2. 华中农业大学动物科学技术学院, 武汉 430070
2. College of Animal Science, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
骨骼肌作为胰岛素调节外周组织葡萄糖摄取的主要部位,其胰岛素抵抗是糖尿病发生的重要原因之一[1]。骨骼肌作为动物机体能量消耗的主要组织,也是机体调节能量代谢的枢纽,可以根据不同的能量需求,快速在糖酵解、氧化磷酸化或脂肪酸氧化等能量产生方式间切换,以满足不同能量需求的周转[2-4]。与之相适应的是肌纤维异质性,保证了骨骼肌的这种代谢灵活性,例如,有氧运动增加骨骼肌的能量需求,促使肌纤维表型从快肌纤维向慢肌纤维转化,以此满足机体的能量需求[5]。骨骼肌还提供了通过增加运动量和以不依赖胰岛素的方式摄取葡萄糖,恢复体内代谢平衡,为治愈2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)提供新的方法与思路[6]。提示,肌肉的适应性变化可能对疾病治疗产生有益影响。
葡萄糖转运蛋白4(Glut4)是骨骼肌和脂肪组织特异性表达的葡萄糖转运载体,在胰岛素调控下快速响应机体的血糖变化,对维持体内血糖稳定具有重要作用。Glut4由slc2a4基因编码,是MFS(major facilitator superfamily)超家族成员之一,具有MFS共有的12个跨膜螺旋结构。Glut4还具有独特的结构,其N端包含的苯丙氨酸残基和C端包含的双亮氨酸序列是参与胰岛素应答和膜转位的重要结构[7],同时也是唯一响应胰岛素信号,从囊泡结构中重新分布到质膜的转运蛋白,其转运缺陷是构成胰岛素抵抗的基础。基于Glut4是实现组织摄取葡萄糖的最后一步,以及它对胰岛素的响应,因此被认为是糖尿病治疗的关键靶点[8]。大量关于天然物质对降糖的研究都是基于改善Glut4的功能,例如花青素就是通过显著改善了Glut4的表达,增加了Glut4的移位和葡萄糖的摄取从而用于血糖的维持[9]。针对Glut4在糖脂代谢及肌纤维重塑方面的作用已开展大量研究工作,例如,通过构建脂肪与肌肉Glut4敲除小鼠,发现肝脏葡萄糖摄取和脂肪合成均增加了,并且使得肌肉优先利用脂质供能来适应代谢的变化[10]。肌肉过表达Glut4的小鼠糖酵解增强,脂肪酸氧化减弱,在腓肠肌中IIb型肌纤维的比例与野生鼠相比减少28%,IIa型纤维比例增加11%[11]。基于以上对Glut4的研究发现,Glut4对糖尿病的治疗至关重要,然而Glut4敲除后造成葡萄糖转运载体缺失,不能进一步研究胰岛素抵抗状态下Glut4膜转位调控机制及治疗靶点筛选。
基于Glut4与家族成员在葡萄糖结合位点的高度同源性,以及通过Glut1逐点突变确定Gln161在葡萄糖结合中的关键作用[12-13],本研究对Glut4的177位点进行点突变,获得单个氨基酸突变的小鼠。通过研究Glut4突变对肌肉糖脂代谢及肌纤维重塑的影响,为2型糖尿病的治疗及家畜生产提供模型及参考数据。
1 材料与方法 1.1 试验材料在Ensemble网站上查找基因编号为ENSMUSG00000018566的slc2a4基因序列,利用CRISPR/Cas9在其第五外显子上将距5′-UTR 2 110位的碱基A突变为T,质粒载体委托协和医院构建。健康22周龄C57BL/6 J小鼠分为野生型(Glut4+/+)和Glut4基因纯合突变鼠(Glut4m/m)。小鼠饲养在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所兽医实验动物房,室内温度(22±2)℃,相对湿度40%~ 70%,自由进食与饮水。
