H2SO4终止显色,测量OD450 nm。
1.2.9 重组纳米抗体的表达 取第3轮淘选后的重组噬菌体溶液,重组噬菌体溶液十倍梯度稀释后,加到对数期的TG1,37 ℃感染60 min,涂布于LB/AMP-GLU,过夜培养;挑取单菌落到LB/AMP-GLU中,培养过夜;从各菌落培养物中取出50 μL分别转接于2 mL TB培养基中,对应编号置于24孔培养板,培养至对数期;加入终浓度为1 mmol·L-1 IPTG,过夜诱导表达。
1.2.10 重组纳米抗体粗提物的制备 收集步骤“1.2.9”中的24孔板中培养液于1.5 mL EP管中,离心收集菌体沉淀,加入PBS重悬菌体并-20 ℃冻融。离心后,上清即为纳米抗体粗提物。
1.2.11 重组纳米抗体粗提物的检测 将经过纯化的截短PEDV S1重组蛋白用PBS缓冲液稀释至100 μg·mL-1,100 μL·孔-1,4 ℃包被过夜,同时设置相同数量的对照孔,包被等量的PEDV N重组蛋白;进行封闭后,用PBS’T洗涤4次,加入使用封闭液按1∶1稀释的纳米抗体粗提物,100 μL·孔-1,37 ℃恒温孵育1 h;弃去粗提物溶液,用PBS’T洗板4次,加入使用封闭液按1∶2 000稀释至工作浓度的Anti-E-tag标签抗体,100 μL·孔-1,37 ℃恒温孵育1 h;弃掉Anti-E-tag标签抗体,用PBS’T洗涤4次,100 μL·孔-1加入使用封闭液稀释至工作浓度的HRP标记Goat@Rabbit IgG抗体,37 ℃恒温孵育1 h;随后进行显色,进行使用分光光度计测量OD450 nm。
1.2.12 PEDV S1特异性纳米抗体的序列分析 将上述ELISA鉴定为阳性的克隆测序。用MegAlign软件比对测序结果,并根据纳米抗体高变区分类。
1.2.13 PEDV S1蛋白纳米抗体的特异性和结合力测定 使用同期对骆驼免疫的2种蛋白,猪圆环病毒Cap蛋白和猪伪狂犬病病毒gE蛋白作为对照。将截短PEDV S蛋白、猪圆环病毒Cap蛋白和猪伪狂犬病病毒gE蛋白包被于同一个ELISA酶标板,利用“1.2.11”步骤检测所筛选PEDV S蛋白纳米抗体的特异性。对不同的纳米抗体粗提物10倍倍比稀释,用同样的方法测定纳米抗体的结合力。
1.2.14 纳米抗体活性的鉴定 将生长状态良好的Vero细胞以一定密度铺入含有24孔爬片细胞板中和正常的12孔细胞培养板中,24 h后接入0.1 MO1 PEDV;接毒后24 h,一方面进行间接免疫荧光检测;每孔加入200 μL 4%多聚甲醛,置于37 ℃恒温箱中固定15 min;弃掉固定液后,每孔加入200 μL 0.25% triton X-100, 15 min后取出。用1×PBS (K+)洗涤3次,加入1%BSA封闭30 min;加入原核表达的纳米抗体Nb3,37 ℃孵育1 h;洗涤后加入His抗体,37 ℃孵育1 h;洗涤后加入荧光二抗,孵育1 h;洗涤后加入DAPI,染色10 min,使用细胞成像Leica microscope进行拍照。另一方面进行Western blot: 收集12细胞培养板中正常Vero细胞和PEDV感染的Vero细胞。利用NP40裂解细胞,取10 μL进行SDS-PAGE;随后转印至PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭2 h,用Nb3室温孵育1 h,PBS’T洗涤4次后,加入His抗体室温孵育1 h,PBS’T洗涤4次后,用HRP标记的Goat anti-Mouse IgG (H+L) 二抗进行室温孵育1 h,PBS’T洗涤4次后,将PVDF膜置于ECL发光液中后,放入化学发光成像仪内进行成像。
2 结果 2.1 pET32a-PEDV-S1原核表达载体的构建提取PEDV阳性组织的RNA,反转录成cDNA,以此为模板,PCR扩增产物位于1 000 ~2 000 bp,与预期目的片段大小(1 452 bp)相符(图 1A),目的条带回收后与载体pET-32a同时双酶切(图 1B),连接转化,挑取单菌落进行PCR鉴定,结果如图 1C, 将阳性克隆送公司测序,综上结果表明,成功构建pET32a-PEDV-S1原核表达载体。
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A.PEDV S1基因的扩增;B. 目的片段和载体的双酶切;C. 菌液PCR鉴定 A.PCR amplification of PEDV S1 gene; B. Double digestion of S1 gene and vector; C. The result of colony PCR 图 1 pET32a-PEDV-S1原核表达载体的构建 Fig. 1 Construction of pET32a-PEDV-S1 prokaryotic expression vector |
将测序正确的pET32a-PEDV-S1质粒转到E. coli BL21(DE3)中,以1 mmol·L-1的IPTG诱导表达后SDS-PAGE检测,在大约70 ku处可见与预期结果一致的条带,而空载诱导后,未出现此条带(图 2A),且S1重组蛋白以包涵体的形式存在(图 2B)。用Ni-NTA纯化后,得到纯度较好S1重组蛋白(图 2C)。
