2. 生物饲料开发国家工程研究中心, 北京 100081
2. National Engineering Research Center of Biological Feed, Beijing 100081, China
益生菌是指能通过改变宿主某一部位菌群结构，调节肠道菌群平衡，发挥调节宿主黏膜与系统免疫功能，促进营养吸收，保持肠道健康，从而产生有利于宿主健康的活性微生物或组成明确的混合微生物制剂[1]。近年来，随着动物饲料中抗生素使用的限制，益生菌替代抗生素在维护动物健康中的应用日益广泛。凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)属革兰阳性厚壁菌门，兼性厌氧，能在低氧的肠道环境中正常生长，且具有较好的耐酸、耐胆盐和耐高温的抗逆性，满足了饲料生产过程中直接添加、高温制粒的加工需求[2-3]。同时，凝结芽孢杆菌代谢过程中产生的乳酸脱氢酶能够促进乳酸发酵产生L型乳酸，降低动物肠道pH[4]，抑制有害菌的生长，并能为丁酸产生菌、双歧杆菌等有益菌的生长提供能源物质，促进肠道微生态平衡，提高肠道免疫力[5-6]。有研究表明，饲粮中添加200 mg·kg－1的凝结芽孢杆菌显著增加了黄羽肉鸡全期(1~42 d)平均日增重和血清抗氧化能力[7]；Pu等[8]研究发现，饲粮中添加凝结芽孢杆菌可以提高断奶仔猪生产性能和肠道屏障功能完整性。凝结芽孢杆菌还可在盲肠定植，产生抗菌素、氨基酸、维生素和多种消化酶。由于具备上述优点，凝结芽孢杆菌作为饲用微生态制剂于2013年12月被农业农村部正式列入《饲料添加剂品种目录》，成为近年来我国养殖业关注的热点。目前，关于凝结芽孢杆菌在肉鸡上的研究主要集中在其对肉鸡养殖效果的影响上，对于凝结芽孢杆菌提高生产性能的益生机理及对胫骨指标影响的研究较少。基于此，本试验通过探究肉鸡饲粮中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡生产性能、血清营养物质代谢指标及胫骨发育的影响，推测凝结芽孢杆菌对肉鸡可能的益生机理，为凝结芽孢杆菌在肉鸡养殖中的广泛应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料本研究中所用的凝结芽孢杆菌制剂以粉末状的形式添加在饲料中，其活菌数≥ 1.5×109CFU·g-1。
1.2 试验设计选取180只1日龄体重无差异的健康AA肉仔公鸡，随机分为3个处理，分别为基础日粮对照组(CG)、抗生素对照组(AG)及凝结芽孢杆菌处理组(BC)，每个处理6个重复，每个重复10只鸡。对照组饲喂玉米-豆粕型基础日粮，抗生素组在基础日粮中添加5 mg·kg-1黄霉素、20 mg·kg-1吉他霉素和75 mg·kg-1金霉素，凝结芽孢杆菌处理组在基础饲粮中添加3.6×109 CFU·kg-1凝结芽孢杆菌。基础日粮配方参考(NY/T33—2004)《鸡饲养标准》设计，日粮配方及营养成分见表 1。试验分两个阶段进行，分别为前期(1~21日龄)和后期(22~42日龄)。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
本试验在中国农业科学院南口中试基地进行。采用全封闭式鸡舍，养鸡前做好鸡舍消毒工作。鸡舍光照、温度、相对湿度均按照《爱拔益加AA肉鸡养殖手册》进行。免疫按常规程序进行，自由饮水、自由采食，人工光照18 h，夜间定期关灯6 h，以满足动物福利的要求。
1.4 测定指标与方法1.4.1 生产性能 分别于肉鸡1、21和42日龄，以重复为单位称重(截料12 h、不停水)，统计饲料总采食量，计算肉鸡平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
1.4.2 血清生化指标及钙、磷含量 在肉鸡21和42日龄时，每个重复选取体重接近平均体重的1只鸡，采血10 mL，装入一次性含促凝与分离胶的真空采血管内，37 ℃静置1 h后，3 000 r·min－1离心10 min，收集血清。采用日立7600全自动生化仪测定血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、尿酸(UA)、血氨(BA)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量以及碱性磷酸酶(ALP)活性。采用原子吸收光谱法测定血清中钙(Ca)含量。采用钼酸铵-偏钒酸铵比色法测定血清中磷(P)含量。