1.2 试剂与仪器KAPA Express Extract DNA Extraction Kit(罗氏);胰岛素试剂盒(Mercodia);瘦素试剂盒、脂联素试剂盒(R&D);20%葡萄糖溶液(北京北方生物技术研究所有限公司);精蛋白生物合成人胰岛素注射液(SIGMA);RTIzol、PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒(TaKaRa);Invitrogen PowerUpTM SYBR® Green Master Mix荧光定量试剂盒(北京冬歌博业生物科技有限公司);组织蛋白提取试剂(赛默飞世尔科技);电泳液、转膜液、PVDF膜(北京博通兴业生物科技有限公司);AMPK-ɑ抗体、兔抗Thr172磷酸化AMPKα抗体(CST);Glut4抗体(Abcam)。
血糖仪及血糖试纸(强生);普通PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽(Bio-Rad);Nano100微量分光光度计(奥盛);荧光定量PCR仪(ABI);高速冷冻离心机(Eppendorf);组织匀浆仪(Bertin technologies);制冰机(SANYO)。
1.3 方法1.3.1 鼠基因型的鉴定 取小鼠尾尖2 mm3的组织块,使用KAPA Express试剂盒快速抽提小鼠DNA:EP管中加入10×KAPA Quick Extract Buffer 5 μL、ddH2O 44 μL、KAPA Quick Extract Enzyme 1 μL,共50 μL。PCR仪设置程序:75 ℃ 15 min,95 ℃5 min,12 ℃ 30 s。从获取的DNA上清中取2.5 μL,加入2×Taq Master Mix 10 μL,上、下游引物(上游引物: 5′-TTGGACGGTTCCTCATTGGC-3′, 下游引物: 5′-GCTCTTCCTTCCAGCCCAAAT-3′)各1 μL,ddH2O 5.5 μL。设置程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 25 s,72 ℃ 10 min,34个循环。将得到的PCR反应产物送天一辉远公司测序。
1.3.2 血清学指标的测定 小鼠摘眼球法采血,处死小鼠,血样3 000 r·min-1离心10 min,取上清,根据试剂盒说明书规范操作检测胰岛素、脂联素、瘦素水平,使用日本奥林巴斯株式会社全自动生化仪检测甘油三酯的含量。
1.3.3 糖耐量与胰岛素耐量水平检测 配置20%的葡萄糖溶液,小鼠空腹禁食16 h,每只小鼠腹腔注射0.01 mL·g-1的葡萄糖,使用血糖仪分别在15、30、60、90、120、150 min检测血糖并记录。使用GraphPad Prism 8.0计算葡萄糖曲线下面积(AUC),AUC值越大,代表小鼠降血糖的能力越差,糖耐量水平越差。
配置0.1 U·mL-1胰岛素溶液,小鼠空腹禁食4 h,每只小鼠腹腔注射0.1 U·mL-1的胰岛素溶液,在15、30、45、60、90 min测定每只小鼠各个时间点的血糖值,同上述步骤计算AUC。
1.3.4 荧光定量PCR检测 使用Trizol传统方法提取RNA,即TRIzol破碎细胞、降解细胞,氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA,75%酒精分离提纯获得总RNA。Nana100测定RNA浓度后,使用TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒将RNA反转为cDNA。借助SYBRTM Select Master Mix试剂盒,反应体系为SYBR染料10 μL, 上、下游引物(表 1)各1 μL, ddH2O 6 μL,cDNA 2 μL。反应程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s, 60 ℃ 34 s, 共40个循环,最后得到扩增曲线,用内参18S校正后,计算基因的表达量。
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表 1 荧光定量引物序列 Table 1 The sequence of qPCR primers |