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A. PEDV S1重组蛋白的诱导表达(M. 蛋白质相对分子质量标准;1. pET-32a空载体未诱导菌体;2. pET-32a空载体诱导菌体;3. pET-32a-S1表达载体未诱导菌体;4. pET-32a-S1表达载体诱导菌体);B. PEDV S1重组蛋白的可溶性鉴定(M. 蛋白质相对分子质量标准;1. 菌体裂解后上清;2. 菌体裂解后沉淀);C. PEDV S1重组蛋白的纯化 A. Induced expression of PEDV S1 recombinant protein (M. Protein marker; 1. Bacteria of pET-32a without induction; 2. Bacteria of pET-32a with induction; 3. Bacteria of pET-32a-S1 without induction; 4. Bacteria of pET-32a-S1 with induction); B. Analysis of the solubility of PEDV S1 recombinant protein (M. Protein marker; 1. Supernatant of bacterial lysate; 2. Precipitate of bacterial lysate); C. Purification of PEDV S1 recombinant protein 图 2 PEDV S1重组蛋白的表达与纯化 Fig. 2 Expression and purification of PEDV S1 recombinant protein |
用纯化后的截短PEDV S重组蛋白免疫阿拉善双驼峰,在最后一次免疫后第4天,用间接ELISA检测S蛋白抗体效价,结果显示,双驼峰血清中PEDV S抗体效价高达1∶256 000 (图 3)。
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图 3 ELISA检测骆驼血清中PEDV S1特异性抗体效价 Fig. 3 Titer of anti-S1 antibody in the immune camel serum detected by ELISA |
采集200 mL骆驼外周抗凝血,分离外周血淋巴细胞。提取RNA,反转录成cDNA。通过巢式PCR扩增VHH片段,第一轮回收700 bp左右目的条带(图 4A),第二轮PCR回收400 bp左右条带(图 4B)。将VHH片段构建至pCANTAB 5E载体中,电转化至TG1感受态得到噬菌体展示文库,该文库库容约为2.1×107,阳性率约为85%(图 4C)。
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A和B. 扩增VHH基因;C. VHH文库的阳性率鉴定 A and B. Amplification of VHH gene by nested PCR; C. Evaluation of the positive rate of the VHH library 图 4 VHH噬菌体展示文库的构建 Fig. 4 Construction of a VHH phage display library |
对噬菌体展示文库进行救援后,经过3轮淘选后,富集率可以达到1 673(图 5A)。将第3轮淘选后的重组噬菌体侵染对数期TGI细胞,涂布至LB/AMP-GLU平板,挑取96个单菌落,共挑取2轮,进行粗提,通过ELISA鉴定粗提物与PEDV S蛋白的反应性,结果如5B,随机选取的96个单克隆中有23个为阳性克隆,对阳性克隆进行测序分析,鉴定出了6个序列不同的纳米抗体,并依次命名为Nb1~Nb6(图 5C)。
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A. 特异性噬菌体富集结果;B. 间接ELISA筛选PEDV S1蛋白特异性纳米抗体;C. PEDV S1蛋白特异性纳米抗体的氨基酸序列比对 A. Through three consecutive cycles of bio-panning, the PEDV S1 specific VHHs were enriched about 1 673-fold; B. The positive clones selected from PE-ELISA; C. Six kinds of different amino acid sequences of anti-S1 VHHs were identified 图 5 PEDV S1蛋白特异性纳米抗体的筛选 Fig. 5 Screening of specific nanobody of PEDV S1 protein |
以猪圆环病毒Cap重组蛋白和猪伪狂犬病病毒gE重组蛋白作为对照,检测筛选出的6株纳米抗体的特异性。结果显示,6株纳米抗体均不存在交叉反应(图 6A)。与此同时,通过ELISA进一步确定了6株纳米抗体对PEDV S重组蛋白的结合能力,结果显示,Nb3具有最高的结合能力(图 6B)
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图 6 PEDV S蛋白纳米抗体的结合力(A)与特异性(B)的分析 Fig. 6 Binding capacity (A) and specificity (B) of nanobodies against S protein |
通过Western blot和IFA验证纳米抗体Nb3与PEDV的结合,用原核表达的纳米抗体Nb3验证其是否能够结合感染细胞中的PEDV,以未接毒细胞作为对照,结果如图 7,Nb3同PEDV具有良好的结合活性。
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A. WB鉴定纳米抗体Nb3与PEDV的结合(1. PEDV感染Vero细胞;2. 正常Vero细胞):B. 间接免疫荧光鉴定纳米抗体Nb3与PEDV的结合(标尺=200 μm) A. Western blot identification of the binding activity of Nb3 to PEDV (1. PEDV infected Vero cells; 2. Normal Vero cells); B. Indirect immunofluorescence identification of the binding activity of Nb3 to PEDV (bar=200 μm) 图 7 Nb3与PEDV结合活性鉴定 Fig. 7 Identification of the binding activity of Nb3 to PEDV |