1.4.3 胫骨强度 在肉鸡21和42日龄时，每个重复选取体重接近平均体重的1只鸡，剥离大腿肌肉，取左侧胫骨放入样品袋中低温冷冻保存，待试验结束后测定相关指标。去除掉胫骨附属的肌肉和筋腱组织后风干，自然风干后使用CMT4504型微机控制电子式万能试验机对左侧胫骨进行3点弯曲试验。将胫骨曲面水平放置在支架上，测定时参数设置为跨度40 mm，单位负荷50 kg，位移速度10 mm·min－1，加载至标本断裂，记录胫骨断裂强度。胫骨强度以牛顿(Kg)表示。
1.4.4 胫骨灰分及钙、磷浓度 取右侧胫骨用于测定胫骨灰分及钙、磷浓度，然后小心地把胫骨夹碎置于脂肪包中(无损失)，无水乙醇浸泡48 h，无水乙醚浸泡48 h脱脂，风干后，将胫骨无损地转移至提前称好重量的瓷坩埚内，在120 ℃烘箱中放置24 h烘干，取出冷却后测定胫骨无脂干重。将坩埚置于电炉上碳化完全后，转移至茂福炉中550 ℃灰化24 h，取出冷却后称量并记录灰分重，然后测定胫骨灰分中钙、磷含量。
1.5 试验数据统计分析用Excel软件整理数据，采用SPSS 21.0软件中的独立样本T检验进行数据分析。以P < 0.05作为差异显著的判断标准，P < 0.01作为差异极显著的判断标准，试验结果均表示为“平均值±标准差(Mean±SD)”。
2 结果 2.1 饲料中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响由表 2可知，饲粮中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡前期(1~21日龄)平均体重和平均日增重无显著影响(P>0.05)；与基础饲粮对照组相比，凝结芽孢杆菌组和抗生素组均显著降低了肉鸡日平均采食量(P < 0.05)。试验后期(22~42日龄)，抗生素组平均体重、平均日增重、平均日采食量均显著高于基础饲粮对照组和凝结芽孢杆菌处理组(P < 0.05)，基础饲粮对照组和凝结芽孢杆菌处理组之间平均体重、平均日增重及平均日采食量无显著差异(P>0.05)；相比于基础饲粮对照组和凝结芽孢杆菌处理组，抗生素组显著降低了肉鸡后期料重比(P < 0.05)。
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表 2 饲粮中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡生长性能的影响 Table 2 Effect of dietary of Bacillus Coagulans on the growth performance of broilers |
由表 3可知，21日龄时，与对照组相比，凝结芽孢杆菌处理组和抗生素组显著增加了肉鸡血清中总胆固醇和甘油三脂的含量(P < 0.05)，并显著提高了血清碱性磷酸酶的活性(P < 0.05)；饲粮中添加凝结芽孢杆菌和抗生素对肉鸡血清钙、磷含量均无显著影响(P>0.05)。42日龄时，凝结芽孢杆菌处理组血清中甘油三酯含量显著高于对照组(P < 0.05)；抗生素处理组总胆固醇含量和甘油三酯含量均显著低于凝结芽孢杆菌处理组(P < 0.05)，但与对照组无显著差异(P>0.05)；各处理组血清碱性磷酸酶活性和钙、磷含量无显著差异(P>0.05)。
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表 3 饲粮中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡血清脂类、钙、磷含量及碱性磷酸酶活性的影响 Table 3 Effect of dietary of Bacillus Coagulans on serum contents of lipid, calcium, phosphorus and alkaline phosphatase activity of broilers |