1.3.5 蛋白质印迹检测蛋白表达 取100 mg腓肠肌组织,加入400 μL含有蛋白酶和磷酸化酶抑制剂的裂解液,匀浆机破碎组织,冰上孵育30 min后离心4 ℃ 12 000 r·min-1,30 min吸取上清获得蛋白。蛋白变性后,经电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影等步骤得到蛋白成像图。使用ImageJ软件分析目标条带灰度值。
1.4 统计学分析所有试验均进行平行试验检测,数据结果表示为“平均值±标准差”,血清学检测、基因的表达与蛋白检测均采用独立样本t检验分析显著性,P < 0.05认为具有统计学意义。使用GraphPad Prism 8.0绘图,使用Image J软件进行灰度分析。
2 结果 2.1 Glut4突变鼠的制备与阳性鉴定为降低小鼠骨骼肌和脂肪组织葡萄糖摄取能力,针对受胰岛素调控的Glut4葡萄糖结合关键位点进行点突变。已有报道表明,将Glut4第177位谷氨酰胺(Q)为突变为赖氨酸(L),Glut4的葡萄糖转运能力下降至原来的5%~10%[14]。根据slc2a4的基因序列,在第五外显子上设计CRISPR/Cas9的靶向gRNA,切割后经靶向序列修复将导致Glut4第177位Q→L的单氨基酸突变(图 1A)。将gRNA与Cas9蛋白构建载体,显微注射到小鼠受精卵,制备Glut4Q177L单氨基酸突变的小鼠。以包含突变位点片段两侧的序列为参考设计引物,PCR扩增产物测序鉴定阳性个体,图 1B显示,靶点处单峰A为野生型,单峰T为Glut4突变纯合子。
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A.slc2a4基因结构图;B.测序峰图,上方为野生型小鼠序列,下方为Glut4纯合突变小鼠序列 A. Structure of the target sequence of slc2a4 gene; B. Sequencing map, above is wild type mouse, below is mutant mouse 图 1 CRISPR/Cas9构建slc2a4突变鼠 Fig. 1 CRISPR/Cas9-mediated slc2a4 single base mutation in mice |
2.2.1 体重与组织称重 为评价Glut4突变限制脂肪和骨骼肌葡萄糖摄取能力后机体的生长发育能力,对22周龄两组小鼠的体重及皮下脂肪、褐色脂肪、附睾脂肪、胰腺、肝脏、肾脏、肠系膜脂肪、心脏、心周脂、肾周脂以及右后侧肢分别进行称重。结果显示,突变小鼠体重((23.37±0.75) g)极显著低于野生型小鼠((28.47±0.31) g)(P < 0.01, 图 2A),其中皮下脂肪、附睾脂及肠系膜脂重量相对于体重的比例显著改变,分别从野生型1.91%、2.18%和0.97%下降到1.37%、1.20%和0.46%(P < 0.05, 图 2B)。除此之外,突变鼠的心脏、肝脏有代偿增大的趋势,同时,腿部肌肉占体重比例有增加趋势,但是在22周龄未达到显著水平。突变鼠内脏脂肪与皮下脂肪的减少表明Glut4基因突变可能改变了脂质的分布与利用。
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*. P < 0.05;**. P < 0.01, 下同 *. P < 0.05;**. P < 0.01, the same as below 图 2 体重(A)与组织称重(B) Fig. 2 Body weight(A) and tissue weight(B) |
2.2.2 突变鼠糖耐量受损 为评价Glut4突变对全身葡萄糖摄取能力的影响,对22周龄小鼠的糖耐量与胰岛素耐量进行了评价。糖耐量结果显示,野生型小鼠在注射葡萄糖15 min后血糖达到最高值随后下降,而突变鼠在30 min达到最高,血糖下降的延迟说明突变鼠胰岛素对糖的响应能力减弱(图 3A),进一步分析葡萄糖曲线下面积显示,突变鼠的曲线下面积极显著大于对照(P < 0.01,图 3B)。同时,胰岛素耐量结果显示,突变鼠注射胰岛素后血糖下降缓慢,且曲线下面积极显著大于对照组(P < 0.01,图 3C,D)。以上结果说明,Glut4基因突变后延缓了血糖的处理速度,血糖下降困难,造成突变鼠的糖代谢紊乱。