2010年10月,PED在中国大面积暴发,这次疫病的暴发以7日龄以内的哺乳仔猪极高发病率和死亡率为主要特征,2周龄以上的猪出现不同程度的腹泻和厌食等症状,并预示着高毒力PEDV变异毒株的出现[19],由此可见,PEDV是一种破坏力较大的肠道冠状病毒[19-21],目前,尚无针对PEDV的有效疫苗,因此,治疗与诊断对防控PED具有重大意义。
抗体能够中和病毒,起到一定的治疗作用,但同时也具有一定的风险,比如产生ADE现象[22]。纳米抗体优越的生物学特性能够克服常规抗体的不足,很适合疫病的治疗[23-24]。Bao等[25]通过利用截短的PEDV S蛋白免疫骆驼后筛选出1株S蛋白特异性的纳米抗体S7, 但S7对PEDV没有中和效果。Yang等[15]筛选出靶向PEDV M蛋白的4株特异性的单域抗体,但对PEDV同样没有中和活性。虽然没有中和活性,但这些纳米抗体均可被用于PEDV诊断。
纳米抗体被广泛用于病原诊断中[26-29],比如新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)[17, 27]、猪细小病毒(porcine parvovirus, PPV)[28]、猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)[29]和寨卡病毒(Zika virus)[26]。纳米抗体也被用于PEDV的诊断中,我们课题组已经建立了基于PEDV N蛋白纳米抗体的快速检测PEDV的方法[30]。本研究表达截短的PEDV S1(22—505 aa)蛋白,该区域不含有中和表位,但能够影响病毒的复制[8]。利用截短的S1蛋白免疫骆驼后构建了多样性良好的VHH噬菌体展示文库。经鉴定,该文库库容量为2.1×107,随机挑选96个单菌落,阳性率达到85%, 对其中的阳性单克隆进行测序,验证了该文库具有良好的多样性。进一步对文库进行了救援和3轮特异性淘选富集,并最终筛选出6株氨基酸序列不相同的纳米抗体,6株纳米抗体与猪圆环病毒Cap蛋白、猪伪狂犬病病毒gE蛋白均不存在交叉反应。随后,验证结合力最高的纳米抗体Nb3与PEDV具有良好的结合活性。
4 结论成功表达并纯化PEDV S1蛋白,免疫双峰驼后,构建多样性良好的噬菌体展示文库,并利用噬菌体展示技术成功筛选出6株特异性结合PEDV S1蛋白的纳米抗体。所筛选的特异性纳米抗体为PEDV的诊断和纳米抗体药物的研发提供了参考。
[1] |
LIANG W, ZHOU D N, GENG C, et al. Isolation and evolutionary analyses of porcine epidemic diarrhea virus in Asia[J]. PeerJ, 2020, 8: e10114. DOI:10.7717/peerj.10114 |
[2] |
ZHNAG L P, LIU X S, ZHANG Q L, et al. Biological characterization and pathogenicity of a newly isolated Chinese highly virulent genotype GⅡa porcine epidemic diarrhea virus strain[J]. Arch Virol, 2019, 164(5): 1287-1295. DOI:10.1007/s00705-019-04167-3 |
[3] |
GUO J H, FANG L R, YE X, et al. Evolutionary and genotypic analyses of global porcine epidemic diarrhea virus strains[J]. Transbound Emerg Dis, 2019, 66(1): 111-118. DOI:10.1111/tbed.12991 |
[4] |
LEE D K, PARK C K, KIM S H, et al. Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea[J]. Virus Res, 2010, 149(2): 175-182. DOI:10.1016/j.virusres.2010.01.015 |
[5] |
ZANG Y, TIAN Y, LI Y G, et al. Recombinant Lactobacillus acidophilus expressing S1 and S2 domains of porcine epidemic diarrhea virus could improve the humoral and mucosal immune levels in mice and sows inoculated orally[J]. Vet Microbiol, 2020, 248: 108827. DOI:10.1016/j.vetmic.2020.108827 |
[6] |
YU J, CHAI X L, CHENG Y, et al. Molecular characteristics of the spike gene of porcine epidemic diarrhoea virus strains in Eastern China in 2016[J]. Virus Res, 2018, 247: 47-54. DOI:10.1016/j.virusres.2018.01.013 |
[7] |
SUN D B, FENG L, SHI H Y, et al. Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein[J]. Vet Microbiol, 2008, 131(1-2): 73-81. DOI:10.1016/j.vetmic.2008.02.022 |