由表 4可知，21日龄时，饲粮中添加凝结芽孢杆菌增加了肉鸡血清中总蛋白、白蛋白及球蛋白的含量(P < 0.05)，并显著降低了血清中尿酸和血氨的含量(P < 0.05)；抗生素处理组对肉鸡血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白及尿酸含量无显著影响(P>0.05)，但降低了血清中血氨的含量(P < 0.05)。42日龄时，凝结芽孢杆菌组增加了肉鸡血清中总蛋白和球蛋白的含量，但差异不显著(P>0.05)，并有提高白蛋白含量的趋势(P=0.09)；饲粮中添加凝结芽孢杆菌降低了肉鸡42日龄血清血氨含量，但效果不如抗生素组显著(P < 0.05)。
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表 4 饲粮中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡血清蛋白及代谢指标的影响 Table 4 Effects of dietary Bacillus Coagulans on serum contents of protein and its metabolites of broilers |
由表 5可知，21日龄时，凝结芽孢杆菌处理组与对照组胫骨强度无显著差异(P>0.05)，但显著高于抗生素组(P < 0.05)；饲粮中添加凝结芽孢杆菌显著提高了肉鸡胫骨钙含量(P < 0.05)，但对胫骨灰分和磷含量无显著影响。42日龄时，凝结芽孢杆菌处理组肉鸡胫骨强度高于抗生素处理组，但差异不显著(P>0.05)；相对于对照组和抗生素处理组，凝结芽孢杆菌处理组显著提高了肉鸡胫骨钙含量(P < 0.05)，并极显著提高了胫骨磷含量(P < 0.01)；凝结芽孢杆菌和抗生素对肉鸡胫骨灰分均无显著影响(P>0.05)。
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表 5 饲粮中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡胫骨钙、磷含量及胫骨强度的影响 Table 5 Effects of dietary Bacillus Coagulans on the contents of calcium and tibia phosphorus and strength of broilers |
作为一种畜禽和水产饲料中常用的微生物制剂，凝结芽孢杆菌能够有效地改善宿主动物的生产性能，提高饲养经济效益[5, 8-9]。本试验表明，在不影响平均日增重的前提下，饲粮中添加凝结芽孢杆菌(3.6×109 CFU·kg-1)降低了肉鸡21日龄时的平均日采食量，提高了饲料转化效率，但其对生产性能的促进作用不如抗生素组(5 mg·kg-1黄霉素、20 mg·kg-1吉他霉素和75 mg·kg-1金霉素)，这与目前凝结芽孢杆菌的报道基本一致。孙焕林等[10]研究发现，在饲粮中添加1.5%的凝结芽孢杆菌制剂，可以明显提高黄羽肉鸡的生产性能。Bami等[11]报道凝结芽孢杆菌制剂(100 mg·kg－1)提高了肉鸡平均日增重、平均日采食量和饲料转化效率，并提高了42日龄时腿肌率。Lin等[12]发现，作为一种潜在的调节肉鸡肠道菌群结构的益生菌，饲粮中添加0.04%的凝结芽孢杆菌不仅提高了肉鸡后期(22~42日龄)的饲料转化效率，并且增加了肉鸡十二指肠和盲肠乳酸菌的含量。凝结芽孢杆菌对动物生产性能改善的机制可能是其在肠道内的定植改善了肠道微生态系统，促进了营养物质在动物肠道内的消化和吸收[13]。在益生菌改善肉鸡生产性能的实践中，益生菌稳定到达动物肠道并定植是益生菌发挥作用的关键。凝结芽孢杆菌由于同时具备产芽孢和产乳酸双重特点，能较好地耐受胃酸和胆盐等不利条件进入肠道定植[14]。凝结芽孢杆菌产生的乳酸不仅能够降低肠道pH，促进钙、磷转化及其他营养要素的消化吸收，同时，凝结芽孢杆菌产生的大量乳酸可为动物肠道内其他益生菌，如丁酸产生菌、双歧杆菌等的增殖提供营养要素[15]；另外，凝结芽孢杆菌产生的其他氨基酸、维生素及其他未知的益生因子在促进肠道营养物质消化吸收的同时，还能促进肠道发育，尤其是由动物肠道菌群产生的短链脂肪酸是肠道上皮组织合成的重要能量来源[16-17]。此外，凝结芽孢杆菌在动物肠道内能分泌多种宿主本身不能提供的酶，丰富宿主体内物质代谢途径，加快肠道营养物质，如多糖和蛋白的分解和吸收，为动物的生长发育提供有利条件[18]。