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图 3 糖耐量与胰岛素耐量血糖值与曲线下面积 Fig. 3 Glucose and insulin tolerance test with AUC |
2.2.3 血清学指标 动物个体糖代谢与脂代谢密切相关,组织间通过分泌激素或细胞因子进行相互调控,为此,本研究测定了两组鼠血清学甘油三酯、胰岛素、脂联素和瘦素等的变化情况。突变鼠血清中甘油三酯的含量((0.77±0.11) mmol·L-1)显著低于对照组((1.20±0.21) mmol·L-1)(P < 0.05,图 4A),提示突变鼠可能对外周脂质的利用增加,而血清中的胰岛素、脂联素和瘦素组间差异不显著(图 4B~D)。
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图 4 Glut4突变后小鼠血清指标的变化 Fig. 4 Changes of serum indexes in Glut4m/mmice |
为了解Glut4突变对机体摄取葡萄糖的影响,对腓肠肌中多个葡萄糖转运蛋白的表达量进行了检测,结果显示,Glut4的表达量最高,其次是Glut12。Glut4基因突变后,Glut4、Glut1和Glut12表达量出现显著升高(P < 0.05,图 5),说明在糖摄取不足时机体会增加转运蛋白的表达,代偿葡萄糖的摄取,以此维持葡萄糖的稳态。
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图 5 转运蛋白相关基因mRNA表达 Fig. 5 The relative mRNA expression level of Gluts in mice |
为了解Glut4突变骨骼肌糖摄取降低后,骨骼肌是如何满足机体能量供应的,进一步对能量需求调控通路及脂代谢过程进行评价。结果显示,调控能量代谢的5′-腺苷一磷酸激活蛋白激酶(AMPK) 和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(PGC-1α),胰岛素信号通路中的胰岛素受体底物(IRS)和磷脂酰肌醇激酶(PI3K),脂代谢相关基因的脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感脂肪酶(HSL)、二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)、白细胞分化抗原36(CD36)、心型脂肪酸结合蛋白(hFABP4)和脂肪酸转运蛋白(FATP)基因,及肌肉细胞因子鸢尾素(Irisin)和白介素6(IL-6)等基因均显著上调表达(图 6A)。上述结果表明,突变鼠在葡萄糖摄取不足的情况下会增强脂质动员相关基因的表达,且Glut4突变后机体利用能量的底物发生改变,促使脂肪酸的消耗与利用增强。为进一步确定AMPK的激活程度,通过蛋白免疫印迹方法检测显示,突变鼠的AMPK与pAMPK表达量均显著高于对照组(P < 0.05,图 6B),因此,Glut4基因突变后可以通过激活AMPK来加强对能量物质的动员。
其次,为了解Glut4突变是否对其上游胰岛素通路有影响,对胰岛素信号通路的两个关键基因IRS和PI3K进行检测,二者的表达量均极显著增加(P < 0.01),说明Glut4突变后使得小鼠的胰岛素敏感性增强。
此外,为了明确Glut4突变是否会对肌细胞因子产生影响,本研究还检测了肌细胞因子,发现Irisin和IL-6的水平极显著升高(P < 0.01)。Irisin最早在骨骼肌中被发现,具有脂肪细胞棕化的作用;IL-6是重要的炎性因子,同时也是最早被鉴定的肌细胞因子,运动后的骨骼肌分泌IL-6,通过血液循环调控脂肪组织分解供应能量。二者表达的增加提示突变鼠可能处于能量消耗增加状态。