[8] |
HOU Y X, LIN C M, YOKOYAMA M, et al. Deletion of a 197-amino-acid region in the N-terminal domain of spike protein attenuates porcine epidemic diarrhea virus in piglets[J]. J Virol, 2017, 91(14): e00227-17. |
[9] |
SUZUKI T, TERADA Y, ENJUANES L, et al. S1 subunit of spike protein from a current highly virulent porcine epidemic diarrhea virus is an important determinant of virulence in piglets[J]. Viruses, 2018, 10(9): 467. DOI:10.3390/v10090467 |
[10] |
TSAI K J, DENG M C, WANG F I, et al. Deletion in the S1 region of porcine epidemic diarrhea virus reduces the virulence and influences the virus-neutralizing activity of the antibody induced[J]. Viruses, 2020, 12(12): 1378. DOI:10.3390/v12121378 |
[11] |
HSUEH F C, LIN C N, CHIOU H Y, et al. Updated phylogenetic analysis of the spike gene and identification of a novel recombinant porcine epidemic diarrhoea virus strain in Taiwan[J]. Transbound Emerg Dis, 2020, 67(1): 417-430. DOI:10.1111/tbed.13365 |
[12] |
HAMERS-CASTERMAN C, ATARHOUCH T, MUYLDERMNS S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains[J]. Nature, 1993, 363(6428): 446-448. DOI:10.1038/363446a0 |
[13] |
MUYLDERMANS S, BARAL T N, RETAMOZZO V C, et al. Camelid immunoglobulins and nanobody technology[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2009, 128(1-3): 178-183. DOI:10.1016/j.vetimm.2008.10.299 |
[14] |
SALVADOR J P, VILAPLANA L, MARCO M P. Nanobody: outstanding features for diagnostic and therapeutic applications[J]. Anal Bioanal Chem, 2019, 411(9): 1703-1713. DOI:10.1007/s00216-019-01633-4 |
[15] |
YANG S L, LI L, YIN S H, et al. Single-domain antibodies as promising experimental tools in imaging and isolation of porcine epidemic diarrhea virus[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2018, 102(20): 8931-8942. DOI:10.1007/s00253-018-9324-7 |
[16] |
BANNAS P, HAMBACH J, KOCH-NOLTE F. Nanobodies and nanobody-based human heavy chain antibodies as antitumor therapeutics[J]. Front Immunol, 2017, 8: 1603. DOI:10.3389/fimmu.2017.01603 |
[17] |
JI P P, ZHU J H, LI X X, et al. Fenobody and RANbody-based sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect Newcastle disease virus[J]. J Nanobiotechnol, 2020, 18(1): 44. DOI:10.1186/s12951-020-00598-2 |
[18] |
SUN R Q, CAI R J, CHEN Y Q, et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets, China[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(1): 161-163. DOI:10.3201/eid1801.111259 |
[19] |