3.2 饲粮中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡血清生化指标的影响作为小肠消化和吸收功能发生变化的标志酶之一，碱性磷酸酶在宿主体内参与多种生理生化反应，不仅能水解磷酸盐和参与脂肪转化吸收，还能抵御病原菌脂多糖对肠道上皮组织的破坏作用，血清碱性磷酸酶水平可在一定程度上反映动物生长速度的快慢[7, 19]。本试验观察到凝结芽孢杆菌和抗生素均能提高肉鸡前期碱性磷酸酶活性，后期伴随着肉鸡生长发育的成熟，碱性磷酸酶活性下降至无显著差异水平，这与杨伟平等[20]的研究结果一致。甘油三酯是脂肪酸和甘油合成的前体物质，是动物体内储存能量的重要方式；胆固醇是动物体内肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质合成的重要原料，也是构成细胞膜的主要成分；血清中甘油三酯和总胆固醇水平在一定程度上反映了动物体内脂类代谢状况[21-22]。在肉鸡饲养周期内，机体处于快速生长阶段，血清中甘油三酯和总胆固醇生理水平上的升高有助于提高脂质在机体内的代谢循环。本研究中, 凝结芽孢杆菌和抗生素均增加了1~21日龄肉鸡血清中甘油三酯和总胆固醇的含量，这与郑爱娟和吴正可[23]报道益生菌促进肉鸡脂类代谢的结果一致。
血清总蛋白由白蛋白和球蛋白组成，白蛋白由肝合成，具有黏性和胶质性，在动物体内有着运输营养物质、维持渗透压平衡等重要功能[7]；当肝功能受损时，血清白蛋白比例下降，其下降程度与肝损失程度呈正相关[24]。球蛋白是机体重要的免疫蛋白，是动物机体体液免疫的重要组成部分。本研究中凝结芽孢杆菌提高了肉鸡前期血清白蛋白和球蛋白比例，效果优于抗生素处理组，这与前人报道凝结芽孢杆菌增加血清白蛋白和球蛋白比例的结果一致[25-26]。白蛋白含量的增加提高了营养物质在动物体内的运输效率，这可能是饲养前期凝结芽孢杆菌杆菌处理组肉鸡采食量降低而日增重不受影响的直接原因。此外，本研究还发现，凝结芽孢杆菌降低了肉鸡前期血清尿素氮和血氨含量，效果与抗生素组相当，但后期凝结芽孢杆菌效果不如抗生素处理组。尿素氮和血氨是动物机体内蛋白代谢的主要产物，是衡量蛋白利用率的主要指标之一。尿素氮和血氨含量的减少说明蛋白利用率提高，有助于氮沉积，高含量的氮和氨在动物体内亦会对动物健康产生不良影响[27]。凝结芽孢杆菌通过促进脂质和蛋白在肉鸡体内的代谢，提高了饲料转化效率，同时使鸡只处于健康生长的状态。
3.3 饲粮中添加凝结芽孢杆菌对肉鸡钙、磷代谢及胫骨发育的影响白羽肉鸡具有生长速度快、胸部和腿部肌肉饱满等特点，但过快的生长速度也给肉鸡骨骼系统的发育带来沉重负担[28]。钙、磷是影响肉鸡骨骼发育的重要因素，本研究发现，凝结芽孢杆菌对肉鸡血清中钙、磷含量无显著影响，但显著提高了胫骨中钙、磷比例，且胫骨强度要高于抗生素处理组。目前，关于凝结芽孢杆菌对肉鸡钙、磷代谢及胫骨发育的研究相对较少。肉鸡生长过程中，营养物质(钙和磷)和能量供应充足能促进骨骼系统发育[29]。并且大量试验表明，肉鸡饲粮中添加乳酸菌能够改善肠道形态和菌群结构，促进营养物质消化吸收[29-30]。因此，在饲粮钙、磷含量保持一致的情况下，凝结芽孢杆菌杆菌可能通过促进钙、磷在胫骨中的沉积提高胫骨强度。Charles等[31]认为，肠道微生物菌群结构可能与动物骨骼的形成和发育有关。童小乐[32]研究了健康肉鸡和胫骨发育不良肉鸡肠道菌群的变化，属水平上的分析表明，健康肉鸡肠道菌群优势菌群为乳酸菌属和巴氏杆菌属，胫骨发育不良肉鸡肠道优势菌群为拟杆菌属和疣微菌属。凝结芽孢杆菌或其他乳酸菌代谢产生的乳酸等小分子有机酸可以促进肠道对钙、锌等矿物元素的吸收[33-34]。李叶涵等[34]研究发现，凝结芽孢杆菌能通过调节钙、磷代谢缓解由维生素K3缺乏引起的肉鸡胫骨发育不良。维生素A、B、C、D、E和K都能参与钙的代谢，是骨形成的必需元素，添加益生菌可促进肠道微生物对此类维生素的合成与吸收[35]。由此可知，一方面，凝结芽孢杆菌可能通过其代谢过程中产生的乳酸及维生素K类物质促进肠道对钙、磷等矿物元素的吸收，同时，凝结芽孢杆菌的添加可能改变了肉鸡肠道菌群结构，调控骨形成的过程，促进了钙、磷在胫骨中的沉积。