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图 6 脂代谢相关基因的mRNA表达(A)与AMPK蛋白及磷酸化水平(B) Fig. 6 The relative expression level of genes (A)related to lipid metabolism and the protein and phosphorylation level of AMPK (B) |
为了进一步确定突变鼠机体能量底物发生变化对肌肉的影响,本研究检测了22周龄小鼠腓肠肌的肌纤维类型相关基因的表达情况。如图 7所示,突变鼠I型肌纤维MyHCI和快IIa型肌纤维MyHCIIa表达极显著高于对照组(P < 0.01),而IIb型肌纤维MyHCIIb的表达显著低于对照组(P < 0.05),并且参与调控肌肉发育的肌细胞增强子因子2C(MEF2C)水平显著升高(P < 0.05)。
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图 7 肌纤维类型相关基因的mRNA表达 Fig. 7 The relative expression level of genes related to muscle fiber types |
葡萄糖转运蛋白是哺乳动物细胞中辅助葡萄糖转运的主要介质。其中,Glut1具有与基础血糖相近的Km值,维持全身各组织在血糖稳态调节中的功能。Glut2对葡萄糖具有低亲和力和高转运率,对高糖环境敏感,有助于肝脏高效发挥血糖调节功能。Glut3的底物亲和力最高,保持中枢神经系统优先利用葡萄糖。Glut4是I组唯一胰岛素敏感的转运蛋白[15]。研究报道显示,肌肉中葡萄糖转运蛋白总共有7个:Glut4、Glut5、Glut12、Glut8、Glut11、Glut3和Glut1,且在慢肌中Glut4、Glut5和Glut12的丰度最高[16]。与这一研究相似的是本研究发现在小鼠腓肠肌中Glut4、Glut12和Glut1的丰度远高于其他转运蛋白。
Glut4的含量对于血糖调控至关重要,研究发现,肌肉特异性Glut4缺失小鼠的肌肉葡萄糖摄取量显著降低[17],此外,骨骼肌或者脂肪特异性敲除Glut4均会导致全身胰岛素抵抗[18]。Glut4的过表达通过将高水平的Glut4蛋白转移到细胞表面来缓解胰岛素抵抗,导致血糖控制的显著改善[19]。本试验发现,Glut4的表达增加反映了其调控血糖的重要性。
胰岛素抵抗被认为是2型糖尿病发生的关键原因,而Glut4无法响应胰岛素抵抗是这种紊乱的促成因素。报道显示,2型糖尿病患者中Glut4在慢肌纤维的丰度与健康对照组相比降低了18%[20];而肌肉特异性敲除Glut4的小鼠在胰岛素刺激,骨骼肌的葡萄糖摄取没有受到损害,推测可能存在其他转运蛋白的代偿作用[21]。在本研究中,Glut4突变后Glut4、Glut1和Glut12表达显著升高,验证了在糖摄取不足情况下转运蛋白的代偿效应,然而,这种代偿作用不能完全替代Glut4的功能,从而表现出胰岛素抵抗特征。报道显示,基因编辑Glut4缺失13 bp的3T3-L1中发现,Glut1表达增高而葡萄糖摄入量显著低于对照组[22]。
3.2 Glut4基因突变可改变骨骼肌能量供应底物和促进脂质利用糖耐量是评价机体对血糖稳态调节能力和对葡萄糖敏感性的指标[23]。本研究中,Glut4基因突变导致糖耐量受损,表明突变鼠减少葡萄糖作为能量物质的利用,反映出Glut4在血糖调节中具有重要作用,这一结果与T2DM患者Glut4表达降低或膜转位障碍引起的糖耐量受损一致,表明Glut4突变可以模拟T2DM患者中Glut4功能障碍的病理机制。