LI W T, LI H, LIU Y B, et al. New variants of porcine epidemic diarrhea virus, China, 2011[J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(8): 1350-1353. DOI:10.3201/eid1803.120002 |
[20] |
LIN C M, SAIF L J, MARTHALER D, et al. Evolution, antigenicity and pathogenicity of global porcine epidemic diarrhea virus strains[J]. Virus Res, 2016, 226: 20-39. DOI:10.1016/j.virusres.2016.05.023 |
[21] |
QI M P, ZAMBRANO-MORENO C, PINEDA P, et al. Several lineages of porcine epidemic diarrhea virus in Colombia during the 2014 and 2016 epidemic[J/OL]. Transboundary and Emerging Diseases, 2020, doi: 10.1111/tbed.13914.
|
[22] |
DUBEY A, DAHIYA S, ROUSE B T, et al. Perspective: Reducing SARS-CoV2 infectivity and its associated immunopathology[J]. Front Immunol, 2020, 11: 581076. DOI:10.3389/fimmu.2020.581076 |
[23] |
CUSTÓDIO T F, DAS H, SHEWARD D J, et al. Selection, biophysical and structural analysis of synthetic nanobodies that effectively neutralize SARS-CoV-2[J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 5588. DOI:10.1038/s41467-020-19204-y |
[24] |
WANG L Z, ZHANG L, HUANG B C, et al. A nanobody targeting viral nonstructural protein 9 inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication[J]. J Virol, 2019, 93(4): e01888-18. |
[25] |
BAO F X, WANG L X, ZHAO X X, et al. Preparation and characterization of a single-domain antibody specific for the porcine epidemic diarrhea virus spike protein[J]. AMB Express, 2019, 9(1): 104. DOI:10.1186/s13568-019-0834-1 |
[26] |
DELFIN-RIELA T, ROSSOTT M, ALVEZ-ROSADO R, et al. Highly sensitive detection of Zika virus nonstructural protein 1 in serum samples by a two-site nanobody ELISA[J]. Biomolecules, 2020, 10(12): 1652. DOI:10.3390/biom10121652 |
[27] |
SHENG Y M, WANG K, LU Q Z, et al. Nanobody-horseradish peroxidase fusion protein as an ultrasensitive probe to detect antibodies against Newcastle disease virus in the immunoassay[J]. J Nanobiotechnol, 2019, 17(1): 35. DOI:10.1186/s12951-019-0468-0 |
[28] |
LU Q, LI X, ZHAO J, et al. Nanobody-horseradish peroxidase and -EGFP fusions as reagents to detect porcine parvovirus in the immunoassays[J]. J Nanobiotechnol, 2020, 18(1): 7. DOI:10.1186/s12951-019-0568-x |
[29] |
DU T, ZHU G, WU X, et al. Biotinylated single-domain antibody-based blocking ELISA for detection of antibodies against swine influenza virus[J]. Int J Nanomed, 2019, 14: 9337-9349. DOI:10.2147/IJN.S218458 |
[30] |
MA Z Q, WANG T Y, LI Z W, et al. A novel biotinylated nanobody-based blocking ELISA for the rapid and sensitive clinical detection of porcine epidemic diarrhea virus[J]. J Nanobiotechnol, 2019, 17(1): 96. DOI:10.1186/s12951-019-0531-x |
(编辑 白永平)