3.4 抗生素和凝结芽孢杆菌对肉鸡作用机制及效果的比较本研究发现，凝结芽孢杆菌和抗生素均能在一定程度上改善肉鸡生长性能，并促进营养物质在肉鸡体内的代谢与周转。但总体来看，抗生素在促进动物生长方面的效果要优于凝结芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌的效果主要体现在肉鸡生长前期，而抗生素的促生长作用贯穿肉鸡整个生长周期，尤其是42日龄时抗生素组体重显著高于对照组和凝结芽孢杆菌组，这主要是由于抗生素和凝结芽孢杆菌作用机理的不同造成的。
虽然促生长类抗生素有多达几十年的应用史且已经被禁止添加在饲料中，但目前我们对抗生素促生长的具体机制依然不是很明确。传统的观点认为，促生长类抗生素的各种作用效果都是基于抗生素对肠道微生物的直接作用，但也有新的研究表明，促生长类抗生素对宿主的肠道免疫和炎症反应具有调控作用[36]。肉鸡肠道中寄居着大量微生物，抗生素的干预能够抑制有害菌的生长及其产生的毒素和次级代谢产物，减弱二者对肠道上皮细胞的刺激从而使肠壁变薄，改善肠道形态，促进营养物质的吸收；同时，抗生素还会对肠道内的正常微生物菌群结构造成一定的破坏，减少微生物对能量和养分的利用，通过节约营养消耗从而促进动物的生长[37-38]。另外一种新颖的观点认为，动物饲粮中的抗营养因子、致敏蛋白、重金属、氧化脂肪以及后肠道微生物紊乱逆行带来的细菌、毒素甚至是病毒等致病因子的普遍存在，导致小肠中的炎症反应总处于过度状态，这会极大影响营养物质的消化和吸收，抗生素通过抑制炎症反应的发生和调控肠道免疫状态，在营养层面上局部改善动物肠道形态，促进营养物质吸收利用，在代谢层面上减少炎症反应带来的生理消耗，减少分解代谢[39]。本试验的研究结果显示，尤其是后期抗生素组显著提高了肉鸡生长性能并提高了饲粮转化率，从侧面证明了抗生素通过节约营养消耗促进动物生长。
凝结芽孢杆菌的益生机理主要体现在其对肠道微生态环境的调控。在肉鸡的生命早期，其肠道微生物的组成极易受到宿主和环境因素的影响[40]。凝结芽孢杆菌由于具备兼性厌氧特性，能在低氧的肠道环境中正常生长，且具有较好的耐酸、耐胆盐和耐高温的抗逆性等特点，能够在肉鸡早期肠道中快速定植并促进肠道菌群的成熟。凝结芽孢杆菌在肉鸡肠道中的成功定植又能够促进乳酸发酵产生L型乳酸降低动物肠道pH[4]，抑制有害菌的生长，并能为丁酸产生菌、双歧杆菌等有益菌的生长提供能源物质，促进肠道微生态平衡，提高肠道免疫力。赵娜等[21]研究发现，在饲粮中添加凝结芽孢杆菌可降低有害菌的数量，通过改变肠道微生态体系来改善肠道消化吸收功能。而随着肉鸡日龄的增加，肉鸡肠道菌群趋于平衡，凝结芽孢杆菌对生长代谢的促进作用减弱，这可能是本试验中凝结芽孢杆菌对肉鸡生长后期(22~42日龄)生产性能效果不显著的直接原因。肉鸡生长后期使用凝结芽孢杆菌虽然对生长性能无显著作用，但显著提高了肉鸡后期胫骨中钙和磷的含量，这对于当前肉鸡在品种选育过程中，因过分注重肉鸡肌肉生长速度而导致其骨骼发育相对滞后，胫骨强度降低的问题有着积极的意义。
4 结论肉鸡饲粮中添加凝结芽孢杆菌(3.6×109 CFU·kg-1)可在不影响1~21日龄肉鸡体增重的前提下，降低平均日采食量，提高饲料转化效率，促进脂类和蛋白质在肉鸡体内的代谢与周转，降低血清尿素氮和血氨含量，并促进钙、磷在胫骨中的沉积。凝结芽孢杆菌对22~42日龄肉鸡生长性能无显著作用，但显著提高了42日龄肉鸡胫骨钙和磷的含量，并提高了血清中总蛋白、白蛋白和球蛋白的水平，对肉鸡的健康生长有积极地意义，将会成为抗生素替代方案的必备要素。
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