葡萄糖和甘油三酯是细胞内能量供应和储存的主要来源。肌肉具有转换能量底物的代谢灵活性[24]。Kotani等[10]构建脂肪和肌肉Glut4敲除小鼠,观察到口服脂质灌胃后小鼠呼吸熵降低且血清脂质清除增加,发现Glut4敲除后小鼠肌肉优先利用脂质燃料来适应糖的供应不足。本研究中,脂肪水解(ATGL)和脂肪酸摄取、结合(CD36、FATP、hFABP4)相关基因均表达增加,表明Glut4突变降低葡萄糖摄取后,可促使小鼠能量底物从葡萄糖转变为脂肪酸,通过增加脂肪酸的利用以满足能量需求。AMPK作为能量调节的关键信号通路,可通过调节合成代谢和分解代谢途径来维持能量的平衡[25]。AMPK通过磷酸化ATGL促进脂肪的吸收和释放,激活的AMPK还可以招募肌膜上脂肪酸转运蛋白CD36以此增加游离脂肪酸的摄取[26],以及增加FATP4和FABP4的表达,促进能量的生成[27]。本研究中,AMPK以及其下游ATGL、FATP4和FABP4的表达水平均显著升高,说明Glut4突变小鼠对脂质的利用增加是通过激活AMPK通路完成的。
AMPK除了直接对甘油三酯进行分解以及促进游离脂肪酸的利用外,还能促进Irisin的表达[28]。Irisin是2012年发现的肌细胞因子,前体是FNDC5蛋白,由于Irisin具有促进白色脂肪棕色化的减肥作用而广受关注[29]。Irisin被认为是PGC-1α依赖性肌因子,Boström等[30]观察发现,运动可以通过促进PGC-1α刺激Irisin的表达,进而促进能量的消耗。肌肉特异性AMPKα2基因敲除小鼠导致FNDC5 mRNA水平降低[31]。因此AMPK-PGC-1α-Irisin在调控能量方面发挥重要的作用[32]。同样,在本研究中观察到AMPK、PGC-1α、Irisin基因均上调表达,提示Irisin在Glut4突变鼠调节能量代谢方面也起到积极作用。
Glut4突变鼠为了适应葡萄糖摄取的不足,改变能量底物,进而导致了脂质的重分布。食物来源的脂肪经消化分解后主要储存在脂肪组织,而Glut4突变鼠内脏脂肪与皮下脂肪组织重量减少,脂肪酸更多的流入肌肉组织,分解供能。因此Glut4突变影响了能量代谢与脂质的重分布。
3.3 Glut4基因突变增加氧化型慢肌纤维比例以适应糖摄取不足骨骼肌是由不同纤维类型组成的异质组织,对全身胰岛素刺激的葡萄糖代谢具有重要作用。不同类型肌纤维具有不同的葡萄糖代谢方式,I型纤维肌肉表达较高的胰岛素受体和Glut4,具有更高的葡萄糖处理能力,其胰岛素刺激的葡萄糖摄取量高于高度糖酵解II型纤维的肌肉,而II型纤维葡萄糖的氧化能力、Glut4的丰度以及对胰岛素的响应都弱于I型纤维[33]。通过底物感测、运输、存储和利用来有效适应新陈代谢的能力被称为代谢的灵活性[34]。代谢的灵活性对于能量过多或能量限制时以及在运动过程中能量需求变化时对维持能量稳态至关重要[35]。骨骼肌具有代谢灵活性,其灵活性体现在当代谢发生变化时,可以通过肌纤维的转化来满足能量需求的变化,因此在代谢疾病方面,肌肉的灵活性在疾病初期具有重要作用[36]。短期饲喂高脂饲料,小鼠出现促进氧化性纤维表达以缓解高脂饮食带来的能量负荷的适应性变化[37]。糖尿病患者骨骼肌的形态与肌纤维类型会发生改变,疾病状态下导致氧化磷酸化障碍和更高的快肌纤维含量[38]。本研究发现,慢肌纤维表达增加,促进脂质的消耗,这种适应性变化可能有利于糖尿病早期的改善[28]。
此外,肌细胞增强因子家族成员MEF2C与PGC-1α在慢肌纤维的表达中发挥重要调控作用[39]。PGC-1α是调控能量生成的重要转录因子,可以与MEF2相互作用,研究发现,经跑步训练后的大鼠PGC-1α和MEF2的表达显著增高并伴随慢肌纤维的表达增加[40]。因此,Glut4基因突变后机体可能通过PGC-1α与MEF2促进肌纤维的转化,增加脂质的有氧氧化过程,以此适应葡萄糖的摄取不足。
4 结论本研究通过CRISPR/Cas9技术获得单碱基突变的Glut4Q177L突变鼠,造成骨骼肌和脂肪组织的葡萄糖摄取障碍。研究发现,突变鼠通过增加皮下脂肪的分解以及慢肌纤维的生成,提高脂肪酸利用和氧化效率来适应葡萄糖供应不足。Glut4Q177L突变鼠作为骨骼肌和脂肪组织Glut4功能障碍的胰岛素抵抗模型,解析其适应胰岛素抵抗及促进脂质利用的潜在机制有助于为2型糖尿病的治疗提供参考。同时,突变鼠的脂肪含量减少与慢肌纤维增多符合畜牧生产实践中降低皮下脂肪含量和改善肉质的发展需求,因此本试验结果也为分子育种提供了新的思路。
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(编辑 郭云雁)